Visualisering Protein-DNA Interaktioner Live bakterieceller Brug Fotoaktiveret Single-molekyle Tracking

Summary

Fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) kombineret med enkelt-molekyle sporing giver mulighed for direkte observation og kvantificering af protein-DNA-interaktioner i levende Escherichia coli-celler.

Abstract

Protein-DNA interaktioner er kernen i mange fundamentale cellulære processer. For eksempel er DNA-replikation, transskription, genopretning og kromosom organisation styret af DNA-bindende proteiner, som genkender specifikke DNA-strukturer eller sekvenser. In vitro eksperimenter har været med til at generere detaljerede modeller for funktionen af mange typer af DNA-bindende proteiner, og alligevel De nøjagtige mekanismer af disse processer og deres organisation i det komplekse miljø af den levende celle forbliver langt mindre forstået. Vi har for nylig indført en metode til at kvantificere DNA-reparation aktiviteter i levende Escherichia coli-celler ved hjælp Fotoaktiveret Lokalisering Microscopy (PALM) kombineret med enkelt-molekyle tracking. Vores generelle fremgangsmåde identificerer individuelle DNA-bindende begivenheder ved ændringen i mobilitet et enkelt protein ved associering med kromosomet. Fraktionen af ​​bundne molekyler giver en direkte kvantitativ måling for proteinet handlingivity og overflod af substrater eller bindingssteder på enkelt-celle niveau. Her beskriver vi begrebet metoden og demonstrere prøveforberedelse, dataopsamling, og de procedurer, dataanalyse.

Introduction

Denne protokol beskriver direkte måling af protein-DNA-interaktioner i levende Escherichia coli-celler. Teknikken udnytter ændringen i diffusionskoefficienten af et enkelt fluorescensmærket protein som binder kromosomet (figur 1). For at demonstrere den metode, vi anvender DNA-polymerase I (Pol1), en prototypisk DNA-bindende protein, der udfylder DNA huller i tilbagestående streng replikation og excision reparation veje ^1.

Fremkomsten af ​​super-opløsning fluorescensmikroskopi muliggør visualisering af molekylære strukturer i celler med nanometer opløsning. Fotoaktiveret Lokalisering Microscopy (PALM) beskæftiger fluorescerende proteiner, som kan aktiveres fra en indledende mørk tilstand til en fluorescerende tilstand (figur 2). Kun en delmængde af alle mærkede molekyler aktiveres til enhver tid at bestemme deres positioner på en sekventiel måde, uafhængigt af than samlede koncentration af mærkede molekyler i prøven ^2. Lokaliseringen præcision pr molekyle afhænger primært af størrelsen af den fluorescerende punktspredningsfunktion (PSF), antallet af indsamlede fotoner, og baggrunden signal ^3. Mange anvendelser af denne fremgangsmåde fokuserer på forbedret visualisering af cellulære strukturer. Erkendelsen af, at PALM kan kombineres med enkelt-molekyle sporing ⁴ åbnet nye veje til direkte følge bevægelsen af vilkårlige antal mærkede proteiner i levende celler. Øget følsomhed og tidslig opløsning af fluorescens mikroskoper nu tillade sporing af enlige spredende fluorescerende proteiner i bakteriens cytoplasma ^5..

Her beskæftiger vi PAmCherry, et konstrueret fluorescerende protein, der uigenkaldeligt konverterer fra en indledende fluorescerende tilstand til en fluorescerende tilstand ved bestråling med 405 nm lys ^6. Aktiverede PAmCherry fluoroforer kan billedetd ved excitation ved 561 nm og følges i flere frames indtil fotoblegning. Vi demonstrerer evne metode til at identificere forbigående DNA-bindende begivenheder enkelt proteiner ved hjælp af en fusion af Pol1 og PAmCherry. Behandling af celler med methylmethansulfonat (MMS) forårsager DNA methylering skader, der er slået ind gapped DNA substrater ved basen-excision reparation enzymer. Vores metode viser tydelig binding af enkelte Pol1 molekyler som reaktion på MMS skade ^7..

Protocol

1.. Celledyrkning

Brug sterile kultur rør og pipettespidser. E. coli stamme AB1157 pola-PAmCherry bærer en C-terminal PAmCherry fusion af Pol1. Fusionsproteinet blev indsat i den native kromosomale placering ved at erstatte vildtypegenet anvendelse af lambda-Rød rekombination som beskrevet i Datsenko et al. ⁸ Funktionalitet af fusionsproteinet blev bekræftet som bedømt ved cellulære vækstrater og følsomhed over for DNA-ødelæggende middel methyl methanesulfonate (MMS). Yderligere information om konstruktion af cellestamme kan findes i Uphoff et al. ⁷ Datsenko et al. ^8, og Reyes-Lamothe et al. ⁹ Cellekulturer dyrkes i M9-minimalmedium at reducere autofluorescens og undgå baggrund partikler på objektglasset. Alternativt kan en næringsrig veldefineret medium ^10.

1. Streak E. coli-stamme AB1157 pola-PAmCherry fra en frossen glycerol bestand på en Luria Broth (LB) agarose plade med selektive antibiotika (her, 25 ug / ml kanamycin) og inkuberes ved 37 ° C natten over.
2. At inokulere en 5 ml LB-kultur fra en enkelt celle koloni og vokse ved 37 ° C under omrystning ved 220 rpm i 3 timer.
3. Fortyndet kultur 1:10.000 i 5 ml minimalt medium (M9-medium, MEM aminosyrer + prolin, MEM-vitaminer, 0,2% glycerol) og inkuberes ved 37 ° C under omrystning ved 220 rpm natten over.
4. Den følgende morgen, måle den optiske densitet (OD) ved hjælp af et spektrofotometer og fortynd kulturen i 5 ml frisk minimalt medium til OD 0,025. Vokse i 2 timer ved 37 ° C under omrystning ved 220 rpm til tidlig eksponentiel fase (OD 0.1).
5. Koncentrer 1 ml af celler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved centrifugering ved 2.300 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 20 pi resterende medium og vortex.

2. Microscope Slide preparation

1. Forbered en 1,5% lav fluorescens agaroseopløsning i dH ₂ O. Brug en mikrobølgeovn for at smelte agarosen, indtil opløsningen er klar. Bland 500 ul af smeltet agarose opløsning med 500 pi 2x minimalmedium ved forsigtigt at pipettere op og ned nogle få gange.
2. Spred agaroseopløsningen jævnt på midten af ​​et mikroskop dækglas (No 1.5 tykkelse). Dette skal ske hurtigt inden agarose køler undgå bobler.
3. Flatten puden med en anden dækglas (No 1.5 tykkelse). For at fjerne baggrund fluorescerende partikler blev dækglas tidligere brændt i en ovn ved 500 ° C i 1 time. Forbrændt dækglas kan opbevares i flere uger ved stuetemperatur dækket med aluminiumfolie.
4. Til DNA-skader eksperimenter, forberede en agarose pude indeholdende 100 mM MMS. Følg proceduren i trin 2.1-2.3, men tilføjer 8.3 pi MMS til 500 pi af M9-medium før blanding med 500 ul smeltet 1,5% agarose, til en slutkoncentration på 100 mM MMS. (OBS! MMS er giftigt og mutagent og skal håndteres med handsker, maske, beskyttelsesbriller og kittel).
5. Fjern det øverste dias fra puden og tilsæt 1 ml af koncentreret cellesuspension på puden. Immobilisere cellerne ved at dække puden med en ubrugt brændt dækglas (Ingen 1.5 tykkelse, der matcher mikroskop objektiv specifikation), og ved at trykke meget forsigtigt på diaset. Cellerne skal afbildes indenfor 45 min af immobilisering før agarose pad tørrer. For at forhindre udtørring under længere eksperimenter kan agarose puder tætnes med silicium pakninger.
6. For DNA-skader eksperimenter, inkuberes celler immobiliseret på agarose pude indeholdende 100 mM MMS i 20 minutter i en fugtig beholder ved stuetemperatur før billeddannelse.

3. Forberedelse Microscopy Data Acquisition

PALM afhængig af detektering og præcis lokalisering af enkelte fluorescerende proteiner. Følsomheden og optimal tilpasning afmikroskopet er afgørende for datakvaliteten. Single-molekyle fluorescens mikroskoper typisk beskæftiger total indre refleksion (TIR) ​​belysning til at forbedre signal-støj-forholdet ved spændende kun fluorophores inden for en tynd sektion over dækglasset overflade. Her billedbehandling inde E. coli kræver stærkt skrå belysning ^11, der kan opnås på en TIRF mikroskop af svagt faldende vinkel excitationslys. PAmCherry imaging yderligere kræver en 405 nm fotoaktivering laser og en 561 nm excitation laser. Fluorescensemissionen er optaget på en elektron multiplicere CCD (EMCCD) kamera ved en forstørrelse resulterer i en pixel længde på 114,5 nm / pixel. For optimal lokalisering præcision, bør pixelstørrelsen omtrent svarer til standardafvigelsen bredde PSF at sikre tilstrækkelig sampling uden at sprede signalet over for mange pixel. Figur 3 viser en skematisk afbildning af en minimal PALM setup. Movie 1giver et indtryk af den skræddersyede mikroskop byggeprocessen, se Uphoff m.fl. ⁷ for en detaljeret beskrivelse af instrumentet..

1. Udførelse af rutinemæssig mikroskop tilpasning. Mål 405 nm og 561 nm kontinuert bølge laser intensiteter foran mål. Juster 561 nm intensitet til 3,5 mW (~ 400 W / cm ²⁾ og 405 nm intensitet til 10 pW (~ 1 W / cm ^2). Brug en trinløs neutralfiltre hjul, der giver mulighed for en gradvis justering af 405 nm intensitet 0-10 uW. Sluk laserbelysning indtil starten af ​​forsøget.
2. Anbring prøven på mikroskopbordet og bringe cellerne i fokus i transmitteret lysmikroskopi (figur 4A). EMCCD kamera gevinst skal være slukket for at undgå at beskadige kameraet ved overeksponering.
3. Definer en beskåret FOV at reducere data størrelse og øge kamera udlæsning hastighed.
4. Dæk prøven fra det omgivende lys og Schweiz,lm på EMCCD kamera gevinst.
5. Indstil frame rate til 15,26 msek / stel (herunder 0,26 msek kamera udlæsning tid). Se "eksponeringstid og excitation intensiteter" i diskussionen afsnit.
6. Vise kameraets data for at kontrollere den mørke baggrund signal (figur 4B).
7. Tænd for 561 nm laser og kontrollere excitation baggrund signal (figur 4C).
8. Tænd for 405 nm laser til fotoaktivering af Pol1-PAmCherry fusionsproteiner og øge intensiteten indtil fluorescens vævede vises.
9. Juster vinkel exciteringsstrålen at belyse kun en tynd del af prøven tæt på dækglasset overflade.
   1. Til dette formål er laserstrålen fokuseres i bagsiden brændplan en 100X NA 1.4 mål (figur 3). Omsætning fokuseringslinsen vinkelret på strålen flytter fokus væk fra centrum af målet forårsager at strålen afslutte mål i en vinkel.
   2. Aim for at maksimere fluorescensintensiteten og minimere baggrund signal. Bemærk, at en streng TIR excitation er optimal til billede fluoroforer inden for 100 nm af dækglasset overflade, men billedbehandling DNA-bindende proteiner, der er forbundet med E. coli nucleoid kræver dybere belysning op til 0,8 um.

4.. Data Acquisition

Her beskriver vi den almindelige protokol for erhvervelse af en PALM film. Den samme procedure gælder for billeddannelse Pol1-PAmCherry fusionsproteiner i ubeskadiget E. coli-celler, og under konstant DNA-skader behandling med MMS. Anvendelse af metoden til fusionsproteiner med forskellig molekylvægt eller antal kopier per celle vil kræve forskellige indstillinger erhvervelse (se Diskussion afsnit).

1. Find en ny synsfelt (FOV) af celler i transmitteret lys mikroskopi tilstand og fokusere billedet. Tag et kamera snapshot til at optage cellens konturer (Figur 4A).
2. Dæk prøven fra det omgivende lys og tænde EMCCD kamera gevinst.
3. Tænd for 561 nm laser og blege cellulære autofluorescens og baggrund pletter på dækglasset i et par sekunder, før du starter dataopsamling. For celler dyrket og filmede i M9 medium og bruge brændte dækglas er der som regel meget lidt fluorescens baggrund, men prebleaching kan være nyttige til billeddannelse celler i et rigt vækstmedium såsom LB. Bemærk, at intens belysning er giftigt for celler, så prebleaching bør holdes på et minimum.
4. Start erhvervelse af en PALM film under kontinuerlig 561 nm excitation ved 15,26 msek / ramme.
5. Tænd for 405 nm laser og gradvist øge intensiteten i løbet af filmen og nåede op på 1 W / cm ^2. Undgå højere 405 nm intensiteter, der forårsager cellulær autofluorescens. Vær opmærksom på tætheden af ​​fluorescerende molekyler - er det vigtigt at holde aktiveringsfrekvenser lave sådan at vævede klartisoleres i hver ramme (figur 4D-F).
6. Optag 10.000 billeder / film (afhængigt af antallet af molekyler, der skal afbildes per celle), en film tager typisk 2-3 min og kræver 0,5-1 GB plads på harddisken, afhængigt af størrelsen af ​​FOV.
7. Gentag proceduren erhvervelse for multiple FOV. Bemærk, at hver FOV kun kan afbildes én gang, fordi PAmCherry fluoroforer får fotoaktiveret og bleget irreversibelt.

5.. Dataanalyse

En automatiseret og robust dataanalyse rammer er afgørende for ydeevne og effektivitet af metoden. Vi bruger brugerdefinerede software skrevet i Matlab.

1. Udfør lokalisering analyse ved hjælp af algoritmer, der er beskrevet i Crocker et al. ^12. Holden et al. ^13. HoldenI et al. ¹⁴ og Wieser et al. ¹⁵ vævede først identificeret i en båndpasfiltrerede billede ved hjælp af en Gaussisk kerne med 7 pixels diameter (figur 5A). Ansøgerlandene positioner svarer til vævede polyesterfibre med peak pixel intensiteter over 4,5 gange standardafvigelsen af baggrunden signal (figur 5B). Den lokalt lyseste pixel per kandidat PSF fungerer som indledende gæt for montering af en elliptisk Gaussisk funktion (figur 5C). De frie fit parametre er: x-position, y-position, x-bredde, y-bredde, rotation vinkel, amplitude og baggrund offset. Den elliptiske Gauss maske tegner sig for molekyle i den eksponeringstid, der slører og deformerer PSF.
2. Plot de resulterende (x, y) lokaliseringer fra alle rammer PALM film onto transmitteret lysmikroskopi billede af samme FOV. Lokalisering af Pol1-PAmCherry skal vises i det centrale område af E. coli-celler (fig. 6A). Hvis mange lokaliseringer vises uden for cellerne, blev tærsklen lokalisering indstillet for lavt eller prøven indeholdt baggrundsfluorescenssignal partikler.
3. For automatiseret sporing analyse, MATLAB implementeringen af algoritmen beskrevet i Crocker et al. ¹² kan anvendes (se "Diffusion analyse" i diskussionen afsnit). Positioner, der vises i de efterfølgende rammer inden for en brugerdefineret sporing vindue er forbundet for at danne en bane. I tilfælde af at flere lokaliseringer forekomme i det samme vindue, er spor entydigt tildelt ved at minimere summen af ​​skridtlængder. For en detaljeret diskussion af de forskellige overvejelser, når beregning diffusionskoefficienter fra single-partikel sporing data se Wieser et al. ^15.
   1. Algoritmen bruger en hukommelse parameter til at redegøre for forbigående blinkende eller ubesvarede lokaliseringer i et spor. Her har vi sat hukommelse parameter til 1 ramme, højere værdier kan bruges til sporing fluorophores med langlivede mørke stater.
   2. Vælg en passende sporing vindue baseret på følgende kalibrerings trin. For Pol1 bruger vi 0,57 um (5 pixels).
   3. Kør sporingsalgoritmen for en række sporing vindue parametre. Beregn antallet af målte spor pr celle som en funktion af sporing vinduet for at identificere den mindste mulige tracking vindue, der ikke delt spor (figur 6b).
   4. Plot de resulterende spor på transmitteret lys mikroskopi billede af samme FOV at visualisere den rumlige fordeling af molekyle bevægelse i cellerne. Pol1 spor skal vise diffusion begrænset inden enkelte celler (figur 6C-D).
   5. Hvis en brøkdel af numre vises at krydse mellem celler antyder dette, at separate molekyler fejlagtigt blev forbundet, fordi tracking vinduet blev valgt for stor-og / eller fotoaktiveringsprogrammet var for høj (figur 6E).
   6. Plot den kumulative fordeling af trin længder mellem på hinanden følgende lokaliseringer (Figur 6F). Kurven stiger og mætter glat for tilstrækkeligt store sporing vinduermen viser en cutoff kant, hvis vinduet blev valgt for lille.
4. At analysere diffusion karakteristika Pol1, beregne den gennemsnitlige-squared forskydning (MSD) mellem på hinanden følgende lokaliseringer for hvert spor med i alt N trin):
   MSD = 1 / (N-1) Σ _{i = 1} ^N-1 _{(Xi +1} - x _i) ² + (y _{i 1} - y _i) ^2.
   Medtag kun spor med mindst 4 trin (N ≥ 5 lokaliseringer) for at reducere den statistiske usikkerhed i MSD værdier.
5. Tegn en kurve for MSD værdier over en række lag gange ved at beregne forskydninger over flere frames (Figur 6G). Formen på MSD-kurven kan bidrage til at klassificere den observerede molekylær bevægelse (figur 6H).
6. Beregn den tilsyneladende diffusionskoefficient D * pr spor fra MSD:
   D * = MSD / (4 Δt) - σ _loc ² / Δt.
   Den anden term korrigerer for den anslåede lokalisering fejl (her, σ _loc = 40 nm og AT = 15,26 msek se Wieser et al. ^15).
7. Plot et histogram af de målte D * værdier fra alle spor i FOV (fig. 7A).
8. Identificere individuelle Pol1 molekyler, der vises bundet til kromosomet baseret på den målte D * værdi pr spor. Adskil populationer af bundet (skarp fordeling centreret på D * ~ 0 mM ² / sek) og frit spredende molekyler (bred fordeling centreret ved D * ~ 0,9 mM ² / sek) ved at sætte en tærskel D * <0,15 mM ² / sek ( røde bjælker i 7A og 7D).
9. Udføre lokalisering, sporing og diffusion analyse for Pol1 i ubeskadigede celler (figur 7A-C) og i celler under DNA-skader behandling med MMS (figur 7D-E). Fraktionen af ​​bundne spor giver en direkte kvantitativ måling af DNEn reparation aktivitet Pol1 in vivo.

Representative Results

Begrebet fotoaktiveret enkelt molekyle sporing at studere protein-DNA-interaktioner in vivo er vist i figur 1. PAmCherry fusionsproteiner opdages i levende E. coli-celler på en sekventiel måde ved fotoaktiverende enkelte molekyler stokastisk med 405 nm lys med en frekvens på mindre end ét molekyle per celle ad gangen. Aktiverede molekyler afbildes under vedvarende 561 nm excitation. Molekylær bevægelse i cellen kan spores ved at forbinde nærliggende lokaliseringer i en serie af rammer, indtil irreversibel fotoblegning. Da udbredelsen af ​​DNA-bindende proteiner er bremset ved binding kromosomet den tilsyneladende diffusionskoefficient D * opnået pr spor direkte rapporter om individuelle protein-DNA-interaktioner.

Figur 2 viser fotoaktivering af Pol1-PAmCherry fusionsproteiner i levende E. coli-celler. Indflydelsen fra 405 nm intensitet on tætheden af fluorescerende molekyler kan ses i figur 4. Bemærk, at tætheden ikke alene bestemt af 405 nm intensitet, men derudover med antallet af molekyler, der er til rådighed for aktivering, puljen af ​​de resterende molekyler udtømt i løbet af en PALM film.

Lokalisering analyse udføres for hver ramme af en PALM film som vist i figur 5.. Vi målte lokalisering præcision ved hjælp af immobile molekyler i faste celler eller bundne molekyler i levende celler. Købet indstillinger gav en lokalisering præcision σ _loc = 40 nm, efter aftale med den teoretiske forudsigelse ^3..

De resulterende Pol1 lokaliseringer besætte det centrale område af cellen (figur 6A), i store træk den gentog den rumlige organisering af E. coli nucleoid ^7. Hovedparten af ​​Pol1 spor i ubeskadigede celler vise diffusion som vist i figur 6C. En typisk celle indeholder flere hundrede Pol1 spor (6D), i overensstemmelse med kopi antallet af cirka 400 Pol1 molekyler pr E. coli. celle ¹ 6B og 6E-F giver vejledning om at vælge en passende sporing vindue parameter - hvis sporing vinduet er for stor, er mere tilbøjelige til at blive fejlagtigt forbundet til et spor forskellige molekyler, hvis sporing vinduet er for lille, spor med længere skridt vil blive delt. MSD kurven for Pol1 stiger lineært for korte lag gange og mætter på længere forsinkelse gange grundet celle indespærring (figur 6G). Forskellige typer af molekylær bevægelse kan identificeres ved MSD-analyse. Rettet bevægelse giver en parabolsk kurve, Brownsk bevægelse er kendetegnet ved en lige linje, den begrænset diffusion kurve når et plateau, en forskydning af MSD kurven for immobile partikler repræsenterer localization usikkerhed (figur 6H). Yderligere oplysninger om enkelt-partikel sporing og tip til fejlfinding kan findes i Arnauld et al. ^16.

Vi har tidligere anvendt metode til at måle DNA-reparation aktivitet Pol1 reaktion på exogent DNA alkylering skade ^7. D * histogram Pol1 spor i ubeskadigede celler viser en dominerende befolkning diffundere molekyler (figur 7A-C). En lille brøkdel på 2,7% bundet Pol1 molekyler sandsynligvis involveret i tilbagestående streng replikation og reparation af endogent DNA-skader. Under kontinuerlig 100 mM MMS skade befolkningen i spor med D * ~ 0 um ² / sek stiger til 13,8% (figur 7D). Disse spor repræsenterer individuelle Pol1 molekyler udfører DNA-reparation syntese til at fylde en enkelt nukleotid huller som en del af base-excision reparation vej. Positionerne af bundne numre viser placeringen af ​​de enkelteDNA-skader og reparation sites (Figur 7E-F).

Figur 1. Grafisk repræsentation af fremgangsmåden. (A) fluorescerende protein PAmCherry kan fotoaktiveres fra en oprindelig ikke-fluorescerende tilstand ved bestråling med 405 nm lys. Den lyse tilstand er begejstret ved 561 nm og udsender fluorescens omkring 600 nm indtil fluoroforen blegemidler irreversibelt. (B) Styring af fotoaktiveringsprogrammet procentsats giver billeddannelse kun en enkelt stokastisk aktiveret PAmCherry fusionsprotein per celle til enhver tid, mens vilkårligt stor pulje af molekyler, som endnu ikke er blevet aktiveret, eller som allerede er blevet bleget rester i en mørk tilstand. (C) at position fluorescerende molekyle bestemmes ud fra centrum af det isolerede PSF og tracked for flere rammer indtil fotoblegning. (D) Spor af mange molekyler er optaget på en sekventiel måde. (EF) Interaktionen af et DNA-bindende protein med en kromosomal målsekvens eller struktur stopper den tilfældige diffusiv bevægelse. Bundne og ubundne molekyler er kendetegnet ved den tilsyneladende diffusionskoefficient D * udvundet fra enkelte spor. Den resulterende fraktion af bundne molekyler giver et kvantitativt mål for aktiviteten af et DNA-bindende protein in vivo. Klik her for at se større billede.

Figur 2. Fotoaktivering af Pol1-PAmCherry i levende E. coli-celler. Skalapanelerne: 1 um. Skema er vist under hvert panel. ( A) Transmitteret lys mikroskopi billede af celler er immobiliseret på en agarose-pad. (B) Phototactivating en enkelt PAmCherry fluorofor i en celle. (C) En højere fotoaktivering hastighed øger antallet af fluorescerende molekyler. (D) Integreret PAmCherry fluorescens fra en PALM film. Klik her for at se større billede.

Figur 3. Skematisk af en minimal PALM setup for fotoaktiverende og billedbehandling PAmCherry fusionsproteiner D1:. Dichroic spejl (fx 550 nm lang-pass). D2: Dichroic mirror (fx 570 nm lang-pass). L1: Kollimatorlinse. L2: TIR linse. L3: Tube linse.1177/51177fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 4.. Repræsentative billeder fra en PALM film med 15,26 msek / ramme skalapanelerne:. 1 um. (A) Transmitteret lys billede af celler er immobiliseret på en agarose-pad. (B) Mørk baggrundsbillede målt på EMCCD kamera med lasere slukket. (C) Magnetiseringssystem baggrundsbillede under konstant 561 nm excitation før fotoaktivering. (DF) Øget 405 nm intensitet fører til højere fotoaktiveringsanordningerne satser PAmCherry, filmede under konstant 561 nm excitation. Er vist de boxed områder forstørret nedenfor. (D) Lav 405 nm intensitet (<1 pW) aktive meget få fluorescerende molekyler pr FOV. (E) Medium 405nm intensitet (~ 2 uW) fotoaktiveringsanordningerne resulterer i en god PSF tæthed til lokalisering og sporing analyse. (F) Højere 405 nm intensitet (~ 10 pW) aktiverer mere end et fluorescerende molekyle i nogle celler, som skjuler lokalisering og sporing analyse. Klik her for at se større billede.

Figur 5. Illustration af lokalisering analyse. Skalapanelerne: 1 m (A) båndpasfiltrering fjerner falsk pixel støj og flader intensitet gradienter på tværs af FOV.. (B) Ansøgerlandene vævede identificeres i den filtrerede billede baseret på en brugerdefineret tærskel, der er valgt for at minimere falsk positive og falsk negative opdagelser. Den threshold svarer til den minimale intensitet kandidat pixel divideret med baggrunden standardafvigelse (signal-til-støj-forhold, SNR). (C) Den lokalt lyseste pixel, der passerer grænsen tjener som første lokalisering gæt (orange kryds) for en todimensional elliptisk gaussisk pasform. Skalapanelerne: 0,5 mM. Den resulterende super-opløsning lokalisering (blå kors) har en gennemsnitlig præcision σ _loc = 40 nm. Klik her for at se større billede.

.. Figur 6. Illustration af tracking analyse skalapanelerne: 1 mM. (A) alle registrerede lokaliseringer af Pol1-PAmCherry i et eksempel celle. (B) Antal spor registrerered i eksemplet celle som en funktion af sporing vinduet. Små sporing vinduer opdelt molekyle baner, hvilket fører til kunstig høje antal spor. Den stiplede linje angiver vores valg for tracking vindue parameter (0,57 um, 5 pixels) - dette giver et godt kompromis mellem at afsløre den fulde distribution af trin og holde baner forskellige molekyler intakt. (C) Eksempel styr på en enkelt Pol1-PAmCherry molekyle. (D) Alle målte spor vist i tilfældige farver. (E) Tracking artefakter hvis sporing vinduet er valgt for stor (her 0,8 um, 7 pixel) eller tætheden af vævede per frame er for høj. (F) Akkumuleret fordelinger af trinet længder til sporing vinduer: 0,34 um (3 pixels, rød linje), 0,57 m (5 pixels, blå linje) og 0,80 m (7 pixels, grøn linje). Bemærk, at 0,34 um sporing vindue afskærer trin længere end 0,34 um, som klartafkorter fuld fordeling af trin. Den 0,57 um sporing vindue registrerer næsten den samme fordeling af trin, som gør det 0,80 um sporing vindue. (G) MSD kurve viser begrænset diffusion af Pol1. (H) Skematisk MSD kurver for rettet bevægelse, Brownsk bevægelse, begrænset diffusion, og immobile partikler. Klik her for at se større billede.

Figur 7. Direkte måling af DNA-reparation aktivitet Pol1 i levende E. coli. celler skalapanelerne: 1 mM. (A) Histogram af den tilsyneladende diffusionskoefficient D * for alle spor af 4 eller flere trin i en synsfelt på ubeskadigede celler (N = 4.162 spor). Bestanden af ​​molekyler, der er klassificeret som B ound er fremhævet med rødt. (BC) Spor af Pol1-PAmCherry vises på en transmitteret lys mikroskopi billede. Spor, der er klassificeret som bundet i overensstemmelse med deres diffusionskoefficient er vist i rødt. (D) D * histogram for Pol1 spor målt i celler immobiliseret på en agarose pad med 100 mM MMS og inkuberet i 20 min før imaging (N = 2.128 spor). Befolkningen af ​​bundne molekyler involveret i DNA-reparation er vist med rødt. (EF) Pol1-PAmCherry spor på transmitteret lys mikroskopi billede der viser sporene af enlige Pol1 DNA reparation begivenheder i rødt. Klik her for at se større billede.

Movie 1. Opbygning af en skræddersyet PALM setup.JoVE_Uphoff_Movie1.avi "target =" _blank "> Klik her for at se video.

Discussion

Vi diskuterer en række centrale overvejelser for succes i forsøget.

Valg og ekspression af fluorescerende fusionsprotein: Der er en stor palet af fotoaktiverbare og photoswitchable fluorescerende proteiner ^17. Det specifikke valg afhænger af mikroskopets egenskaber, især lasere og filtre til rådighed. Kombinationen af ​​405 nm og 561 nm er ideel til almindelige fotoaktiverbare fluorescerende proteiner. Vi valgte PAmCherry ^6, fordi det er monomert og viste ingen aggregering i celler. Endvidere irreversibel fotoaktivering muliggør tælling af antallet af aktiverede fluoroforer at måle protein kopiantal pr celle. I stedet for at udtrykke fusionsproteinet fra et plasmid, foretrækker vi kromosomale indsættelse af genet, som koder for fusionsproteinet på vildtype-locuset. Dette sikrer fuldstændig udskiftning af proteinet af interesse med fluorescerende version og opretholdelse ekspressionsniveauet vildtype.

Fotoaktivering rate: Det er vigtigt at justere fotoaktiveringsprogrammet sådan hastighed, at mindre end et molekyle per celle i gennemsnit er i den fluorescerende tilstand i en ramme af filmen. Dette afhænger af 405 nm intensitet og antallet af molekyler tilbage at blive aktiveret. Ved meget lave billedbehandling tætheder dog ikke alle molekyler vil blive afbildet inden udgangen af ​​filmen eller meget lange film skal erhverves. Antallet af billeder, der optages pr film afhænger af kopi antallet af fusionsproteiner per celle, og den gennemsnitlige fotoblegning levetid PAmCherry ved excitation betingelser. Kopien Antallet af Pol1 er ~ 400 molekyler / celle ¹ og middelværdien af den eksponentielle fotoblegning levetid fordeling var ~ 4 frames. Ved at øge 405 nm intensitet gradvist, er aktiveringen jævnt fordelt over de 10.000 frames af filmen. Derfor har hver celle er occupIED af fluorescerende molekyler for i alt ~ 1.600 frames, sikrer lille overlapning af vævede og sporing komplikationer i en film på 10.000 frames.

Eksponeringstid og excitation intensiteter: Fremmest eksponeringstider skal være tilstrækkelig kort til at observere skarpe vævede med lidt bevægelse sløring. Imidlertid bør frame rate vælges til opnåelse af observerbare molekylær bevægelse mellem successive rammer uden lokalisering usikkerhed ellers vigtige fotoner brændt ved oversampling sporet. Bevægelsen af ​​ubundne molekyler skal tages prøver fra tilstrækkelig lang tidsintervaller at være klart adskiller sig fra den tilsyneladende bevægelse af bundne molekyler på grund af lokalisering usikkerhed. Når eksponeringen er indstillet, skal PSF intensitet justeres. Lokaliseringen præcision af PSF stiger med antallet af fotoner detekteret i løbet af varigheden af ​​en ramme. Højere excitation intensiteter øge photon emission rate but også fotoblegning sats og baggrundssignal. Anvend det lavest excitationsintensitet, der giver den ønskede lokalisering præcision. For Pol1-PAmCherry valgte vi 15,26 msek / ramme og 3,5 mW 561 nm excitation (400 W / cm ^2). Det er vigtigt at bekræfte cellelevedygtighed for de særlige imaging betingelser ved at overvåge cellevækst og morfologi før og efter dataopsamling (se supplerende information i Uphoff et al. ^7).

Pol1 udviser en bindende tid på ~ 2 sek til en gapped DNA substrat in vivo ^7, og vi forventer derfor, at størstedelen af molekyler til at være enten i bunden eller ubunden tilstand for hele varigheden af et spor. Bundne molekyler forekommer væsentlige ubevægelig fordi kromosom sites har en diffusionskoefficient flere størrelsesordener lavere (~ 10 ^-5 mM ² / sek, Elmore et al. ¹⁸⁾ end Pol1 diffusion i cytoplasmaet (~ 1 mM ²

Diffusion analyse: Den tilsyneladende diffusionskoefficient D * beregnes ud fra MSD af enkelte numre, i gennemsnit over et minimum af 4 trin (5 rammer) for at reducere den statistiske fejl. Bemærk, at ~ 75% af molekyler blege inden for mindre end 5 rammer for de billeddannende beskrevne. Sådanne korte numre giver ikke tilstrækkelig statistisk sikkerhed at skelne mellem bundne og ubundne molekyler. Men de relative fraktioner af bundne og ubundne molekyler, der rapporterer om proteinaktivitet er uafhængige af det samlede antal spor, der analyseres.

Det er nyttigt at redegøre for PSF lokalisering fejl (σ _LOC) i beregningen af D * fordi usikkerheden tilføjer en tilsyneladende tilfældig skridt til hver lokalisering af et molekyle ^15..

For at forbedre klassificeringen af ​​bundne og spredende molekyler, anbefaler vi at beregne D * both fra enkelt-trins fordrivelser og forskydninger over tid af to frames. Det er da muligt at indstille to separate D * tærskler: D * (15 ms) <0,15 mM ² / sek og D * (30 ms) <0,075 mM ² / sek.

Bemærk, at D * er en tilsyneladende diffusionskoefficient, der er påvirket af celle indespærring af sporene og bevægelse sløring som følge af diffusion i løbet af eksponeringstiden. At udtrække præcise upartiske diffusionskoefficienter, har det vist sig nyttigt at sammenligne den observerede bevægelse til simulerede data baseret på en stokastisk Brownsk bevægelse model ^5,7. Simulerede data kan også bruges til at teste procedurer dataanalyse.

Potentielle anvendelser af denne fremgangsmåde: Vi beskriver en generel fremgangsmåde til at visualisere og kvantificere protein-DNA-interaktioner in vivo ved ændringen i mobiliteten af et protein ved binding til kromosomet. Aktiviteterne af DNA-ellerRNA-bindende proteiner involveret i reparation, kan replikation, transkription og kromosom vedligeholdelse derfor skal følges i realtid på enkelt-celle niveau med en rumlig opløsning under optisk diffraktion grænsen. Fotoaktiveret enkelt molekyle sporing udvider traditionelle sporingsmetoder, der er begrænset til nogle få mærkede molekyler per celle. En alternativ metode, der måler molekylær diffusion in vivo er Fluorescence Recovery Efter Fotoblegning (FRAP). Mens FRAP er meget nyttigt til at måle globale diffusionskarakteristika i store celler, det er begrænset i sin evne til at løse en række molekylære arter med forskellige mobiliteter i et rumligt heterogent miljø, især for små bakterieceller.

Vi har anvendt fotoaktiveret enkelt molekyle sporing at måle DNA-bindende aktiviteter og subcellulære lokalisering af en række forskellige proteiner i E. coli herunder Pol1, DNA-ligase, Fis-protein, DNA-polymerase III ^7, samt Strukturelle Vedligeholdelse af kromosomer proteiner MukB, E, og F ^19. Vi forventer, at metoden også kan tilpasses til andre celletyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein			created by Lambda-Red recombination
MEM amino acids	Invitrogen	11130-051	minimal medium supplement
MEM vitamins	Invitrogen	11120-052	minimal medium supplement
Agarose	BioRad	161-3100	certified molecular biology grade
Microscope coverslips No 1.5 thickness	Menzel	BB024060SC	remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1 hr
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma-Aldrich	129925	CAUTION: toxic
PALM setup	home-built		described in Uphoff et al.7
MATLAB	MathWorks		for data analysis and visualization
Localization software	custom-written, available online	http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html	MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al.13 if used in publication.
Tracking software	available online	http://physics.georgetown.edu/matlab/	MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier12 if used in publication.