Summary
细菌细胞壁由多肽组成，多肽交叉连接的糖链大分子网络。超性能液态色谱为多肽类成分的新发现提供了高分辨率和高吞吐量。我们提出了一个隔离细胞壁（sacculi）的程序，以及随后通过 UPLC 进行分析的准备。
Abstract
细菌细胞壁对于确定细胞在生长和分裂过程中的形状至关重要，在面对各种大气中的涡轮压力时保持细胞的机械完整性。在细菌王国的不同形状和大小中，细胞壁由多肽组成，这是一个由短肽交叉连接的糖链的巨分子网络。Peptidoglycan对细菌生理学的核心重要性是其作为抗生素靶点的使用的基础，并促使遗传、结构和细胞生物学研究如何在生长和分裂过程中牢固地组装它。尽管如此，仍需进行广泛的调查，以充分描述多肽合成中的关键酶活动和细菌细胞壁的化学成分。高性能液相色谱 （HPLC） 是量化在各种环境和遗传条件下生长的细菌壁化学成分差异的有力分析方法，但其吞吐量往往有限。在这里，我们提出了一个简单的程序，通过HPLC和超性能液态色谱（UPLC）对多肽菌进行生物分析的细菌细胞壁的隔离和制备，这是HPLC的延伸，利用泵提供高达15，000 psi的超高压，而HPLC的超高压为6，000 psi。结合这里介绍的细菌细胞壁的制备，低容量的样品喷油器、采样率高、样品量小、运行时间短的检测器，将使大多数生物实验室能够获得超中心和 UPLC，实现多肽类成分和基本细菌细胞生物学的新发现。
Introduction
本文描述的方法的目标是分离完好的细菌细胞壁（sacculi），并消化多肽（PG），以便使用超性能液态色谱（UPLC）提供信息，如多溴肽成分的身份及其浓度，甘油链的平均长度，以及链之间交叉链接所涉及的材料的分数。对于PG生物化学和多溴二苯二甲酸酯物种的详细讨论，有几个优秀的评论，描述了PG结构及其在感染，耐药性，形态形成和生长1-6的作用。用于PG分析的高性能液态色谱（HPLC）最初由格劳纳和施瓦茨在20世纪80年代开发，最近已在米格尔·德·佩德罗和瓦尔德马尔·沃尔默的实验室中得到改进和广泛应用。以前的方法采用氨基酸分析或纸张色谱法，耗时乏味的技术不能产生准确或完整的细胞壁组件评估。
UPLC 分析可轻松地在任何能够访问超中心和 UPLC 的基础研究实验室中实施。我们下面介绍的 UPLC 方法分离了完整的沙库利，从而提供了关于其所有化学物种的全面、定量信息。这种方法可精确量化细菌群中的所有多菌肽，所有在 20 分钟的 UPLC 运行范围内。这种方法的实施只涉及基本的实验室技能，没有对材料进行重大财政投资。为了执行这种方法的步骤，研究人员只需要熟练地吹笛，准备缓冲器和酶，并调整pH，使其能够进入广泛的科学学科。本协议中使用的酶的选择取决于所分析的细菌种类：这里描述的协议对 大肠杆菌是有用的，并且通常被发现足以将沙丘利与其他格拉姆阴性生物隔离开来。建议在将这种方法应用于革兰阳性细菌时与文献协商：在这些物种中，囊菌净化历来比较困难。特别是，这种方法可能必须改变酶的选择和消化时间的长度，以适应较厚的墙壁和附属聚合物，如革兰氏阳性细菌的铁酸。本协议中的第一种酶将外膜脂蛋白（如布劳恩的脂蛋白或Lpp）附着在肽上，从而从细胞壁中释放除C-终端二（或三）肽外的所有肽。此步骤在检查肠杆菌时是必要的，但许多其他 Gram 阴性细菌没有 Lpp 等价物，因此可以跳过此步骤。第二种酶在多肽的穆拉米酸成分后特别切开，溶解形成木荷肽物种的脱糖亚单位。为了准确评估 PG 的结构，应小心消化沙库利，以防止跨桥或肽茎的任何其他部分的。
虽然HPLC对来自100多个菌株的多肽类的化学成分进行了分析，但与普遍性保护委员会技术没有进行任何分析。此外，先前的工作仅从细菌领域的一小部分对多肽进行描述，部分受 HPLC 的吞吐量的限制。因此，将这种方法传播给尽可能多的研究人员，并在普遍支持下平台上实施，对于推动对大部分尚未分类的细菌物种进行生理研究至关重要。
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Protocol
1. 在 2.5 毫升的媒体过夜中培养细菌文化
后冲稀释培养物 1：100 到 250 毫升新鲜介质，并增长到OD 600 的 0.7-0.8。在水中准备6%的硫酸钠（SDS）溶液。
注意：SDS粉末是危险的 - 避免吸入SDS粉末;在鼻子和嘴上戴口罩。
2. 第1天 - 在一天和一夜之间进行莱辛细菌培养
- 在稀释文化不断发展的同时，在1升烧嘴的热盘子上设置一个开水浴池。水沸腾后，将6毫升6%SDS放入50毫升聚丙烯管中，在每根管子上加入一个小搅拌棒，将管盖固定在手指紧，将管子放入水浴中，并在热板上搅拌至500转/ 时。
- 在室温下以 5，000 ×克的速度收获 250 毫升培养物，在室温下 10 分钟，在 3 毫升介质或 1x 磷酸盐缓冲盐水中再补充颗粒。缓慢的移液器细胞悬浮到 50 毫升管中，6% 沸腾 SDS 以解化细胞（最终浓度 4% SDS），而管子则浸入沸水浴中，并将盖子重新封住，以手指紧绷。细胞悬架必须迅速转移到沸腾的SDS一旦恢复。应避免突然的环境变化，因为这可能导致细胞壁结构的错误改变。
- 盖上开水浴池，让细胞煮沸3小时，定期检查水位，必要时重新灌装水浴。3小时后，关闭热板的加热元件，并在500 rpm下持续搅拌过夜。
3. 第2天 - 酶消化在一天的过程中进行
- 如果 SDS 在 50 毫升管中沉淀了一夜，则将水浴煮沸 1-2 小时。打开热块至 60 °C。 在 10 mM 特里斯-HCl （pH 7.2） = 0.06% w/v NaCl 中准备 1 毫克/毫升的 Pronase E 库存，并在 60 °C 下激活质氨酶 E 至少 30 分钟。
- 使用40万×克的超中心燃料在室温下旋转样品20分钟，以颗粒化大型PG聚合物，从而从其他细胞组件中净化样品。小心去除超细剂，然后在室温超纯水中重新填充每个颗粒。注：悬念体积取决于使用的超中注管的体积：使用至少半路填充管子但不超过管的最大体积的体积。重复离心/清洗，直到水在悬念期间不会形成气泡，指示 SDS 已完全移除（通常为三次洗涤）。如果形成白色沉淀物，请停止清洗颗粒，因为这表明圣餐聚集在一起。结块不是灾难性的，但团块与塑料和玻璃器皿紧密结合，造成大量样品损失。在这种情况下，使用团状的萨库利样本继续执行协议。
- 在最后离心/清洗步骤中，将样品重新放在 900 μl 的 10 mM Tris-HCl （pH 7.2） + 0.06% w/v NaCl 中，并转移到 2 毫升管中，以前用小针戳在顶部的孔。在每个样品中加入 100 微克/毫升激活的 Pronase E（100 微克/毫升最终浓度），在 60 °C 下孵育 2 小时。设置不同的热块至100°C。
- 通过在每个样品中加入 200μl 的 6% SDS 来阻止 Pronase E 消化，并将样品在 100 °C 热块中煮沸 30 分钟。将不同的热块设置为 37 °C，并在 50 m M 磷酸盐缓冲区 （pH 4.9） 中储存 1 毫克/毫升的穆拉米酶（穆塔诺利辛）。
- 与步骤 3.2 一样，使用 400，000 ×克的超中心融合组在室温下旋转样品 20 分钟，并用室温超纯水清洗，直到 SDS 完全去除（通常三次洗涤）。悬念体积取决于使用的超中性管的体积：使用至少半路填充管子但不超过管的最大体积的体积。
- 在最后离心/清洗步骤中，在 200 μl 的 50 mM 磷酸钠缓冲器（pH 4.9）中重新悬念样品。此体积可根据样本中的多肽罐量进行调整，并可能取决于物种。如果以前曾发布过关于感兴趣物种的 HPLC 分析报告，则可以根据这些量值来估计此卷（可以在参考7的补充信息中找到 HPLC PG 研究的汇编）。对于其他物种，囊素准备可以执行到此步骤，然后可以添加不同数量的悬念量来复制样本，以确定允许PG留在解决方案中的最小体积（请参阅讨论以进一步估计）。如果样品中含有更多的多肽，增加悬念体积：如果样品几乎没有多肽，则将悬念体积减少到至少 50 μl。
- 将样品转移到 1.5 毫升管中，加入 1 毫克/毫升穆拉米达塞，最终浓度为 40 μg/ml。孵化 6-8 小时或在 37 °C 过夜。
4. 第3天 - UPLC样品的准备在最后一天进行
- 打开热块至100°C。 在没有 SDS 的情况下煮样品 5 分钟，以阻止穆拉米酶消化。在室温下，在 16，000 ×克处进行 10 分钟的离心取样，然后将超自然（多发性现在可溶性）转移到 13 mm x 100 mm 玻璃管中。尽量恢复超自然，非常接近颗粒，而不会干扰它。
- 通过在样品中加入 500 mM 玻酸盐缓冲区 （pH 9） 来调整 pH，最终浓度为 100 mM 玻酸盐缓冲区。玻酸盐缓冲器与减少剂氢化钠兼容。加入1-2粒氢化钠，以减少每个样品，让反应在室温下进行至少30分钟。注意：氢化钠具有高度反应性和危险性 - 避免与皮肤接触（戴手套），避免与眼睛接触（戴安全眼镜）。
- 将样品调整到 pH 3-4（多肽等电点为 +3.5），使用 20 μl 增量使用 50% v/v 正磷酸，直到 pH 6，用 pH 指示纸测量，然后使用 2 μl 增量。注意：正磷酸具有腐蚀性和危险性 - 避免接触皮肤（戴手套），避免与眼睛接触（戴安全眼镜）。样品应冒泡，以响应添加矫形磷酸：当样品停止冒泡时，这通常表示已达到 6 的 pH。如果样品中未发生冒泡，这可能表明添加的氢氢钠量太小。在这种情况下，停止降低pH，小心地加入一两粒氢化钠，让反应5-10分钟，然后恢复pH调整。
- 通过 0.22μm 注射器过滤器将样品直接过滤到 UPLC 小瓶中。如果沉淀物已经形成，在过滤前，通过火焰多次加热管子。如果样品不会在一天内注入 UPLC 仪器，请在 -20 °C 处冷冻过夜。样品可储存长达一年-80°C。 样品可以通过多次通过火焰解冻。
- 将每个样品的 10μl 注入配备 C18 1.7 μm 反向相列的 UPLC 仪器和一个吸收探测器，以监测 202-208 nm。样品按顺序注射，但自动采样器功能允许多达 96 个样品分批处理。使用 50 mM 磷酸钠 （pH 4.35） + 0.4% v/v 钠 azide 溶剂 A， 和 75 mM 磷酸钠 （pH 4.95） + 15% v/v 甲醇溶剂 B. 注： 添加阿齐德钠以补偿甲醇的 205 nm 吸收， 以避免基线漂移。将流量设置为 0.25 毫升/分钟，并在 25 分钟内使用线性梯度，在 30 分钟内实现 100% 溶剂 B 和粘液肽的连续弹性。如果质谱学将用于描述 UPLC 之后的多发性，则收集分数收集器中感兴趣的峰值分数，并使用离心蒸发器干燥分数。
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Representative Results
使用 图 1中概述的程序，最终样本应包含至少 200 μl 的清晰溶液，这些溶液已直接过滤到 UPLC 小瓶中（第 4.4 步）。在细菌样本中分离各种多发性肽的 UPLC 取决于它们在液体移动相和柱的静止阶段之间的相对溶解性。反向阶段C18柱提供强烈的疏水基质，根据疏水性和大小8分离多溴二苯甲酸酯物种：极性、低分子量的单体先阐明，后是极性、分子量较高的寡聚物（图2）。典型的 UPLC 结果显示在 图 2中，通过紫外线吸收在 202-208 nm 下检测，作为确定特定粘膜素保留时间的时间函数。这一具有代表性的结果表明，大多数粘膜肽物种之间具有清晰的分辨率，并且光谱上的强信号强度能够分析，并实现甘油链的平均长度。
图1中概述的最后一步包括调整pH和过滤任何可能堵塞 UPLC 中使用的管子小尺寸的细颗粒物。如果样品被超集中，例如，通过在第 3.5 步而不是 200 μ 中重新悬念 100μl 磷酸钠缓冲器，样本可能会变得多云，表明已经达到临界浓度，并且多发性沉淀。这种溶解度的丧失将导致第 4.4 步中使用的注射器过滤器堵塞，防止将多发性沉积到 UPLC 小瓶中，并/或堵塞 UPLC 机器导管和柱子，这些管道和柱子是昂贵的物品。反映这种异常样品处理的色谱图示例显示在图 3 中：没有峰值，导致没有任何PG组成数据。将pH数误判到远低于多兆丙肽等电点（例如，到pH2）的等电点，也可能导致多发性多发性沉淀，因此从 UPLC 分析中缺乏可辨别的峰值。
图1。萨库利准备的原理图。 此方法依赖于迭代的超浓缩，以净化 SDS 远离盆栽的萨库利。
图2。从 大肠杆 菌MG1655细胞中消化的PG的PLC色谱图的例子。 请注意，所有多肽的可比分辨率是在典型 HPLC 运行的 10% 的时间内实现的。木肽标签 - M = 单体， D = 更暗， T = 修剪器;（2，3，4，5） 表示氨基酸茎肽的数量：修改 - G = 甘氨酸取代 L - alanine ， L = 两个额外的氨基酸从普罗纳塞 E ， D = 3 ， 3 - 氨基丙酸（ DAP ） - DAP 跨桥， N = 终止氢 - 多肽。例如， D33DL 是一个具有 3aa 茎肽的更暗器，通过 DAP - DAP 跨桥连接，含有来自 Pronase E 的另外两种氨基酸。
图3。从 大肠杆菌 MG1655细胞消化的萨库利的不成功的PLC分析。 没有峰值，表明样品中不存在多头，是由于在提取到 UPLC 小瓶（第 4.4 步）之前，多发性虫会从溶液中崩溃。这种降水可能是由于多头的过度集中或pH度太低造成的。
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Discussion
此过程的关键步骤是样品准备第二天的第 3.1 步。如果 SDS 在一夜之间沉淀，或者样品在室温下储存在 4% SDS 中数周，则样品必须重新启动至少 1 小时才能重新溶解 SDS。SDS降水的一个常见原因是使用介质与钾盐，所以钾应避免在媒体，如果可能的话。如代表结果部分所述，将 pH 调整到多兆肽的等电点 （~3.5） 内也至关重要，但不要比 pH 3 低太多，否则材料可能会沉淀。最后，样品的再悬念必须发生在磷酸钠缓冲液（第3.5步）的适当体积中，这必须由研究人员进行判断。在选择磷酸钠缓冲液的悬念量时，重要的是要考虑特定细菌培养物可能产生多少粘液素材料。例如，如果最终培养量为 250 毫升（如上文所述），样品必须至少以 200 μl 磷酸钠缓冲器中重新发送。如果研究人员将方法修改为 50 毫升培养物，样品可以用 100μl 磷酸钠缓冲器或更少的缓冲剂进行再喷销。考虑一个物种中多肽的预测量也很重要：例如， 大肠杆菌 球菌含有的多肽多利坎（大约是野生大 肠杆菌 细胞10的7%），因此在100微克或更少的磷酸钠缓冲中暂停是适当的。如果难以将某些细菌物种或菌株大量（250毫升）生长，最终培养量可以减少，/或稀释过夜培养可以减少。最后，注入 HPLC 系统需要最小体积 200 μl，而 10 μl 对于 UPLC 系统来说就足够了。
通过改变 UPLC 仪器上的移动相、柱和梯度类型，可以调整不同生物体中 PG 组件的纯化或用于不同应用。基于溶剂的移动相（如血清三烯）可用于在质谱测量之前脱盐样品。不同的列化学也可能需要彻底脱盐样品进行后续分析。 图2 显示了Gram阴性棒状细菌 大肠杆 菌MG1655的常见洗脱轮廓：从革兰氏阳性细菌和/或具有其他形状的物种对PG的分析可能需要对步骤4.5中概述的梯度进行微调。虽然 UPLC 光谱（如图 2 中显示的光谱）会生成许多有关多肽的信息，例如多肽标识、交联百分比和甘油链长度，但该方法确实存在几个局限性，包括无法映射整个萨库利结构特征的空间分布。例如，无论是沿甘油链交叉的地点，还是通过 HPLC 或 UPLC 无法辨别绑定脂蛋白的位置。
与氨基酸分析12-14或纸相色谱15、16等传统技术相比，用HPLC分析PG的化学成分的优点包括分辨率更高、分析时间更短、定量准确等。UPLC 提供比 HPLC 更高的速度和灵敏度，因为更高的压力能够加快流量，从而缩短运行时间。由于亚2μm粒子大小柱、高采样率探测器和低容量喷油器能够承受非常高的压力，从而在高速17、18时准确工作，因此分辨率不会因 UPLC 而牺牲。这导致能够在几十分钟内分析 1μl 的样本量，而 HPLC 的样本量为 200 μl 和小时。
与 UPLC 相辅相成的技术包括通过质谱法进行多肽质量分析。UPLC不是一种破坏性的技术：在紫外线检测和干燥后，使用大多数实验室通常可用的离心蒸发器收集柱子中的高浓缩物。虽然样品可以脱盐，为质谱测量（步骤4.5）做好准备，但矩阵辅助激光脱硫/电传 - 飞行质谱学时间使分析对盐浓度19没有太大敏感性，并产生能够确定多发性分子质量数据。为 UPLC 准备一个细胞壁样品的成本约为 6-7 美元，包括酶、化学品和所用耗用品的成本。鉴于其廉价的运行成本、可访问性和对细菌细胞壁研究的实用性，UPLC 应成为整个细菌王国中高分辨率、高通量、精确定量多肽素成分的首选方法。
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Disclosures
本文的生产成本由沃特斯公司赞助。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院院长新创新奖DP2OD006466（对K.C.H.）的支持。 作者感谢罗素·蒙兹对方法的实际演示和科学的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
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