Visualisera protein-DNA interaktioner i levande bakteriella celler med photoactivated Single-molekyl Tracking

Summary

Photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) kombinerat med enda molekyl spårning möjliggör direkt observation och kvantifiering av protein-DNA interaktioner i levande Escherichia coli-celler.

Abstract

Protein-DNA-interaktioner är i centrum för många fundamentala cellulära processer. Till exempel är DNA-replikation, transkription, reparation och kromosomorganisation styrs av DNA-bindande proteiner som känner igen specifika DNA-strukturer eller sekvenser. In vitro-försök har bidragit till att skapa detaljerade modeller för funktionen av många typer av DNA-bindande proteiner, men ändå , de exakta mekanismerna i dessa processer och sin organisation i den komplexa miljö i den levande cellen förblir mycket mindre förstås. Vi introducerade nyligen en metod för att kvantifiera DNA-reparationsverksamhet i levande Escherichia coli-celler med hjälp av fotoaktiverad Lokalisering Mikroskopi (PALM) kombinerat med enda molekyl spårning. Vår allmänna inställning identifierar enskilda DNA-bindande arrangemang av förändringen av rörligheten för ett enda protein på association med kromosomen. Fraktionen av bundna molekyler ger en direkt kvantitativt mått för proteinet ageraivity och förekomst av substrat eller bindningsställen vid encelliga nivå. Här beskriver vi konceptet av metoden och demonstrera provberedning, datainsamling, och förfaranden för dataanalys.

Introduction

Detta protokoll beskriver en direkt mätning av protein-DNA-interaktioner i levande Escherichia coli-celler. Tekniken utnyttjar förändring av diffusionskoefficienten för ett enda fluorescensmärkt protein såsom det binder kromosomen (fig 1). För att demonstrera den metod vi använder DNA-polymeras I (Pol1), en prototypisk DNA-bindande protein som fyller DNA-luckor i eftersläpande sträng replikering och excision reparationsvägar ^1.

Tillkomsten av super-upplösning fluorescensmikroskopi möjliggör visualisering av molekylära strukturer i celler med nanometerupplösning. Photoactivated Localization Mikroskopi (PALM) använder fluorescerande proteiner som kan aktiveras från ett initialt mörkt tillstånd till ett fluorescerande tillstånd (Figur 2). Endast en del av alla märkta molekyler aktiveras när som helst för att bestämma sina positioner på ett sekventiellt sätt, oberoende av than total koncentration av märkta molekyler i provet ^2. Lokaliseringen precision per molekyl beror huvudsakligen på storleken av det fluorescerande punktspridningsfunktion (PSF), antal insamlade fotoner, och bakgrundssignalen ^3. Många tillämpningar av denna metod fokuserar på förbättrad visualisering av cellstrukturer. Insikten att PALM kan kombineras med enda molekyl spårning ⁴ öppnat nya vägar för att direkt följa rörelsen av godtyckliga antal märkta proteiner i levande celler. Ökad känslighet och tidsmässig upplösning av fluorescens mikroskop tillåter nu spårning av enstaka diffuse fluorescerande proteiner i bakterie cytoplasman ^5.

Här använder vi PAmCherry, ett manipulerat fluorescerande protein som oåterkalleligt konverterar från ett initialt icke-fluorescerande tillstånd till ett fluorescerande tillstånd vid bestrålning med 405 nm ljus ^6. Aktiverat PAmCherry fluoroforer kan vara bildd genom excitation vid 561 nm och spåras i flera ramar till fotoblekning. Vi visar förmågan av metoden för att identifiera övergående DNA-bindande arrangemang av enstaka proteiner med hjälp av en fusion av Pol1 och PAmCherry. Behandling av celler med metylmetansulfonat (MMS) orsakar DNA-metylering skada som förvandlas till gapped DNA-substrat från bas-excision reparation enzymer. Vår metod visar tydlig bindning av enskilda Pol1 molekyler som svar på MMS skada ^7.

Protocol

1. Cellodling

Använd sterila kultur rör och pipettspetsar. Den E. coli stam AB1157 polA-PAmCherry uppbär en C-terminal PAmCherry fusion av Pol1. Fusions insattes vid nativa kromosomställe genom att ersätta genen av vildtyp med användning av lambda-röd rekombination såsom beskrivits i Datsenko et al. ^Åtta Funktionalitet av fusionsproteinet bekräftades såsom bedömdes genom cellulära tillväxthastigheter och känslighet för det DNA-skadande medlet metyl metansulfonat (MMS). Ytterligare information om konstruktionen av den cellstam kan hittas i Uphoff et al. ^7, Datsenko et al. ^8, och Reyes-Lamothe et al. ⁹ Cellkulturer odlas i M9 minimalmedium för att minska autofluorescens och undvika bakgrundspartiklar på objektglas. Alternativt kan en näringsrik definierat medium ^10.

1. Serie E. coli stam AB1157 polA-PAmCherry från en fryst glycerolstam på en Luria Broth (LB) agarosplatta med selektiva antibiotika (här, 25 | ig / ml kanamycin) och inkubera vid 37 ° C över natten.
2. Inokulera en 5 ml LB-odling från en enda cell koloni och odla vid 37 ° C under skakning vid 220 varv per minut under 3 timmar.
3. Späd kulturen 1:10.000 i 5 ml minimalt medium (M9-medium, MEM aminosyror + prolin, MEM-vitaminer, 0,2% glycerol) och inkubera vid 37 ° C under skakning vid 220 rpm över natt.
4. Följande morgon, mäta den optiska densiteten (OD) under användning av en spektrofotometer och späd den kultur i 5 ml färskt minimalt medium till OD 0,025. Odla i 2 h vid 37 ° C under skakning vid 220 rpm till tidig exponentiell fas (OD 0,1).
5. Koncentrat 1 ml celler i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör genom centrifugering vid 2300 x g under 5 min. Avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten i 20 pl resterande medium och virvel.

2. Mikroskopglas Förberedelseion

1. Bered en 1,5% låg-fluorescens agaroslösningen i dH ₂ O. Använd en mikrovågsugn för att smälta agaros tills lösningen är klar. Blanda 500 pl av den smälta agaroslösningen med 500 | il av 2x minimalt medium genom att försiktigt pipettera upp och ned några gånger.
2. Sprid agaroslösningen jämnt i mitten av ett mikroskop täckglas (nr 1,5 tjocklek). Detta måste göras snabbt innan agarosen svalnar, undvika bubblor.
3. Platta till dynan med en andra täckglas (nr 1,5 tjocklek). För att ta bort bakgrunds fluorescerande partiklar ades täckglasen som tidigare bränts i en ugn vid 500 ° C under 1 timme. Brända täckglas kan lagras i veckor i rumstemperatur täckt av aluminiumfolie.
4. För DNA-skadeexperiment, förbereda en agaros pad innehållande 100 mM MMS. Följ proceduren i steg från 2,1 till 2,3, men lägg 8,3 pl MMS till 500 pl av M9-medium före blandning med 500 pl av smält 1,5% agaros, till en slutlig koncentration av 100 mM MMS. (Varning! MMS är giftig och mutagena och måste hanteras med handskar, mask, skyddsglasögon och skyddsrock).
5. Ta bort det översta bild från plattan och tillsätt 1 l av koncentrerad cellsuspension på kudden. Immobilisera cellerna genom att täcka kudden med en oanvänd brända täckglas (nr 1,5 tjocklek, matchar mikroskop målet specifikation) och genom att trycka mycket försiktigt på bilden. Celler bör avbildas inom 45 min av immobilisering innan agarosen pad torkar. För att förhindra uttorkning under längre experiment, kan agaros kuddar tätas med silikonpackningar.
6. För DNA-skadeexperiment, inkubera celler immobiliserade på agarosen pad innehållande 100 mM MMS i 20 min i en fuktig behållare i rumstemperatur före avbildning.

3. Förbereda Mikroskopi Datainsamling

PALM förlitar sig på att upptäcka och exakt lokalisering av enstaka fluorescerande proteiner. Känsligheten och optimal anpassning avmikroskop är avgörande för datakvalitet. Enda molekyl fluorescens mikroskop använder typiskt total inre reflektion (TIR) ​​belysning för att förbättra signal-till-brus-förhållande av endast spännande fluoroforer inom en tunn sektion ovanför täckytan. Här, bildhantering inne E. coli kräver mycket benägna belysning ^11, vilket kan åstadkommas på en TIRF mikroskop av något minskande vinkel excitation ljus. PAmCherry avbildning kräver ytterligare en 405 nm fotoaktivering laser och en 561 nm excitation laser. Fluorescensemissionen är inspelad på en elektron multiplicera CCD (EMCCD) kamera med en förstoring som resulterar i en bildpunktslängd 114,5 nm / pixel. Film För optimal lokalisering precision, bör pixelstorleken ungefär matchar standardavvikelse bredd PSF för att säkerställa tillräcklig provtagning utan att sprida signalen över för många pixlar. Figur 3 visar en schematisk bild av en minimal PALM setup. 1ger ett intryck av den beställda mikroskop byggprocessen, se et al Uphoff ⁷ för en detaljerad beskrivning av instrumentet..

1. Utföra rutinmikroskop inriktning. Mät 405 nm och 561 nm kontinuerlig våg laserintensiteter framför målet. Justera 561 nm intensiteten till 3,5 mW (~ 400 W / cm ²⁾ och 405 nm intensiteten till 10 ^ W (~ 1 W / cm ^2). Använd en kontinuerligt variabel neutral densitet filterhjul som tillåter gradvis anpassning av 405 nm intensitet 0-10 iW. Stäng av laserbelysning fram till starten av experimentet.
2. Placera provet på mikroskop scenen och sätta cellerna i fokus i genomlysning mikroskopi läge (Figur 4A). Den EMCCD kamera vinsten måste stängas för att förhindra skador på kameran genom överexponering.
3. Definiera en beskärs FOV för att minska datastorlek och öka kamerans avläsningshastighet.
4. Täck provet från omgivande ljus och switch på EMCCD kamera vinst.
5. Ställ in bildhastigheten till 15,26 ms / ram (inklusive 0,26 msek kamera avläsningstiden). Se "exponeringstid och excitation intensitet" i diskussionsavsnittet.
6. Visa kamera data för att kontrollera den mörka bakgrunden signalen (Figur 4B).
7. Slå på 561 nm laser och kontrollera excitations bakgrundssignal (fig 4C).
8. Slå på 405 nm laser för fotoaktivering av Pol1-PAmCherry fusionsproteiner och öka intensiteten tills fluorescens PSFS visas.
9. Justera vinkeln excitationsstrålen att belysa endast en tunn sektion av provet i närheten av täckytan.
   1. För detta ändamål riktas laserstrålen fokuseras i det bakre fokalplanet för en 100X NA 1,4 objektiv (figur 3). Översätta fokuseringslins vinkelrätt mot balken flyttas fokus bort från mitten av målet som orsakar strålen för att avsluta målet inom en vinkel.
   2. Aim för att maximera fluorescensintensiteten och minimera bakgrundssignalen. Observera att strikt TIR-excitation är optimalt att bild fluoroforer inom 100 nm av täckytan dock imaging DNA-bindande proteiner i samband med E. coli nucleoid kräver djupare belysning upp till 0,8 um.

4. Datainsamling

Här beskriver vi det allmänna protokollet för förvärv av en PALM film. Samma förfarande gäller för avbildning Pol1-PAmCherry fusionsproteiner i oskadat E. coli-celler och under kontinuerlig DNA-skada behandling med MMS. Tillämpning av metoden till fusionsproteiner med olika molekylvikt eller antal kopior per cell kommer att kräva olika förvärvsinställningar (se diskussion avsnitt).

1. Hitta ett nytt synfält (FOV) av celler i genomlysning mikroskopi läget och fokusera bilden. Ta en kamera ögonblicksbild för att spela in cell konturer (Figur 4A).
2. Täck provet från omgivande ljus och slå på EMCCD kamera vinst.
3. Slå på 561 nm laser och bleka cellulära autofluorescens och bakgrundsfläckar på täckglas i några sekunder innan du startar datainsamling. För celler som odlas och avbildas i M9-medium och använda brända täck finns det oftast väldigt lite fluorescens bakgrund, men kunde förblekning vara användbart för avbildning celler i ett rikt tillväxtmedium såsom LB. Observera att intensiv belysning är giftigt för cellerna så förblekning bör hållas till ett minimum.
4. Starta förvärv av en PALM film under ständig 561 nm excitation vid 15,26 ms / ram.
5. Slå på 405 nm laser och gradvis öka intensiteten under loppet av filmen, når upp till 1 W / cm ^2. Undvik högre 405 nm intensiteter som orsakar cellulär autofluorescens. Var uppmärksam på tätheten av fluorescerande molekyler - det är viktigt att hålla aktiverings priser låga så att vävda polyesterstapelfibrer är klartisoleras i varje ram (fig 4D-F).
6. Spela 10.000 bilder / film (beroende på antalet molekyler som ska avbildas per cell), en film tar normalt 2-3 minuter och kräver 0,5-1 GB hårddiskutrymme, beroende på storleken på FOV.
7. Upprepa förvärvsförfarandet för flera FOV. Observera att varje FOV endast kan avbildas en gång eftersom PAmCherry fluoroforer får fotoaktiverad och blekt oåterkalleligt.

5. Dataanalys

En automatiserad och robust ramverk dataanalys är avgörande för prestanda och effektivitet av metoden. Vi använder anpassad mjukvara skriven i MATLAB.

1. Utför lokaliseringsanalys med hjälp av algoritmer som beskrivs i Crocker et al. ^12, Holden et al. ^13, HoldenI et al. ^14, och Wieser et al. ¹⁵ PSFS först identifieras i ett bandpass filtrerad bild med en Gausskärna med 7 pixels diameter (Figur 5A). Kandidat positionerna motsvarar vävda med topp pixelintensiteter ovanför 4,5 gånger standardavvikelsen för bakgrundssignalen (Figur 5B). Den lokalt ljusaste pixel per kandidat PSF fungerar som initial gissning för montering en elliptisk Gaussfunktion (figur 5C). De fria passningsparametrar är: x-läge, y-läge, x-bredd, y-bredd, rotationsvinkel, amplitud, och bakgrundsförskjutning. Den elliptiska Gaussisk mask står för molekyl under exponeringstiden, som suddar och deformerar PSF.
2. Rita den resulterande (x, y) lokaliseringar från alla ramar i PALM film på den överförda ljusmikroskop bild av samma FOV. Lokaliseringar av Pol1-PAmCherry ska visas i den centrala delen av E. coli-celler (figur 6A). Om många lokaliseringar visas utanför celler, var tröskeln lokalisering för lågt eller att provet innehöll bakgrunds fluorescerande partiklar.
3. För automatisk spårning analys, genomförande av algoritmen som beskrivs i Crocker et MATLAB al. ¹² kan användas (se "Diffusion analys" i diskussionsavsnittet). Positioner som visas i efterföljande bildrutor i ett användardefinierat spårningsfönster är anslutna för att bilda en bana. I det fall att flera lokaliseringar inträffa i samma fönster, är spåren unikt tilldelad genom att minimera summan av steglängder. För en detaljerad diskussion om de olika överväganden vid beräkning diffusionskoefficienter från singel-partikelspårningsinformation, se Wieser et al. ¹⁵
   1. Algoritmen använder en minnes parameter att ta hänsyn till övergående blinkande eller missade lokaliseringar under ett spår. Här sätter vi minnet parametern till 1 bild, högre värden kan användas för att spåra fluoroforer med långlivade mörka stater.
   2. Välj ett lämpligt spårningsfönster baserat på följande kalibreringssteg. För Pol1 använder vi 0,57 um (5 pixlar).
   3. Kör spårningsalgoritm för en rad spårning fönsterparametrar. Beräkna antalet uppmätta spår per cell som en funktion av den spårningsfönstret för att identifiera den minsta möjliga spårningsfönster som inte klyvs spår (Figur 6B).
   4. Rita den resulterande spår på genomlysning mikroskopi bild av samma FOV att visualisera den rumsliga fördelningen av molekyl rörelse inom celler. Pol1 spår ska visa diffusion sluten i enstaka celler (figur 6C-D).
   5. Om en fraktion med spår visas att passera mellan cellerna detta tyder på att separata molekyler felaktigt länkades eftersom spårningsfönstret valdes för stor och / eller fotoaktiveringshastigheten var för högt (fig. 6E).
   6. Plotta den kumulativa fördelningen av steglängder mellan varandra följande lokaliseringar (Figur 6f). Kurvan stiger och mättar smidigt för tillräckligt stora spårning fönstermen visar en cutoff kant om fönstret valdes för litet.
4. Att analysera spridningsegenskaper Pol1, beräkna medelvärdet-squared förskjutning (MSD) mellan varandra följande lokaliseringar för varje spår med totalt N steg):
   MSD = 1 / (N-1) Σ _{i = 1} ^N-1 _(X ^ ₁ - x _i) ² + (y _{i 1} - _yi) ^2.
   Inkludera endast spår med minst 4 steg (N ≥ 5 lokaliseringar) för att minska den statistiska osäkerheten i MSD-värden.
5. Rita en kurva av MSD-värden över ett intervall av fördröjningstider genom att beräkna förskjutningar över flera ramar (Figur 6G). Formen på MSD kurva kan hjälpa till att klassificera den observerade molekyl rörelse (fig. 6H).
6. Beräkna den uppenbara diffusionskoefficienten D * per spår från MSD:
   D * = MSD / (4 At) - σ _loc ² / At.
   Den andra term korrigerar för den beräknade lokaliseringsfelet (här, σ _loc = 40 nm och At = 15,26 ms, se Wieser et al. ^15).
7. Rita ett histogram av de uppmätta D * värden från alla spår i FOV (Figur 7A).
8. Identifiera individuella Pol1 molekyler som förefaller bunden till kromosom baserat på den uppmätta D * värde per spår. Separera populationer av bundet (skarp fördelning centrerad på D * ~ 0 ìm ² / sek) och fritt diffunderande molekyler (bred fördelning centrerad på D * ~ 0,9 ìm ² / sek) genom att fastställa en tröskel D * <0,15 ìm ² / sek ( röda staplar i fig. 7A och 7D).
9. Utför lokalisering, spårning, och diffusion analys för Pol1 i oskadade celler (fig. 7A-C) och i celler under DNA-skada behandling med MMS (figurerna 7D-E). Fraktionen av bundna banor ger en direkt kvantitativt mått på DNEn reparation aktivitet Pol1 in vivo.

Representative Results

Begreppet photoactivated enda molekyl spårning för att studera protein-DNA-interaktioner in vivo illustreras i figur 1. PAmCherry fusionsproteiner upptäcks i levande E. coli-celler i ett sekventiellt sätt genom fotoaktivering av enstaka molekyler stokastiskt med 405 nm ljus med en frekvens på mindre än en molekyl per cell i taget. Aktiverat molekyler avbildas under kontinuerligt 561 nm excitation. Molekyl rörelse i cellen kan spåras genom att ansluta närliggande lokaliseringar i en serie av ramar tills irreversibla fotoblekning. Eftersom diffusionen av DNA-bindande proteiner bromsas vid bindning kromosomen, den skenbara diffusionskoefficienten D * erhålles per spår rapporterar direkt på individuella protein-DNA-interaktioner.

Figur 2 visar fotoaktivering av Pol1-PAmCherry fusionsproteiner i levande E. coli-celler. Påverkan av 405 nm intensitet on tätheten av fluorescerande molekyler kan ses i figur 4. Observera att densiteten inte enbart bestäms av 405 nm intensitet men dessutom med antalet molekyler som är tillgängliga för aktivering, den pool av återstående molekyler är slut under loppet av en PALM film.

Lokalisering analys utförs för varje ram av en PALM film såsom illustreras i fig. 5. Vi mätte lokalisering precision med hjälp av orörliga molekyler i fasta celler eller bundna molekyler i levande celler. Vår förvärvsinställningar gav en lokaliseringsprecision σ _loc = 40 nm, i samförstånd med den teoretiska förutsägelsen ^3.

De resulte Pol1 lokaliseringar upptar den centrala delen av cellen (figur 6A), i stort sett rekapitulera den rumsliga organisationen av E. coli nucleoid ^7. Majoriteten av Pol1 spår i oskadade celler visar diffusion såsom visas i fig. 6C. En typisk cell innehåller flera hundra Pol1 spår (figur 6D), som överensstämmer med det exemplar antalet cirka 400 Pol1 molekyler per E. . coli-cell ¹ Figurerna 6B och 6E-F ger vägledning om att välja en lämplig spårningsfönster parameter - om spårning fönstret är för stor, olika molekyler är mer benägna att bli felaktigt kopplat till ett spår, om spårning fönstret är för litet, spår med längre steg delas. MSD Kurvan för Pol1 stiger linjärt för korta fördröjningstider och mättar vid längre fördröjningstider på grund av cell förlossningen (figur 6G). Olika typer av molekylär rörelse kan identifieras med MSD-analys. Riktad rörelse ger en parabolisk kurva, Brownsk rörelse kännetecknas av en rak linje, den begränsade diffusionen kurvan når en platå, en förskjutning av MSD-kurva för orörliga partiklar representerar localization osäkerhet (figur 6H). Ytterligare information om singel-partikel spårning och felsökningstips finns i Arnauld et al. ¹⁶

Vi tillämpade tidigare metoden för att mäta DNA-reparationsverksamhet av Pol1 som svar på exogena DNA alkylering skada ^7. D * histogram Pol1 spårar i oskadade celler visar en dominerande population av diffunderande molekyler (fig. 7A-C). En liten fraktion av 2,7% bundet Pol1 molekyler sannolikt inblandade i eftersläpande sträng-replikation och reparation av endogen DNA-skada. Under kontinuerlig 100 mM MMS skador, populationen av låtar med D * ~ 0 ìm ² / s ökar till 13,8% (Figur 7D). Dessa spår representerar individuella Pol1 molekyler som utför DNA-reparationssyntes för att fylla enkel nucleotide luckor som en del av bas-excision reparationsvägen. Positionerna för bundna banor visar platserna för enskildaDNA-skador och reparationsplatser (Figur 7E-F).

Figur 1. Grafisk representation av metoden. (A) Den fluorescerande proteinet PAmCherry kan fotoaktiveras från ett initialt icke-fluorescerande tillstånd vid bestrålning med 405 nm ljus. Den ljusa tillstånd är upphetsad vid 561 nm och emitterar fluorescens runt 600 nm tills fluoroforenheter blekmedel irreversibelt. (B) Styrning av fotoaktiveringshastigheten möjliggör avbildning endast en stokastiskt aktiverad PAmCherry fusionsprotein per cell när som helst medan det godtyckligt stor pool av molekyler som ännu inte har aktiverats eller har redan blekta resterna i ett mörkt tillstånd. (C) Positionen för den fluorescerande molekyl bestäms från centrum av den isolerade PSF och tracked flera ramar till fotoblekning. (D) Spår av många molekyler registreras på ett sekventiellt sätt. (EF) Interaktionen av ett DNA-bindande protein med en kromosomal målsekvens eller struktur stoppar slumpmässig diffusiv rörelse. Bundna och obundna molekyler kännetecknas av den uppenbara diffusionskoefficienten D * utvinns ur enkelspår. Den resulterande fraktion av bundna molekyler ger ett kvantitativt mått på aktiviteten av ett DNA-bindande protein in vivo. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Fotoaktivering av Pol1-PAmCherry i levande E. coli-celler. Skalstrecken: 1 pM. Scheman visas under varje panel. ( A) fallande ljusmikroskop bild av celler immobiliserade på en agaros pad. (B) Phototactivating en enda PAmCherry fluorofor i en cell. (C) En högre fotoaktiveringshastigheten ökar antalet fluorescerande molekyler. (D) Integrerad PAmCherry fluorescens från en PALM film. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Schematisk bild av en minimal PALM setup för fotoaktivering och bildbehandling PAmCherry fusionsproteiner D1:. Dikroisk spegel (t.ex. 550 nm långpass). D2: dichroic mirror (t.ex. 570 nm långpass). L1: Kollimatorlins. L2: TIR lins. L3: Rör lins.1177/51177fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4. Bilderna är från en PALM film med 15,26 ms / ram Skala barer:. 1 mikrometer. (A) Fallande ljus bild av celler immobiliserade på en agaros pad. (B) Mörk bakgrundsbild mätt på EMCCD kamera med lasrarna avstängd. (C) Exciterings bakgrundsbild under ständig 561 nm excitation före fotoaktivering. (DF) Ökad 405 nm intensitet leder till högre fotoaktivering andelen PAmCherry, avbildas under ständig 561 nm excitation. De inramade områdena visas förstorade nedan. (D) Låg 405 nm intensitet (<1 ^ W) aktiva mycket få fluorescerande molekyler per FOV. (E) Medium 405nm intensitet (~ 2 ^ W) fotoaktivering resulterar i en bra PSF täthet för lokalisering och spårning analys. (F) Högre 405 nm intensitet (~ 10 ^ W) aktiverar mer än en fluorescerande molekyl i vissa celler, som skymmer lokalisering och spårning analys. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5. Illustration av lokaliseringsanalys. Skala barer: 1 mikrometer (A) Band-pass-filtrering tar bort falska pixel buller och plattar intensitet gradienter över FOV.. (B) Kandidat PSFS identifieras i den filtrerade bilden baseras på en användardefinierad tröskel som är vald för att minimera falskt positiva och falskt negativa upptäckter. Den threshold motsvarar minimiintensitet av en kandidat pixel dividerat bakgrunden standardavvikelse (signal-till-brus-förhållande, SNR). (C) Den lokalt ljusaste pixel som passerar tröskeln tjänar som initial lokalisering gissning (orange kors) för en två-dimensionell elliptisk Gaussisk passform. Skalstrecken: 0,5 pM. Den resulterande superupplösning lokalisering (blå kors) har en genomsnittlig precision på σ _loc = 40 nm. Klicka här för att visa en större bild.

.. Figur 6 Illustration av spårningsanalys Skala barer: 1 mikrometer. (A) Alla upptäckta lokaliseringar av Pol1-PAmCherry i ett exempel cell. (B) Antal spår upptäckered i exemplet cell som en funktion av spårningsfönstret. Små spårningsfönster dela molekyl banor, vilket leder till artefaktuella högt antal spår. Den streckade linjen anger vårt val för spårningsfönstret parametern (0,57 | im, 5 bildpunkter) - detta ger en god kompromiss mellan att detektera fullständig fördelning av steg och hålla banorna för olika molekyler intakt. (C) Exempel spår i en enda Pol1-PAmCherry molekyl. (D) Alla uppmätta spår som visas i slumpmässiga färger. (E) Spårning artefakter, om spårningsfönstret väljs för stor (här 0,8 um, 7 pixlar) eller densiteten för vävda per ram är för hög. (F) Kumulativa fördelningar av steglängder för spårning fönster: 0.34 um (3 pixlar, röd linje), 0,57 m (5 pixlar, blå linje) och 0,80 m (7 pixlar, grön linje). Observera att 0,34 um spårning fönster skär av steg längre än 0,34 um som tydligttrunkerar fullständig fördelning av steg. Den 0,57 ìm spårningsfönster känner nästan samma fördelning av åtgärder som gör det 0,80 um spårning fönstret. (G) MSD kurvan visar begränsad spridning av Pol1. (H) Schematisk MSD kurvor för riktad rörelse, Brownsk rörelse, begränsad spridning, och orörliga partiklar. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 7. Direkt mätning av DNA-reparationsverksamhet Pol1 i levande E. . coli celler Skala barer: 1 | im. (A) Histogram av den uppenbara diffusionskoefficienten D * för alla spår av 4 eller flera steg i en FOV av oskadade celler (N = 4162 låtar). Befolkningen av molekyler som klassificeras som b ound är markerat i rött. (BC) Spår av Pol1-PAmCherry visas på en genomlysning mikroskopi bild. Spår som klassificeras som bundet enligt deras diffusionskoefficienten visas i rött. (D) D * histogram för Pol1 spår mätt i celler immobiliserade på en agaros pad med 100 mM MMS och inkuberas i 20 minuter innan avbildning (N = 2128 låtar). Befolkningen av bundna molekyler som deltar i DNA-reparation visas i rött. (EF) Pol1-PAmCherry spår på genomlysning mikroskopi bild visar spår av enstaka Pol1 DNA-reparation händelser i rött. Klicka här för att visa en större bild.

Film 1. Att bygga en skräddarsydd PALM setup.JoVE_Uphoff_Movie1.avi "target =" _blank "> Klicka här för att se video.

Discussion

Vi diskuterar flera viktiga faktorer för att lyckas med experimentet.

Val och uttryck av den fluorescerande fusionsprotein: Det finns en stor palett av fotoaktiverbara och photoswitchable fluorescerande proteiner ^17. Det specifika valet beror på egenskaperna mikroskop, särskilt laser och filter tillgängliga. Kombinationen av 405 nm och 561 nm är idealisk för vanliga fotoaktiverbara fluorescerande proteiner. Vi valde PAmCherry ⁶ eftersom den är monomera och visade ingen aggregation i cellerna. Vidare tillåter irreversibla fotoaktivering räkna antalet aktiverade fluoroforer för att mäta protein kopietal per cell. I stället för att uttrycka fusionsproteinet från en plasmid, vi föredrar kromosomal infogning av genen som kodar för fusionsproteinet på vildtyp-lokuset. Detta garanterar fullständig ersättning av proteinet av intresse med den fluorescerande version och upprätthållande av vildtyp expressionsnivån.

Fotoaktivering kurs: Det är viktigt att justera fotoaktivering hastighet så att mindre än en molekyl per cell i genomsnitt är i fluorescerande tillstånd i varje bildruta i filmen. Detta beror på 405 nm intensitet och antalet molekyler kvar för att aktiveras. Vid mycket låga avbildnings tätheter, dock inte alla molekyler kommer att avbildas före slutet av filmen eller mycket långa filmer måste förvärvas. Antalet bilder som spelas in per filmen beror på antalet kopior av fusionsproteiner per cell och den genomsnittliga fotoblekning livstid PAmCherry vid exciteringsbetingelserna. Kopietalet av Pol1 är ~ 400 molekyler / cell ¹ och medelvärdet av den exponentiella fotoblekning livstid fördelningen var ~ 4 ramar. Genom att öka 405 nm intensiteten gradvis, är aktiveringen jämnt fördelade över 10.000 bildrutor i filmen. Därför är varje cell Occupied av fluorescerande molekyler för totalt ~ 1.600 ramar, säkerställa liten överlappning av vävda och spårning komplikationer i en film på 10.000 ramar.

Exponeringstid och excitation intensiteter: Främst, exponeringstider måste vara tillräckligt kort för att observera skarpa PSFS med lite rörelseoskärpa. Emellertid bör ramhastigheten väljas att ge observerbara molekylär rörelse mellan successiva ramar bortom lokalisering osäkerhet, annars avgörande fotoner spillo genom översampling spåret. Rörelsen av obundna molekyler måste samplas med tillräckligt långa tidsintervall som tydligt skiljer sig från den skenbara rörelse bundna molekyler på grund av lokaliseringsosäkerhet. När exponeringstiden är inställd, skall PSF intensitet justeras. Lokaliseringen precisionen hos en PSF ökar med antalet fotoner som detekteras över varaktigheten av en ram. Högre exciteringsintensitet ökar fotonemission ränta but även fotoblekning hastighet och bakgrundssignalen. Använd lägsta exciteringsintensitet som ger önskad lokalisering precision. För Pol1-PAmCherry valde vi 15,26 ms / ram och 3,5 mW 561 nm excitation (400 W / cm ^2). Det är viktigt att bekräfta cellviabiliteten för de speciella avbildningsförhållanden genom att övervaka celltillväxt och morfologi före och efter datainsamling (se kompletterande information i Uphoff et al. ^7).

Pol1 uppvisar en bindande tid för ~ 2 sek till ett gap DNA-substrat in vivo ⁷ och därför förväntar vi oss de flesta molekyler som antingen i bunden eller obunden tillstånd för hela den tid som ett spår. Bundna molekyler uppträder i huvudsak orörliga eftersom kromosom webbplatser har en diffusionskoefficient flera tiopotenser lägre (~ 10 ^-5 ìm ² / sek, Elmore et al. ¹⁸⁾ än Pol1 diffusion i cytoplasman (~ 1 mm ²

Diffusion Analys: Den skenbara diffusionskoefficienten D * beräknas från MSD för enskilda spår, medelvärde över minst 4 steg (5 ramar) för att minska den statistiska fel. Observera att ~ 75% av molekylerna blekmedel inom mindre än fem bildrutor för avbildnings förhållanden som beskrivs. Sådana korta spår ger inte tillräcklig statistisk säkerhet att skilja bundna och obundna molekyler. Emellertid är de relativa fraktionerna av bundna och obundna molekyler som rapporterar på proteinaktivitet är oberoende av det totala antalet spår som analyserats.

Det är lämpligt att ta hänsyn till PSF lokaliseringsfelet (σ _loc) vid beräkningen av D * på grund av att osäkerheten adderar en skenbar slump steg till varje lokalisering av en molekyl ^15.

För att förbättra klassificeringen av bundna och sprida molekyler, rekommenderar vi att beräkna D * both från enkelstegs förskjutningar och förskjutningarna över tiden för två ramar. Det är då möjligt att ställa in två separata D * trösklar: D * (15 ms) <0,15 ìm ² / sek och D * (30 ms) <0,075 ìm ² / sek.

Observera att D * är en skenbar diffusionskoefficient som påverkas av cell inneslutning av spåren och för rörelseoskärpa grund av diffusion under exponeringstiden. För att extrahera exakta objektiva diffusionskoefficienter, har det visat sig vara användbart för att jämföra den observerade rörelsen till simulerade data baserat på en stokastisk Brownsk rörelse modell ^5,7. Simulerade data kan också användas för att testa rutiner dataanalys.

Potentiella tillämpningar av denna metod: Vi beskrev en allmän strategi för att visualisera och kvantifiera protein-DNA-interaktioner in vivo genom att förändringen i mobilitet för ett protein vid bindning till kromosomen. Verksamheten i DNA-ellerRNA-bindande proteiner som är inblandade i reparation, replikation, transkription, och kromosom underhåll kan således följas i realtid vid encelliga nivå med en rumsupplösning under den optiska diffraktionsgränsen. Photoactivated enda molekyl spårning förlänger konventionella spårningsmetoder som är begränsade till ett fåtal märkta molekyler per cell. En alternativ metod som mäter molekylär diffusion in vivo är Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP). Medan FRAP är mycket användbar för att mäta globala spridningsegenskaper i stora celler, är den begränsad i sin förmåga att lösa flera molekylslag med olika rörligheter i ett rumsligt heterogen miljö, särskilt för små bakterieceller.

Vi har tillämpat photoactivated enda molekyl spårning för att mäta DNA-bindande aktiviteter och subcellulära lokaliseringar av en rad olika proteiner i E. coli inklusive Pol1, DNA-ligas, Fis-protein, DNA-polymeras III ^7, samt struktur Underhåll av kromosomer proteiner MukB, E, och F ^19. Vi räknar med att metoden kan även anpassas till andra celltyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein			created by Lambda-Red recombination
MEM amino acids	Invitrogen	11130-051	minimal medium supplement
MEM vitamins	Invitrogen	11120-052	minimal medium supplement
Agarose	BioRad	161-3100	certified molecular biology grade
Microscope coverslips No 1.5 thickness	Menzel	BB024060SC	remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1 hr
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma-Aldrich	129925	CAUTION: toxic
PALM setup	home-built		described in Uphoff et al.7
MATLAB	MathWorks		for data analysis and visualization
Localization software	custom-written, available online	http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html	MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al.13 if used in publication.
Tracking software	available online	http://physics.georgetown.edu/matlab/	MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier12 if used in publication.