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Chemistry

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Le proteine antigelo (AFP) si legano a specifici piani di ghiaccio per prevenire o rallentare la crescita del ghiaccio. L'analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una modifica del metodo originale di incisione del ghiaccio per la determinazione dei piani di ghiaccio legati all'AFP. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente, incorporati in cristalli di ghiaccio singoli macroscopici e visualizzati sotto la luce UV.

Abstract

Le proteine antigelo (ARP) sono espresse in una varietà di organismi duri a freddo per prevenire o rallentare la crescita interna del ghiaccio. Gli ARP si legano a piani specifici di ghiaccio attraverso le loro superfici leganti il ghiaccio. L'analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una tecnica modificata utilizzata per determinare i piani di ghiaccio a cui si legano gli ARP. La FIPA si basa sul metodo originale di incisione del ghiaccio per determinare i piani di ghiaccio legati all'AFP. Produce immagini più chiare in un tempo sperimentale ridotto. Nell'analisi FIPA, gli ARP sono etichettati fluorescentmente con un tag chimerico o un colorante covalente, quindi lentamente incorporati in un cristallo di ghiaccio singolo macroscopico, che è stato preformato in un emisfero e orientato a determinare gli assi a e c. L'emisfero di ghiaccio legato all'AFP è stato visualizzato sotto la luce UV per visualizzare i piani legati all'AFP usando filtri per bloccare la luce non specifica. L'etichettatura fluorescente degli AFP consente il monitoraggio in tempo reale dell'adsorbimento AFP nel ghiaccio. È stato riscontrato che le etichette non influenzano i piani a cui si legano gli AFP. L'analisi FIPA introduce anche la possibilità di legare più di un AFP con tag diverso sullo stesso singolo cristallo di ghiaccio per aiutare a differenziare i loro piani di legame. Queste applicazioni della FIPA stanno contribuendo a far progredire la nostra comprensione di come gli AFP si legano al ghiaccio per fermare la sua crescita e perché molti organismi produttori di AFP esprimono più isoforme AFP.

Introduction

La produzione di proteine antigelo (AFP) è un importante meccanismo di sopravvivenza di alcuni organismi che vivono in ambienti carichi di ghiaccio. Fino a poco tempo fa, si pensava che l'unica funzione degli AFP fosse quella di prevenire o rallentare la crescita di cristalli di ghiaccio interni che avrebbero bloccato la circolazione, causato danni ai tessuti e stress osmotico. Gli organismi che non possono tollerare alcun grado di congelamento, come i pesci, esprimono ARP per inibire completamente la crescita dei cristalli dighiaccio 1. Altri, come l'erba, sono tolleranti al congelamento ed afps espliciti per inibire la ricristallizzazione del ghiaccio che riduce la formazione di grandi cristalli di ghiaccio nei lorotessuti 2. La stabilizzazione delle membrane a bassa temperatura è un'altra funzione suggerita per gli AFP3. Recentemente, è stato suggerito un nuovo ruolo per l'AFP di un batterio antartico, Marinomonas primoryensis, dai laghi salmastri ricoperti di ghiaccio4. Questo AFP fa parte di una proteina adessina molto piùgrande 5 che si pensa alleghi il batterio al ghiaccio per un migliore accesso all'ossigeno e ai nutrienti6. Altri microbi sono noti per secernore gli ARP, che potrebbero alterare la struttura del ghiaccio in cui vivono7.

Gli ARP sono stati trovati in alcuni pesci, insetti, piante, alghe, batteri, diatomee e funghi. Hanno sequenze e strutture notevolmente divergenti coerenti con la loro evoluzione da diversi progenitori in varie occasioni; eppure tutti si legano al ghiaccio e inibiscono la sua crescita con il meccanismo di adsorbimento-inibizione8. Gli ARP hanno ciascuno una superficie specifica che funge da sito di legame con il ghiaccio (IBS). Questi sono stati tipicamente identificati dalla mutagenesi site-directed dei residui superficiali9-11. Si ipotizza che l'IBS organizzi molecole d'acqua in uno schema simile al ghiaccio che corrisponde a specifici piani di ghiaccio. Così l'AFP forma il suo ligando prima di legarsiad esso 5, 12. I piani di ghiaccio possono essere definiti dai loro indici di Miller, e diversi ARP possono legarsi a piani diversi. Pertanto, il tipo I AFP dalla passera d'inverno si lega ai piani piramidali 20-2113, tipo III AFP lega sia il prisma primario che i piani piramidali utilizzando una superficie di legame del ghiacciocomposto 11,14, mentre il budworm abete rosso AFP, un AFP iperattivo, si lega contemporaneamente sia ai piani primario che basale15,16. Altri ARP iperattivi, come mpAFP, si legano a più piani di ghiaccio come dimostra la loro copertura completa di singoli emisferi di cristallo di ghiaccio5,17. Si ipotizza che la capacità degli AFP iperattivi di legare il piano basale, così come altri piani, possa tenere conto della loro attività 10 volte superiore rispetto agli AFP moderatamente attivi18. Sebbene l'efficienza degli AFP iperattivi sia ben documentata, la loro capacità di legarsi a più piani di ghiaccio non è ancora compresa.

Il metodo originale per determinare gli aerei di ghiaccio legati all'AFP è stato sviluppato da Charles Knight13,19. In questo metodo, un cristallo di ghiaccio singolo macroscopico è montato su un'asta metallica cava (dito freddo) e formato in un emisfero immergendolo in una tazza emisferica piena di acqua degassata. Quindi, l'emisfero viene immerso in una soluzione diluita di ARP e uno strato di ghiaccio viene coltivato dalla soluzione AFP sull'emisfero cristallino di ghiaccio per diverse ore controllato dalla temperatura del glicole etilenico che circola attraverso il dito freddo. Il cristallo di ghiaccio viene rimosso dalla soluzione, staccato dal dito freddo e posto in una stanza congelatore da -10 a -15 °C. La superficie viene raschiata con una lama affilata per rimuovere il film superficiale congelato della soluzione proteica antigelo e il cristallo di ghiaccio può sublimare per almeno 3 ore. Dopo la sublimazione, i piani di ghiaccio legati dagli ARP possono essere visti come modelli incisi bianchi derivati da proteine residue. L'emisfero di ghiaccio può essere orientato al suo asse ce a-assi, per localizzare i piani basali e prismaci del ghiaccio, e determinare gli indici di Miller delle macchie incise.

Qui descriviamo una modifica del metodo originale per determinare i piani di ghiaccio legati all'AFP, un metodo che definiamo affinità del piano di ghiaccio a base di fluorescenza (FIPA)11. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente con un tag chimerico, come la proteina fluorescente verde (GFP)11,16,17,20, o con un colorante fluorescente legato covalentemente all'AFP5,21. Gli AFP etichettati fluorescentmente sono adsorbiti in un singolo cristallo di ghiaccio e ricoperti dalla stessa procedura sperimentale degli esperimenti originali di incisione del ghiaccio. L'estensione del legame AFP con l'emisfero di ghiaccio in crescita può essere monitorata durante l'esperimento utilizzando una lampada ultravioletta (UV). Al termine dell'esperimento, l'emisfero può essere tolto direttamente dal dito freddo e immaginato, senza sublimazione. Tuttavia, se lo si desidera, l'emisfero può essere lasciato sublimare per visualizzare un'incisione di ghiaccio tradizionale. Le modifiche introdotte alla metodologia FIPA accorciano di diverse ore il tradizionale protocollo di incisione del ghiaccio. Inoltre, c'è il potenziale per l'imaging simultaneo di diversi AFP, ognuno con un'etichetta fluorescente diversa, per visualizzare i modelli sovrapposti dei piani di ghiaccio legati all'AFP.

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Protocol

1. Cristalli di ghiaccio singoli in crescita

  1. Prendi una padella metallica pulita (15 cm di diametro, alta 4,5 cm) che si adatta e può galleggiare su un bagno di raffreddamento del glicole etilenico.
  2. Preparare stampi cilindrici in cloruro di polivinile (PVC), (diametro 4,5 cm, alto 3-4 cm, spessore 4 mm), segando sezioni da un tubo.
    1. Tagliare una tacca (1 mm di larghezza, 2 mm di altezza) su un lato (Figura 1A).
    2. Preparare tutti gli stampi che possono adattarsi comodamente alla padella (Figura 1B).
      Nota: Uno studio ha dimostrato che l'alcol polivinilico (PVA) può influenzare la nucleazione delghiaccio 22. Tuttavia, nel nostro sistema in PVC a stampo aperto non abbiamo riscontrato problemi di formazione di ghiaccio atipici.
  3. Applicare una pellicola leggera di grasso sottovuoto sull'anello superficiale inferiore di ogni stampo, che è la superficie con la tacca ritagliata. Sigillare questa superficie unta e dentellata su una padella metallica con le tacche orientate lontano dal centro della padella. Fare attenzione a non riempire o ostruire le tacche con grasso.
  4. Aggiungere acqua filtrata e degassata/deionizzata da 0,22 μm al centro della padella, ma al di fuori degli stampi, e lasciare che l'acqua entri lentamente negli stampi attraverso le tacche. Fare attenzione a non introdurre bolle. Lo strato d'acqua dovrebbe essere profondo circa 5 mm.
  5. Mettere la padella in un bagno di glicole etilenico a temperatura controllata raffreddato a -0,5 °C. La padella dovrebbe essere perfettamente livellata. Aggiungere pesi di zavorra ai lati della padella, se necessario.
  6. Dopo che la padella e l'acqua hanno raggiunto -0,5 °C, aggiungere un piccolo pezzo di ghiaccio al centro della padella, al di fuori degli stampi.
    1. Ciò nucleerà la crescita del ghiaccio nell'acqua superraffredata attraverso la padella e negli stampi. La piccola tacca nella parte inferiore di ogni stampo consente a un solo cristallo di ghiaccio di propagarsi, risultando in un singolo cristallo di ghiaccio in ogni stampo.
    2. Incubare durante la notte per formare uno strato di ghiaccio.
  7. Nei tre giorni successivi aggiungere 13 ml di acqua degassata/deionizzata a 4 °C a ciascuno stampo una volta al giorno e far scendere la temperatura del bagno di glicole etilenico dopo ogni aggiunta a -0,8 °C il primo giorno, a -1,1 °C il secondo giorno e a -1,5 °C il terzo giorno.
    1. Incubare a quelle temperature durante la notte.
    2. Entro il quarto giorno, gli stampi dovrebbero essere completamente riempiti di ghiaccio.
  8. Estrarre gli stampi dalla padella, spingere i cristalli di ghiaccio fuori dai stampi e conservare su una superficie pulita, come una barca di pesatura, in un congelatore a -20 °C per circa 1 ora prima della manipolazione.
  9. Piuttosto che preparare molti piccoli cristalli di ghiaccio singoli, un grande cristallo di ghiaccio singolo di diversi litri di volume può essere preparato in un incubatore di temperatura costante come descritto da Knight23. Il grande cristallo di ghiaccio può essere conservato per un anno o più se conservato coperto in un congelatore da -15 a -20 °C. Porzioni di singolo cristallo possono essere tagliate dal blocco di ghiaccio con una sega come richiesto.

2. Determinare la singolarità e l'orientamento del cristallo di ghiaccio

  1. Determinare se il ghiaccio espulso dallo stampo è un singolo cristallo osservando in una stanza congelatore, tra due polaroid incrociate (Figura 1D).
    1. Se il cristallo di ghiaccio è singolo, allora non dovrebbero essere viste crepe o discontinuità e la direzione della luce non dovrebbe cambiare all'interno del cristallo di ghiaccio.
      Nota: se una stanza congelatore non è disponibile, è possibile utilizzare una cella frigorifera in tutti i passaggi richiesti, essendo cauti nel lavorare rapidamente e gestire il ghiaccio con parsimonioso.
  2. A causa della birifrangenza del ghiaccio, si può determinare l'orientamento dell'asse callo stesso tempo. Utilizzare le informazioni seguenti per determinare l'orientamento:
    1. Quando l'asse cè esattamente parallelo alla luce incidente, in teoria, nessuna luce passerà attraverso le polaroid incrociate. Se la luce incidente è leggermente in titolato dal parallelo con l'asse c,uno spettro uniforme di luce multicolore viene trasmesso attraverso il cristallo quando viene ruotato tra le polaroid incrociate. Questa trasmissione uniforme deriva dall'inattività ottica del ghiaccio Ih lungo il suo asse c24. Il piano basale del cristallo di ghiaccio è normale all'asse c.
    2. Quando l'asse cè più lontano dal parallelo alla luce incidente e il cristallo di ghiaccio viene ruotato tra le polaroid incrociate, la luce trasmessa si alternerà tra lo 0 e il 100% di trasmittanza con ogni 90° di rotazione del cristallo.
    3. Più comunemente, l'asse csarà normale al piano circolare del cristallo di ghiaccio cilindrico.
  3. Determinare l'orientamento delle asce Amettendo il ghiaccio25 che viene fatto avvolgendo saldamente il cristallo di ghiaccio in un foglio di alluminio, frugando un piccolo foro con un ago attraverso il foglio nel ghiaccio sul piano basale (normale all'asse c)e posizionandolo sotto vuoto per 20 minuti.
    1. Questo trattamento produrrà un'incisione con simmetria esagonale sul piano basale, dove gli assi aattraversano i vertici della stella a sei lati (Figura 2A).
    2. Se lo si desidera, il cristallo di ghiaccio può essere tagliato con una sega parallela o perpendicolare a un lato dell'esagono per montarlo con un piano prisma primario o secondario perpendicolare al dito freddo, rispettivamente (Figura 3).

3. Adsorbimento di proteine antigelo etichettate fluorescentmente in un singolo cristallo di ghiaccio

  1. Montare un singolo cristallo di ghiaccio sul dito freddo (Figura 1C) annoiando prima una cavità nella parte superiore del cristallo. Per fare questo, alternare lo scioglimento del ghiaccio con due aste di alluminio di diametro leggermente diverso, ma simili al diametro del dito freddo, per formare la cavità in cui il dito freddo può adattarsi.
  2. Raffreddare il dito freddo a -0,5 °C, posizionare nella cavità del ghiaccio e tenere il cristallo di ghiaccio in posizione fino a quando non si congela al metallo (Figura 2B). Evitare bolle d'aria quando si attacca il cristallo al dito in quanto ostacolano un efficiente trasferimento di calore dal dito all'asta.
  3. Riempire una tazza emisferica che è circa il doppio del diametro del cristallo di ghiaccio con acqua o tampone deionizzato filtrato, raffreddato a circa 4 °C. Immergere il cristallo di ghiaccio freddo legato alle dita nella tazza e rimuovere l'acqua in eccesso o il tampone in modo che la parte superiore del cristallo di ghiaccio sia approssimativamente livellata con lo strato liquido e il ghiaccio non tocchi le pareti della tazza.
    1. Coprire la tazza con isolamento e abbassare la temperatura a -5 °C.
    2. Attendere circa 1 ora affinché il cristallo di ghiaccio si fori in un emisfero, controllandone lo stato approssimativamente ogni 20 minuti (Figura 2C).
    3. Il ghiaccio prenderà la forma della tazza emisferica sciogliendo e coltivando il cristallo di ghiaccio, ma non dovrebbe mai crescere troppo per toccare le pareti della tazza. Ci dovrebbe essere almeno uno spazio di 1 cm tra la parete e l'emisfero e il dito freddo non dovrebbe sporgere dal ghiaccio.
  4. Rimuovere la tazza dal cristallo di ghiaccio e aggiungere la soluzione proteica fluorescente ad un volume finale di 25-30 ml e alla concentrazione di analisi desiderata, facendo attenzione a mantenere invariato il volume totale del liquido nella tazza. Una concentrazione tipica di AFP è di 0,1 mg/ml.
    1. Riemergere il cristallo di ghiaccio nella tazza in modo che la parte superiore del cristallo di ghiaccio sia a livello del liquido e il cristallo di ghiaccio non tocchi le pareti della tazza (Figura 2D).
    2. Far scendere la temperatura fredda delle dita a -8 °C e lasciare congelare la soluzione proteica nel cristallo di ghiaccio per 2-3 ore, mescolando spesso la soluzione. Il ghiaccio formato dalla soluzione proteica dovrebbe essere di almeno 5 mm prima di fermare la crescita del ghiaccio.
  5. Rimuovere il cristallo di ghiaccio dalla tazza mentre è ancora attaccato al dito freddo. Staccare il ghiaccio da quest'ultimo riscaldando il refrigerante attraverso il dito freddo a poco sopra 0 °C e attendere che il cristallo di ghiaccio si sciolga.
  6. Posizionare il lato cristallino piatto su una superficie pulita, ad esempio un piatto di pesatura, facendo attenzione a non toccare il ghiaccio appena formato e conservare a -20 °C per almeno 20 minuti prima della consegna.

4. Visualizzazione di piani di ghiaccio legati alle proteine antigelo

  1. La visualizzazione della fluorescenza viene effettuata in un congelatore oscurato o in una cella frigorifera, posizionando il lato piatto del cristallo di ghiaccio sotto le lampade con filtri di eccitazione specifici della lunghezza d'onda per eccitare l'etichetta fluorescente e i filtri di emissione della fotocamera per bloccare qualsiasi altra luce non specifica. In base al modello, i piani di ghiaccio associati dagli ARP possono essere stimati (Figura 4).
  2. Se non sono disponibili luci specifiche della lunghezza d'onda, è possibile utilizzare una scatola di luce UV.
  3. Gli estasi di ghiaccio tradizionali possono anche essere eseguiti semplicemente permettendo all'emisfero di ghiaccio di sublimare a -20 °C per almeno 3 ore, dopo di che la polvere proteica residua può diventare visibile sulla superficie del ghiaccio (Figura 5).
  4. Il passaggio 2.3 può essere ripetuto per determinare l'orientamento degli assi adell'emisfero di ghiaccio completato.

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Representative Results

La preparazione e il montaggio del singolo cristallo di ghiaccio sono i due passaggi della procedura FIPA in cui gli errori sono più comunemente commessi. Determinare se il cristallo di ghiaccio preparato è singolo viene eseguito esaminandolo attraverso polaroid incrociate (Figura 1D),come descritto nel passaggio 2.1 della sezione del protocollo. Se per l'analisi FIPA viene utilizzato un cristallo di ghiaccio multicristallino, il risultato sarà il legame discontinuo degli ARP sull'emisfero senza un modello di legame coerente (Figura 6B). Se le interfacce di cristallo di ghiaccio si trovano attorno ai piani di ghiaccio a cui l'AFP lega il risultato finale potrebbe non essere interpretabile. Per questo motivo, il cristallo di ghiaccio dovrebbe essere attentamente controllato per la singolarità prima di passare ai passaggi successivi. Per aumentare la probabilità di avere singoli cristalli di ghiaccio per l'analisi FIPA, molti dovrebbero essere fatti contemporaneamente.

Un altro errore comune è l'allineamento errato delle facce di cristallo con il dito freddo durante il montaggio. Per montare le facce primarie o secondarie del prisma perpendicolari al dito freddo, il singolo cristallo di ghiaccio deve prima essere orientato mediante pitting del ghiaccio, quindi tagliato in base all'orientamento dell'incisione a forma di stella (Figure 2A e 3),come delineato nel passaggio 2.3 della sezione del protocollo. Se il cristallo di ghiaccio è montato disallineato, il risultato finale produrrà un emisfero in cui l'equatore dell'emisfero non si allinea con la simmetria dei piani di ghiaccio (Figura 6C). Sebbene questo sia un risultato interpretabile, sarà meno informativo di un cristallo di ghiaccio correttamente allineato poiché la più grande circonferenza dell'emisfero è all'equatore (Figura 4).

Figure 1
Figura 1. Attrezzature per la coltivazione e il montaggio di cristalli di ghiaccio singoli. A)Stampi in PVC. B)Pan in bagno di glicole etilenico con stampi in PVC. C) Dito freddo con flusso di glicole etilenico mostrato dalla freccia bianca. La linea tratteggiata bianca indica la parete interna del dito freddo. D) Diagramma delle polaroid incrociate per orientare un singolo cristallo di ghiaccio. La sorgente luminosa è gialla, le polaroid incrociate sono grigie e il singolo cristallo di ghiaccio è bianco. Sono indicati l'orientamento delle polaroid (frecce grigie) e l'orientamento del cristallo di ghiaccio (frecce rosse). Da sinistra a destra il cristallo di ghiaccio è orientato in modo tale che l'asse csia perpendicolare alla polaroid inferiore, 45° alla polaroid inferiore e parallelo alla luce incidente. La luce che passa attraverso le polaroid incrociate e il ghiaccio apparirà scura, leggera o debolmente multicolore attraverso la polaroid superiore a seconda dell'orientamento del cristallo di ghiaccio. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figure 2
Figura 2. Preparazione del cristallo di ghiaccio per la FIPA. A) Determinazione degli orientamenti degli assi mediante incisione di ghiaccio con simmetria esagonale. Il piano basale del cristallo è parallelo al piano della pagina. B)Montaggio del singolo cristallo di ghiaccio sul dito freddo. C) Ghiaccio dopo essersi formato nell'emisfero. D)Emisfero di ghiaccio immerso in una tazza emisferica piena di soluzione proteica. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figure 3
Figura 3. Montaggio del cristallo di ghiaccio in base all'orientamento. A) Diagramma del montaggio del ghiaccio con (i) il piano basale, (ii) un piano prismatico primario e (iii) un piano prismatico secondario perpendicolare al dito freddo. Per gli orientamenti (ii) e iii) il cristallo di ghiaccio deve essere tagliato a metà, come mostrato nella figura. B) Risultati FIPA del Pacifico etichettato blu tipo III nfeAFP8 dopo il montaggio di cristalli di ghiaccio con (i) il piano basale e (ii) un piano prisma primario perpendicolare al dito freddo. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figure 4
Figura 4. Interpretazione dei piani associati ad AFP dai risultati dell'analisi FIPA. A)Rappresentazione dei piani legatidel ghiaccio; e B) il risultato corrispondente dell'analisi FIPA quando il singolo cristallo di ghiaccio è montato con un piano prisma primario perpendicolare al dito freddo. I pannelli rappresentano (i) piano basale, (ii) piano prisma primario, (iii) piano prisma secondario, (iv) piano piramidale allineato con gli assi ae (v) piano piramidale sfalsato agli assi a. C) Morfologia di un singolo cristallo di ghiaccio quando coltivato in soluzione di ARP che legano piani piramidali i) allineati agli assi ae ii) sfalsati dagli assi a. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figure 5
Figura 5. Confronto tra gli eschi glaciali tradizionali e la FIPA. A)L'incisione tradizionale di tipo I AFP (ISOFORM HPLC6) prodotta dalla passera d'inverno (Pseudopleuronectes americanus) è mostrata come originariamente prodotta da Knight et al., (1991). ii) La corrispondente analisi FIPA della stessa proteina etichettata con TRITC. B)(i) Incisione tradizionale di un mutante quadruplo IBS (V9Q/V19L/G20V/I41V) di tipo III nfeAFP11 (dal giapponese eel pout Zoarces elongatuskner)21. ii) La corrispondente analisi FIPA della stessa proteina etichettata con TRITC. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figure 6
Figura 6. Emisferi risultanti da comuni errori di analisi FIPA. Le analisi sono state condotte su HPLC12-A16H con tag GFP di tipo III. A) Un risultato FIPA ottimale per il confronto. Il cristallo di ghiaccio era montato con il suo piano prisma primario perpendicolare al dito freddo. B)Analisi FIPA che è stata condotta inavvertitamente utilizzando un emisfero di ghiaccio composto da più di un cristallo. C)Analisi FIPA condotta su un cristallo di ghiaccio singolo disallineato. Il piano prisma secondario non era montato esattamente perpendicolarmente al dito freddo. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figure 7
Figura 7. Utilizzo dell'analisi FIPA per confrontare i modelli di legame del ghiaccio di diversi AFP. Pacific blue-labeled tipo III nfeAFP8 è stato combinato con TRITC-labeled tipo I AFP ed è stata condotta una singola analisi FIPA. A) Visualizzazione solo di tipo III nfeAFP8. B)Visualizzazione solo di tipo I AFP. C) Visualizzazione di tipo III nfeAFP8 e tipo I AFP insieme. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figure 8
Figura 8. FIPA di AMP moderatamente attivi e iperattivi. A)analisi FIPA di tre diversi ARP di pesce moderatamente attivi; (i) Tipo I AFP (isoforma HPLC6, Pseudopleuronectes americanus),(ii) Tipo II AFP con etichetta TRITC(isoforma indipendente da Ca2+, Longsnout poacher),(iii) Tipo III AFP con etichetta blu pacifico (isoforma nfeAFP8, Zoarces elongatuskner). B)analisi FIPA di tre diversi AFP iperattivi; ( i) MpAFP_RIV con etichetta GFP (Marinomonas primoryensis), (ii) sbwAFP con etichetta TRITC (Choristoneura fumiferana), (iii) TmAFP (Tenebrio molitor)con tag GFP . In tutte le immagini, l'asse cè perpendicolare al piano della pagina. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figure 9
Figura 9. Relazione del modello fluorescente prodotto dall'analisi FIPA con la morfologia dei cristalli di ghiaccio di diversi isoformi e mutanti AFP di tipo III11,21. A)(i) Analisi FIPA del QAE-A16H con tag GFP. ( ii) Morfologia dei cristalli di ghiaccio prodotta da QAE-A16H. B)(i) Analisi FIPA di nfeAFP11-V9Q con etichetta TRITC. (ii) Morfologia dei cristalli di ghiaccio prodotta da nfeAFP11-V9Q. C)(i) Analisi FIPA di nfeAFP11 con etichetta TRITC. ( ii) Morfologia dei cristalli di ghiaccio prodotta da nfeAFP11 di tipo selvatico. D)(i) Analisi FIPA di nfeAFP6 con etichetta TRITC. ( ii) Morfologia dei cristalli di ghiaccio prodotta da nfeAFP6 di tipo selvatico. Gliorientamenti dell'asse C e le barre di scala sono come indicato. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

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Discussion

Sviluppo del metodo di incisione del ghiaccio da parte di Charles Knight per la determinazione di aerei di ghiaccio legati all'AFP studi molto avanzati sul meccanismo di legame del ghiaccio da parte degli ARP. Mentre le strutture degli ARP potevano essere risolte con la cristallografia a raggi X26,27, non c'era un metodo ovvio per dedurre la superficie complementare sul ghiaccio a cui l'AFP si legava. Quando il tipo I AFP dalla passera d'inverno è stato inizialmente caratterizzato, è stato ipotizzato di legarsi ai piani prisma primari del ghiaccio28. Tuttavia, gli esperimenti rivoluzionari di Knight sull'incisione sul ghiaccio di tipo I AFP hanno dimostrato che si legano a piani piramidali di ghiaccio13. Questo risultato ha stimolato la comunità di ricerca AFP a ripensare il meccanismo del legame di ghiaccio AFP e determinare più accuratamente la faccia legatura del ghiaccio degli AFP9. Gli esperimenti originali di Knight sull'incisione del ghiaccio furono fatti usando ARP nativi purificati dagli organismi produttori di AFP. Con lo sviluppo di AFP ricombinanti e il crescente uso di tag GFP, c'è stata l'opportunità di espandere questi studi a molti altri AFP29.

L'idea di incorporare coloranti proteici fluorescenti covalenti, come la tetrametillrhodamina-5-(e 6)-isotiocianato (TRITC), nell'analisi è arrivata solo dopo il successo delle analisi FIPA AFP fuse dalla GFP11. Le etichette delle proteine fluorescenti chimeriche e le modifiche chimiche da parte dei coloranti covalenti non influiscono sui modelli di legame del ghiaccio degli ARP (Figura 5). Con il primo, la GFP è fusa alle estremità terminali N o C degli AFP, che sono spesso ben rimosse dall'IBS. Inoltre, è possibile inserire un linker flessibile tra la GFP e l'AFP che consente di allontanare il tag dalla superficie del ghiaccio. Con quest'ultima strategia di etichettatura, le catene laterali cariche che reagiscono con i coloranti covalenti sono solitamente su superfici lontane dall'IBS. Se le strategie qui presentate per l'etichettatura fluorescente degli AFP non funzionano, l'introduzione di una cisteina lontano dall'IBS per la reazione con coloranti tiolo-reattivi èun'altra opzione 30. Adottando misure per garantire che le etichette fluorescenti non influenzino il legame del ghiaccio AFP, come giudicato dall'attività di isteresi termica e dalla morfologia dei cristalli di ghiaccio, siamo fiduciosi che l'analisi FIPA mostri una vera rappresentazione dei modelli di legame del ghiaccio AFP, come ha fatto nel metodo originale di incisione del ghiaccio.

Ci sono diversi vantaggi nell'etichettatura fluorescente degli ARP per l'analisi FIPA. È necessario meno tempo per la procedura poiché non è necessaria la sublimazione del ghiaccio per la visualizzazione dei piani legati all'AFP. L'incorporazione di proteine etichettate nell'emisfero può essere monitorata durante la crescita del ghiaccio per valutare il completamento sperimentale e il modello di legame AFP può essere registrato in qualsiasi momento. Ciò impedisce esperimenti inutilmente lunghi o il completamento prematuro della crescita del ghiaccio. L'etichettatura fluorescente consente una visualizzazione più chiara del modello di associazione AFP rispetto al passato con l'incisione, come si vede nel confronto dei risultati di entrambi i metodi applicati agli AFP di tipo I e III (Figura 5). Tuttavia, un'incisione di ghiaccio post-FIPA può essere facilmente condotta posizionando l'emisfero in un congelatore per diverse ore, il che significa che entrambe le analisi possono essere effettuate sullo stesso campione poiché sono necessarie concentrazioni AFP simili per entrambi i metodi. Un vantaggio prezioso della FIPA è la possibilità di visualizzare più di un AFP con etichetta diversa nello stesso emisfero di ghiaccio (Figura 7). Questo è utile per illustrare le differenze nei piani di legame del ghiaccio AFP visti con diversi tipi DI AFP, isoforme e mutanti di attività.

L'analisi FIPA è già stata utilizzata in diversi studi AFP. È stato utilizzato per supportare l'ipotesi che il legame del piano basale sia unico per gli AFP iperattivi e necessario per la loro altaattività 18. Si è scoperto che gli ARP moderatamente attivi non legano il piano basale (Figura 8A), ma molti AFP iperattivi coprono completamente l'emisfero di ghiaccio, incluso il piano basale del ghiaccio (Figura 8B)5,20,31. L'analisi FIPA è stata utilizzata anche per studiare la funzione di specifici residui leganti il ghiaccio. Ad esempio, l'analisi FIPA è stata condotta su diverse isoforme e mutanti di tipo III, alcuni dei quali impediscono la crescita del ghiaccio, e alcuni dei quali sono stati trovati per modellare sologhiaccio 11,21,32. Dagli studi è stato riscontrato che particolari residui sono importanti per l'incorporazione degli ARP nel ghiaccio e altri sono importanti nella specificità del piano di ghiaccio (figura 9).

Altri metodi per studiare i modelli di legame AFP su singoli cristalli di ghiaccio includono l'osservazione diretta mediante microscopia a fluorescenza16,33 e microfluidica34. Questi metodi hanno il vantaggio della sensibilità alla dinamica dell'attacco dell'AFP al ghiaccio e del monitoraggio della simultaneità di modellazione del ghiaccio con l'affinità dell'AFP con il ghiaccio, ma sono meno robusti rispetto al metodo FIPA nel determinare l'affinità con i piani di ghiaccio. La dinamica molecolare viene utilizzata anche per prevedere la specificità di legame ghiaccio-piano degli ARP12,20,21,30,35. Utilizzando l'analisi FIPA, insieme alle altre tecniche disponibili, stiamo imparando i modelli di legame ghiaccio-piano di ogni AFPs, l'importanza della composizione dell'IBS nella selezione dei piani di ghiaccio e come il legame di piani specifici sia correlato all'attività AFP.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Acknowledgments

PLD detiene la Canada Research Chair in Ingegneria proteica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research alla PLD. Questo lavoro è stato anche supportato da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (n. 23310171) e del Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Siamo grati ai dottori Chris Marshall e Mike Kuiper per il lavoro pionieristico che ha portato alla FIPA. Siamo anche grati al Dr. Sakae Tsuda per aver fornito strutture per parte di questo lavoro e al Dr. Laurie Graham per aver istituito i filtri per l'eccitazione della luce fluorescente e le emissioni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

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References

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Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza
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Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

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