Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

doi: 10.3791/51195 Published: August 21, 2014

Summary

Rejeneratif uygulamalar için idealdir insan iskelet kası liman birkaç çok-soy öncü nüfus içindeki kan damarları. Intima gelen Miyojenik endotel hücreleri, medya perisitler ve adventisyanın gelen adventisyal hücreler: Bu izolasyon yöntemi, kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla üç multipotent öncü hücre popülasyonlarının eşzamanlı arınma sağlar.

Abstract

Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH) keşfinden beri, yerli kimliği ve MKH'lerin yerelleştirme kültürü retrospektif izolasyon örtülü durumdadır. Son zamanlarda, floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanılmasıyla, ve diğer araştırmacılar, ileriye dönük, insan iskelet kası ve damar sistemi ile bağlantılı multipotent öncü hücrelerinin üç alt-popülasyonunu tespit ve saflaştırıldı. Bu üç hücre popülasyonları: intima, media ve adventisya: Miyojenik endotel hücreleri (MECler), perisitler (PC'ler) ve adventisyal hücreleri (ACs), kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla lokalize. Bu insan kan-damar kaynaklı kök hücre (hBVSC) Tüm klasik MSC işaretleri ifade ama aynı zamanda tipik MSC'Iere benzer mezodermal gelişim potansiyelleri sahip nüfusun, sadece. Daha önce, MECler, PC'ler ve Klimalar farklı protokoller yoluyla izole edilmiştir ve daha sonra ayrı çalışmada karakterize. Geçerli izolasyon protocol, seçici hücre yüzey belirteçleri içinde izolasyon sürecine değişiklikler ve ayarlamalar yaparak, bize aynı anda tek bir insan kas biyopsisi ile FACS tarafından üç hBVSC subpopülasyonunun arındırmak için izin verir. Bu yeni yöntem, sadece birden BVSC alt popülasyonlarının izolasyonu düzene değil, aynı zamanda farklı tedavi amaçlı hBVSCs gelecekte klinik uygulamalarını kolaylaştırmak değil.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Insan iskelet kası kök / projenitör hücrelerin klinik cazip bir kaynak olarak kabul edilmiştir. İskelet kası sadece uydu hücreleri ve kas elde edilen kök hücreler (MDSCs) 1 olmak üzere miyogenik atalarıdır, iskelet miyoblastları, aynı zamanda ilkel miyogenik kök hücreleri, taahhüt değil içerir. Rejeneratif tıpta insan kas türetilmiş kök / projenitör hücrelerinin otolog veya allojenik, geniş kullanım alanı, klinik öncesi hayvan modellerinde hem de klinik çalışmalarda araştırılmıştır. Kas kök / progenitör hücrelerin rejeneratif uygulamaları kalp krizi hastalarında yaralı kalbi tamir etmek Duchenne müsküler distrofi (DMD) hastalarda distrofik kas yenileyici arasında değişir.

Kemik iliğinden elde edilen multipotent yetişkin projenitör hücreler (MAPCs) ve yağ elde edilen kök hücreleri (ADSCs), yetişkin kök / dahil olmak üzere mezenşimal kök / stromal hücreleri (MSC'ler) ve diğer multipotent öncü hücre popülasyonlarının keşfinden beriprogenitör hücreler yoğun tarihinden 1-9 kadar incelenmiştir. Bununla birlikte, yerinde onların yerli kimliği ve yerelleştirme retrospektif izolasyon yöntemleri örtülü durumdadır. Son zamanlarda, sıralama floresan-aktive edilmiş hücre (FACS) kullanılmasıyla, ve diğer gruplar tanımlanır ve ileriye dönük olan kan, insan iskelet kası içindeki gemiler ve çok sayıda başka organlardan izole edilebilen saf hale multipotent öncü hücre popülasyonları: kas kaynaklı endotel hücreleri (MECler), perisitlerin (PC), ve adventisyal hücreleri (Klimalar) 10. Intima tabakasında, tunika medya ve tunika adventitianın: insan kan damarı türetilmiş kök hücreler (hBVSCs) Bu üç alt-popülasyonları bulunduğunu sırasıyla kan damarlarının üç yapısal tabakalar bulunabilir. Klimalar geniş arter ve venlerin adventita tabakasında lokalize ise daha spesifik, MECler ve PC'ler kılcal kılcal tespit edilir. (C MECS: Her öncül hücre alt hücre yüzey antijenleri benzersiz bir bileşimini ifadeD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC'ler (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) ve Klimalar (CD34 + / - 31/45 - / 56 - / 146 -).

Bu hBVSC altkümenin ileri karakterizasyonu üç öncü hücre popülasyonları iskelet Miyogenesis, osteogenezi, kondrogenez ve adipogenesis dahil tipik MKH'lerin, benzer mezodermal gelişim potansiyelleri sahip olduğunu ortaya koydu. Tüm hBVSC alt kümeler CD44, CD73, CD90 ve CD105, taze ve kültür gibi klasik MSC belirteçler, sergilerler. Topluca bu kanıt parçaları MKH'lerin damar kökeni destekledi. Ayrıca, MECS, PC'ler ve komisyonlarda, terapötik kapasiteleri son zamanlarda ayrı çalışmalarda ortaya konmuştur. Yetişkin insan kas biyopsileri sıralanır MECler yaralı ve distrofik iskelet kasları ve onarım yaralı miyokardiyumu daha verimli iskelet miyoblastları ve vasküler endo yeniden gösterildiendotel hücreleri (EC). Farklı insan organlarından saflaştırılmış PC'ler de onarım / yaralı ve distrofik iskelet kasları yeniden ve uydu hücre havuzu 13-16 katkıda gösterilmiştir. Çok yakın bir zamanda, insan iskelet kasından türetilmiş PC'ler etkin dolaylı parakrin ve direkt hücresel etkileşimler 17 vasıtasıyla miyokard enfarktüsü tamir olduğunu göstermiştir. ACS, diğer taraftan, ya da olması ile doğrudan eksplante kan damarlarından izole edilebilir veya insan adipoz doku ve iskelet kası, FACS ile saflaştırılmıştır. Komisyonlarda, dikkate değer bir pro-anjiyojenik etkisi, fare arka kol veya bacak iskemisi-19 modelinde gösterilmiştir. Ayrıca, ACS iskemik doku tamirinde 20 ACS en güçlü terapötik potansiyelini gösteren daha etkin bir şekilde geleneksel bir MSC daha miyokard enfarktüsü onarmak için gösterilmiştir.

Eşzamanlı mevcut arıtma protokolü hibe, MECler, PC'ler prospektif saflaştırılması veTek bir insan iskelet kası biyopsisi vaskulatürden ACs. Bu bize çalışma ve / veya farklı terapötik amaçlar için uygun hBVSC subpopülasyonu seçim yapmanızı sağlar. Ayrıca, bu yeni teknik, ayrıca, rejeneratif tıp için multipotent öncü hücrelerin ideal bir kaynak yapma, insan iskelet kasından elde edilebilir kök / progenitör hücrelerin repertuar genişletir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Kas Biyopsi İşleme

  1. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı,% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş (DMEM) içinde buz üzerinde insan iskelet kası biyopsisi Koruma% 1 Penisilin-Streptomisin taşıma sırasında (P / S).
  2. Kas biyopsi alınmasından sonra, taşıma kabından örnek çıkarın ve steril şartlar altında% 2 antifungal antibiyotik solüsyon (A / A) ile doldurulmuş fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde iki kere yıkayın.
  3. 2% A / A ile takviye edilmiş DMEM içinde steril makas ve forsepsle bağlı yağ ve bağ doku çıkarın.
  4. Diseksiyon mikroskobu altında büyük kan damarları sökülmesi ve daha sonra küçük parçalar (boyut <1 cm2) içine, kas numune kesin.
  5. 20 mi muhafaza ortamında kesme kas parça (<5 gram) korumak (PM, DMEM,% 10 FBS ve% 1 P / S ile takviye edilmiş) kadar 5 gün boyunca 4 ℃ de.

2. Kas Dissociatiyonu ve Hücre İzolasyonu

  1. Hücre izolasyon gününde, PM kas parçaları kaldırmak ve PBS içinde iki kez yıkayın% 2 P / S ile desteklenmiş. Sindirim solüsyonu yapmak için, tip I, tip II ve tip IV kolajenazları taze PM halinde (100 mg / ml) ilave edilmektedir.
  2. Ince ince doğrayın ve çözüm hiçbir pıhtılaşması ile 10 ml serolojik pipet geçene kadar mekanik PM küçük bir miktar ile bir petri kabına steril makas ve forseps ile kas parçaları kıyma. Bu işlem sırasında kalan yağ ve bağ doku çıkarın. Yetişkin kas en az 8-10 gram ya da her bir hücre izolasyonu fetal kas 2 gram kullanın.
  3. 20 ml (veya 10 ml cenin kıyılmış kas 2 gram) 10 ml'lik bir pipet ile serolojik sindirim solüsyonunun kesitler kıyılır yetişkin kas 4-5 gram aktarın. 80 rpm - 70 ° C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de 60 dakika ℃ - 50 Digest. Buna göre miktarına bağlı olarak sindirim süresi ve / veya çalkalama hızının ayarlanmasıyla, hücre yüzey antijeni, verim ve koruma optimizedoku. Bulanıklık neredeyse silinene kadar sindirim durumunu her 15-20 dk gözlemleyin.
  4. Şiddetle sindirilmiş dokuya 10 ml serolojik pipet ile 3-5 kez pipetle. Reaksiyonu durdurmak ve daha sonra 4 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj PM eşit miktarda ekleyin.
  5. Dikkatlice süpernatant kaldırmak; yıkamak için 10 mL PM olarak pelet, ve daha sonra 100 um'lik bir hücre süzgecinden süzülmüştür.
  6. 4 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve dikkatle süpernatant kaldırmak. Eritrosit lisiz tamponu (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0,1mm EDTA), tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir 70 mikron hücre süzgecinden filtre ve daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe pelet tekrar. Herhangi bir yağış görülmektedir tekrar bir 70-m hücre süzgecinden Filtre.
  7. 4 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje ve 0.5 ml PBS içinde hücre pelletini. Hücrelerin sayısını. Hücre sıralama için en az 5.000.000 hücre toplam elde edilir. SINGL sulandırmakboyama için PBS ile ml başına en az 5.000.000 hücrelere e hücre süspansiyonu. Kontrol boyamalar için 11 tüpleri (lekesiz kontrolü, negatif kontroller ve tek renkli pozitif kontroller) içine hücre süspansiyonu ve bölünmüş 50-100 ul dışarı atın.

3. Hücre Etiketleme ve sıralama

  1. Gerekirse amacı bloke edilmesi için (PBS içinde 1:10 seyreltilmiş) fare serumu 4 ℃ de 10 dakika boyunca tek bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
  2. Tek bir hücre süspansiyonu içine (100 tüm 1) ve 4 ℃ de 20 dakika boyunca inkübe CD34-APC, CD45, APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144 PE-ve FITC-CD146 ekleyin. Negatif kontrol için, APC- APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE- ve FITC ile konjüge edilmiş antikor, IgG izotip eşdeğer konsantrasyonlarda ilave ediniz ve 4 ℃ de 20 dakika boyunca inkübe edin. Tek renkli Pozitif kontroller için, tek tek her bir tüp, CD34-APC, CD45, APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144 PE-ve FITC-CD146 eşdeğer konsantrasyonlarda eklenmesi ve 4 ℃ de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra, 4 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yıkayın. % 5 FBS ve% 1 P / S ilave 2 ml DMEM - 1 hücre pelletini. Hücre süspansiyonunun nihai konsantrasyonu, ml başına en az 5.000.000 hücre olmalıdır. 7-AAD (1: 100) ilave edilir ve ölü hücre çıkarılması için oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. Negatif kontrol ve tek renk ve pozitif kontrol,% 5 FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş 0.5 ml DMEM içinde tekrar süspansiyon hücre topaklar üretilir.
  4. Tüpler sitometri yuvarlak alt polistiren akışına bütün hücre süspansiyonları aktarın. (Her tüp önceden doldurulmuş uygun kültür ortamı 500 ul: MECS için MPM; EGM-2 PC'ler için; komisyonlarda için AC orta) hücre toplama tüpleri hazırlayın. Hücre sıralayıcı etmek için buz üzerinde Taşıma hücre süspansiyonları.
  5. Boyanmamış kontrol, negatif kontroller, tek renkli pozitif kontroller ve ana hücre süspansiyonu sırayla hücre sıralayıcı çalıştırın hücre süspansiyonları hücre s maksimize etmek için sıkı yolluk lazer yoğunluğu, kanal tazminat ve hücre popülasyonu ayarlarkenurity (vallahi ve akış detayları için diğer dergilerde sitometri tarafından yayınlanan makalelerine bakınız).
  6. Uygun toplama tüpleri istenilen hücre popülasyonları toplayın. 4 ℃ Mağaza, toplanan hücreler hemen ekim değilse.

4. Hücre Kültürü Post-sıralama

  1. Ile önceden kaplanmış plakalar üzerine MPM içinde <10.000 hücre / cm 2 taze kriteri MECS (P0) tohum tip-I kollajen. MECS sonraki geçiş için, 3.500 tohum - ile önceden kaplanmış plakalar / matara üzerine MPM 4,000 hücre / cm 2 tip-I kollajen.
  2. Taze% 0.2 jelatin ile kaplı plakalar üzerine EGM-2 <20.000 hücre / cm 2 taze kriteri PC'lerin (P0) Tohum. Bilgisayar ortamı içinde 3 oranında P2 kadar düzenli polistiren kültür levhaları üzerine aktarıldı (% 20 FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş DMEM): PC sonraki geçiş için, 1 hücrelerine ayrıldı. P3 yılından itibaren, tohum hücreleri 6,500 de - normal polistiren kültür plakaları / şişeleri üzerine PC ortamında 7,000 hücre / cm 2.
  3. Normal polistiren kültür plakaları üzerine (% 20 FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş DMEM) ortamı içinde ac <20,000 hücre / cm2 de taze kriteri ACs (P0) Tohum. Düzenli polistiren kültür plakaları / şişeleri üzerine AC ortamda 7,000 hücre / cm 2 - 6,500, sonraki komisyonlarda pasajlayarak, tohum hücreleri için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

FACS parametrelerinin ilk boyanmamış kontrol, negatif kontroller ve tek renkli pozitif kontrollerden elde edilen verilere dayalı düzeltilir. Ölü hücrelerin çıkarıldıktan sonra, floresan-etiketli hücre süspansiyonu, negatif ve pozitif hücresi yüzey işaretleyici bir dizi seçenek tabi tutulur. İlk olarak, CD45 + hücreleri, CD56 + ve CD56 önce kapılı - hücrelerin CD45 ayrılır - fraksiyonu. CD56 + CD34 +-fraksiyon CD144 seçimine tabi tutulur burada sadece CD34 + / + CD144 (çift pozitif) hücreleri MECler olarak işaretlenmiş (CD34 + / + 56/144 + / 45 -) ve ardından toplandı (Şekil 1). Benzer şekilde, CD56 - fraksiyonu, CD34, CD146-seçimine tabi tutulur burada sadece CD34 - / CD146 + adet olarak işaretlenmiş hücreleri (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) ve daha sonra, toplanan ( + / CD146 - fraksiyon ECS + / CD31 (CD34 + / CD31 +), ve sadece CD34 dışlamak için ek bir negatif CD31 seçime tabi tutulur - alt kümesidir komisyonlarda (CD34 olarak işaretlenmiş + / - 31/56 - / 45 - / 146 - koleksiyonu için) (Şekil 1). Işlemini kolaylaştırmak için, CD144 EK'lerden dışlanması için CD31 yerine kullanılabilir.

Taze hücreler kriteri daha fazla genişleme için, protokolde belirtilen kültür koşullarında tohumlanabilir veya in vivo deneyler için hemen kullanıldı. HBVSC alt-klonal genişleme FACS Aria autoclone sistemi ya da seyreltme yöntemi 13, 21 ile sınırlandırılmasıyla elde edilebilir. Tipik heterojen MKH'lerin aksine, hBVSC altkümelerin kültürleri hatta uzun vadeli genişleme sonrasında homojen kalır. Bir kas biyopsileri arındırılan kültürlü hBVSC altkümelerin Temsilcisi morfolojisi,tek bir verici, Şekil 2'de gösterilmiştir. tipik MKH'lerin ve saflaştırılmış hBVSC alt grupları arasındaki karşılaştırmalar Tablo 1'de özetlenmiştir.

Şekil 1
İnsan kan-damar kaynaklı kök hücreler tek bir insan iskelet kası biyopsisi dan (hBVSCs). Her kriteri hücre popülasyonunun Saflık içinde üç alt Şekil 1. Temsilcisi sıralama ileri post-sıralama analizi ile teyit edilir. bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.

Şekil 2
Homojenlik sıralanır Figure 2. üç hBVSC subpopülasyonunun, c farklı morfolojisi sergilendi(soldan sağa) ulture: Miyojenik endotel hücre (MEC), perisit (PC) ve adventisyal hücre (AC) (geçit 4, ölçek bar = 100 mm olarak). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

MKH MECler PC'ler Klimalar
Saflık Heterojen Homojen Homojen Homojen
Saflaştırılması için hücre yüzey antijeni profilin Kullanılamaz CD34 + CD56 + CD45- CD144 + CD31- CD34 + CD45- CD146-
Kültür MSC markör ifade CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 +
Multipotency Miyogenesis (+) adipogenesis (+) osteogenesis (+), kıkırdak doku (+) Miyogenesis (+) adipogenesis (+) osteogenesis (+), kıkırdak doku (+) Miyogenesis (+) adipogenesis (+) osteogenesis (+), kıkırdak doku (+) Miyogenesis (N / A) adipogenesis (+) Osteogenezi (+) kondrogenezis (+)
Potansiyel uygulamalar İskelet tamir / rejenerasyon: Kemik, kıkırdak, tendon, ligament ve İskelet kası; Kardiyak tamir; Vasküler tamir; Yara iyileşmesi; İmmünoregülasyon Kardiyak tamir; İskelet kas tamir / rejenerasyon; Kemik / kıkırdak tamir / yenilenmesi Kardiyak tamir; Vasküler tamir / rejenerasyon; İskelet kas tamir / rejenerasyon; Kemik rejenerasyonu Kardiyak tamir; Vasküler tamir / rejenerasyon; Kemik rejenerasyonu
In situ Anatomik lokalizasyon Kullanılamaz Kan damarı İntima Kan damarı Medya Kan damarı Adventitia

Tipik MKH'lerin ve multipotent hBVSC Altgrupları Tablo 1. Karşılaştırma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HBVSC alt popülasyonlarının belirlenmesi ve arıtma MSC ontogenezimizin anlama büyük bir ilerlemeyi temsil. MSC perivasküler kaynağını ve dokuya özel ön-madde hücreleri ve kan damarları, 22-25 arasındaki ilişkiyi gösteren gittikçe artan kanıtlar vardır. Buna ek olarak, daha fazla kapasite MSC heterojenlik ve vasküler hücre biyolojisi 26 anlaşılmasını yardımcı hBVSCs homojen bir yapıda yapıdadır izole etmek.

Son birkaç yıl içinde, MECler, PC'ler ve Klimalar bireysel tespit edilmiştir ve ayrı çalışmalarda farklı protokoller yoluyla izole. Bununla birlikte, hiçbir girişimde doku ayrışma işlemi ve tamamen MECler, PCler ve ACs belirlenmesi seçici hücre soy işaretlerinin kombinasyonunu optimize etme zorluğu nedeniyle, insan iskelet kasından aynı anda her üç hBVSC alt kümeleri saflaştırmak için yapılmıştır. Burada eşzamanlı Purif sağlayan yeni bir hücre izolasyon protokolü tarif(Şekil 1) doku ayrışma sürecini değiştirerek ve seçici hücre yüzey belirteçleri yeni bir kombinasyonunu uygulayarak tek bir insan kas biyopsisi ile MECS, PC'ler ve komisyonlarda ication. En iyi sonuç için, ek dikkat gerektiren mevcut protokolde kritik adımlar şunlardır: 1. Tazelik ve doku örneğinin korunması; Hücre verimi ve dikkatli sindirim sürecinin izlenmesi ve doku ayrılma saati ayarlayarak yüzey antijeni korunması 2. Optimizasyonu; Altı renk 3. Hassas kalibrasyon akım sitometri. Bu parametreler, kendi özel tedarik / ekipman kurulum göre bağımsız bir laboratuar tarafından belirlenecektir.

Bu yeni protokolü uygulayarak, biri sadece birden hBVSC alt popülasyonlarının senkron izolasyonu düzene olamaz ama aynı zamanda HBVlerin arasındaki diferansiyel hücresel davranışları karşılaştırma gibi temel araştırma ve çeviri uygulaması için hBVSCs kullanımını kolaylaştırmakC alt-gruplar ve çeşitli kişiye özel terapötik uygulamalar için tek ya da kombinasyon hBVSC alt-grup (lar) optimizasyonu. Bununla birlikte, her üç alt-hBVSC ve aynı zamanda da izolasyon anda bağlı MECler insan dokularıyla tespit edilmemiş olması gerçeğine iskelet kası ile sınırlıdır. Ayrıca, bu üç hBVSC alt tipleri arasında, geçiş ve / veya hücresel hiyerarşi ayırt etmek mevcut protokolün sınırlama dışındadır.

Karakterizasyonu taze izole edilmiş ve MECler, bilgisayarlar ve ACS ayrı ayrı kültür miyojenik işaretleyici CD56 ekspresyonunu sürdürmek ancak yavaş yavaş AT belirteçler CD34 ve CD144 ekspresyonunu kaybeder önceki çalışmalar MECler kanıtlanmıştır. Klonal düzeyde, MECler CD29, CD44, CD90 ve CD105 olmak üzere, MSC işaretleri ifade, ve bu kondrogenezisi, osteogenezi, adipogenesis ve Miyogenesis gibi mezenkimal farklılaşma potansiyellerini ortaya. Buna ek olarak, klonal MECler bunların angiogen korumakUzun süreli kültürden sonra ik kapasitesi Matrigel kültürdeki kılcal şebekeler oluşturarak ve in vivo neovaskülarizasyonu 21 katılan.

Taze veya kültür bilgisayarlar, sadece CD44, CD73, CD90, CD105 ve MSC içeren belirteçler, ifade, ancak aynı zamanda örneğin, iskelet Miyogenesis, osteogenez, kondrojenez ve adipogenesis 13, mezodermal gelişim yeteneklerini sergiledikleri gösterilmiştir. PC'ler daha sağlam hipoksi altında, trofik faktörler salgılar, ve doku onarımı / rejenerasyon PC benzer ACS, sırasında parakrin fonksiyonu, doğrudan farklılaşması ve hücresel etkileşim yoluyla rejeneratif birimler olarak hizmet klasik MSC belirteçler gösterildi ve büyük mezenkimal hücre soyları 18 içine ayırt. Birlikte PC'ler ile, Klimalar aynı zamanda MKH'lerin gelişimsel kökenleri biri olarak önerilmiştir. Hücre yüzey işaretleyici ifade, farklılaşma kapasitesi ve s karşılaştıran bir özetiTipik bir MSC ile hBVSCs arasında ossible translasyon uygulamalar Tablo 1'de listelenen edilmiştir. Son zamanlarda, sıçan ve insan 29 büyük kan damarlarının tunika medya Tang ve ark. tespit multipotent vasküler kök hücreler (MVSCs). MVSCs sadece düz kas hücrelerine değil, aynı zamanda ayırt damar hasarı sonrası vasküler yeniden 29 ve neointimal hiperplazi katkıda bulunur. MVSCs BVSCs mikrovasküler ve küçük damarlarda ikamet eden gelişimsel bağlantıları paylaşmak ister ileri araştırma gerektirmektedir.

Geçerli protokol zamanlarda, klinik ortamlarda erişilebilir olmayabilir, taze insan kas biyopsisi, ikinci zamanında hücre izolasyonunu gerektirir. Seçenek olarak ise, seçici hücre yüzey markerlerinin bir tadil edilmiş dizi dayalı, bu 30 akış sitometrisi ile dondurularak saklanmış insan birincil iskelet kası hücre kültürlerinden MECler ve bilgisayarlar arındırmak mümkündür. Bu yöntem, potansiyel sağlar PurifTerapötik amaçlar için öbekli insan iskelet kası kültüründen iki hBVSC altkümelerinin ication. Buna rağmen, kültürlenmiş insan kas hücrelerinde CD34 ifade eksikliği, ayrıca bu özel protokol ile ACs ayırmak mümkün değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar akış sitometri ile onu mükemmel teknik yardım için Alison Logar teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Savunma Bakanlığı (JH), Henry J. Mankin Endowed Başkanı (JH), Eğitim ve Kazakistan Cumhuriyeti Bilim Bakanlığı (AS) hibe ile desteklenmiştir. CWC Amerikan Kalp Derneği predoctoral bursu (11PRE7490001) tarafından kısmen desteklenmiştir. M.Corselli Rejeneratif Tıp eğitim bursu için California Institute (TG2-01169) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase type 1 Sigma C5894 Sterile vial
Collagenase type 2 Sigma C1764 Sterile vial
Collagenase type 4 Sigma C1889 Sterile vial
Anti-human CD34 APC BD Pharmingen 555824 Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
Anti-human CD56 PE-Cy7 BD Pharmingen  557747 Keep sterile
Anti-human CD144 PE Beckman Coulter A07481 Keep sterile
Anti-human CD146 FITC AbD Serotec MCA2141F Keep sterile
FACS Aria II Flow Cytometer Becton-Dickinson
EGM-2 complete medium Lonza CC-3162 For culturing PCs (only P0)
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate Invitrogen 11965 For culturing PCs
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate Invitrogen 11995 For culturing MECs and ACs
Fetal bovine serum Invitrogen 10437-028
Heat-inactivated horse serum Invitrogen 26050-088
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Antibiotic-antimycotic (100X) Invitrogen 15240-062
Trypsin-EDTA 0.5% (10X) Invitrogen 15400-054
Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium Invitrogen 14190-250
Chick embryo extract Accurate Chemical CE650T-10 Filter before use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
  2. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  3. Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  4. Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
  5. Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
  6. Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
  7. Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
  8. Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
  9. Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
  10. Chen, C. -W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 597439 (2012).
  11. Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
  12. Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
  13. Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
  14. Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
  15. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
  16. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
  17. Chen, C. -W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31, (2), 305-316 (2012).
  18. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
  19. Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
  20. Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
  21. Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
  22. Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
  23. Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
  24. Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
  25. Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
  26. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
  27. Chen, C. -W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
  28. Lin, C. -S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
  29. Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
  30. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, W. C. W., Saparov, A., Corselli, M., Crisan, M., Zheng, B., Péault, B., Huard, J. Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (90), e51195, doi:10.3791/51195 (2014).More

Chen, W. C. W., Saparov, A., Corselli, M., Crisan, M., Zheng, B., Péault, B., Huard, J. Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (90), e51195, doi:10.3791/51195 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter