Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Effektiv Produktion og oprensning af rekombinant murin Kindlin-3 fra Insect Celler til Biofysiske Studies

Published: March 19, 2014 doi: 10.3791/51206
Automatic Translation
1, 1
1Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford

Summary

Kindlins er grundlæggende for celle adhæsion gennem integriner men undersøgelser af dem har været hæmmet af vanskeligheden ved at udtrykke dem rekombinant i bakterielle værter. Vi beskriver her metoder til deres effektive produktion i baculovirus-inficerede insektceller.

Abstract

Kindlins er væsentlige coaktivatorer med Tallinn, af celleoverfladereceptorerne integriner og også deltage i integrin outside-in signalering og kontrol af gen-transkription i cellekernen. De kindlins er ~ 75 kDa Multidomain proteiner og binde til et NPxY motiv og opstrøms T / S klynge af integrin β-underenhed cytoplasmatiske hale. Det hematopoietically vigtige kindlin isoform, kindlin-3, er afgørende for trombocytaggregation under trombedannelse, leukocyt rullende i respons på infektion og inflammation og osteoclast podocyte dannelse i knogleresorption. Kindlin-3 rolle i disse processer har resulteret i omfattende cellulære og fysiologiske studier. Der er imidlertid et behov for en effektiv metode til at erhverve høj kvalitet milligram mængder af det protein, for yderligere undersøgelser. Vi har udviklet en protokol, der er beskrevet her, til effektiv ekspression og oprensning af rekombinant murin kindlin-3 ved anvendelse af en baculovirus-dsønderrevet ekspressionssystem i Sf9-celler, der giver tilstrækkelige mængder af høj renhed fuldlængde-proteinet for at tillade biofysisk karakterisering. Samme fremgangsmåde kunne tages i studiet af de andre pattedyr kindlin isoformer.

Introduction

Proteiner af kindlin familien er en afgørende komponent af fokal vedhæftning forsamling, og derfor afgørende for komplekst liv. Kindlins, hvoraf der er 3 isoformer af pattedyr (kindlin-1, kindlin-2 og kindlin-3), betragtes som coaktivatorer af den ekstracellulære receptorer integrinerne sammen Tallinn 1. Integrin-medieret celleadhæsion forbinder celleoverfladen til den ekstracellulære matrix (ECM) i højere eukaryoter. Det er et kritisk og fælles proces i et væld af fysiologiske fænomener, som omfatter væv integritet, embryogenese knoglemetabolisme, hæmostase og immunitet. Integrin-medieret celleadhæsion aktiveres via inside-out signaltransduktion via bindingen af ​​talin og kindlin til integrin β-underenhed cytoplasmatiske haler (CTS) ved deres konserverede NPxY motiver. Den biomedicinske betydning kindlin proteiner strækker dog så langt som kernen, hvor kindlin-2 er blevet vist i adskillige nylige rapporter at være involveret i transkriptional kontrol 2,3.

Kindlins er Multidomain proteiner på ca 75 kDa, stemplet af besiddelse af et todelt C-terminal FERM (4,1 band, ezrin, radixin, moesin) domæne, som er afbrudt af en pleckstrin homologi (PH) domæne i centrum for sin F2 subdomæne 4,5. Undersøgelser af kindlin-2 og kindlin-3 PH-domæner viste, at det binder til lipid-second messengers phosphotidylinositol-(3,4,5)-triphosphat og phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat 6-8. , Undersøgelser af kindlin-1 PH domæne viser dog, at det binder sig til PtdIns (3,4,5) P 3 med en meget lavere affinitet, som kan forklares i kindlin-1 ved en isoform-specifik salt bro forhindrer lipider binde 9.. Derudover er der et ~ 100 aminosyre løkke indsættes i F1 domæne af kindlins, der forudsiges at blive udfoldet, men binder til phosphatidylserin i det indre blad af plasmamembranen 10,11. Den kindlin FERMdomæne anses homolog med talin FERM domæne, selvom talin FERM domænet ikke har et pleckstrin-homologidomæne. Både kindlins og talin interagere med NPxY motiver på integrininhiberende β-haler via F3-regionen i deres FERM domæne, men kindlin binder til membranen distale motiv, mens Tallinn målretter membranproksimale en 12-16. Kindlins og talin både Desuden besidder en N-terminal F0 domæne med et ubiquitin-lignende fold, der ikke findes i andre Ferm proteiner 11,17. Undersøgelser af F0 domæne kindlin-2 har vist, at det selvstændigt binder sig til phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphatniveauer beriget membraner 17.

De kindlins udviser paralog-specifikke vævsekspression mønstre og nonredundant fysiologiske funktioner. Kindlin-1 udtrykkes primært i epidermis, men også i mindre grad i tyktarmen, maven og nyrerne, kindlin-2 udtrykkes ubikvitært, men er koncentreret i tværstribet og glatmuskel og er den eneste kindlin udtrykt i fosterudviklingen 4 og kindlin-3 udtrykkes i de bloddannende væv med den højeste koncentration af kindlin-3 findes i megakaryocytter 18. Imidlertid har nyere undersøgelser antydet, at funktionelt protein udtrykkes i endotelvæv samt 19.

Kindlin-3 er af akut medicinsk interesse på grund af sin vigtig fysiologisk rolle i blodet. Det er afgørende for blodpladeaggregering og spredning i thrombedannelse 20 leukocyt rullende som reaktion på infektion og inflammation 21,22 og osteoklast podocyte dannelse i knogleresorption 23. Desuden udtømning af kindlin-3 hos mennesker fører til leukocytadhæsionsreceptoren mangel type III - en sygdom karakteriseret ved livstruende blødningsforstyrrelser og recidiverende bakterieinfektioner 20,24,25. Kindlin-3-knock-out undersøgelser i mus afslørede afgørende funktion af proteinet icelleadhæsion KIND3 -. / - mus viser tydelige fænotyper, såsom alvorlig blødning på grund af inaktive trombocyttal integriner, alvorlig osteopetrose og nedsat leukocytadhæsion 20,22, der ligner symptomer hos mennesker mangler kindlin-3.

Høj opløsning strukturelle data om kindlins til dato har været begrænset til enkelte subdomæner såsom pleckstrin homologi (PH) domæne af kindlin-1 9 og kindlin-2 26,27 og F0 domæne kindlin-1 11 og kindlin -2 17.. De fleste af de underdomæner for hver kindlin polypeptid har dog modstået kloning og strukturel analyse (Yates og Gilbert, upublicerede observationer), og undersøgelser af proteiner i fuld længde er blevet hæmmet af vanskeligheder med at udtrykke og rensning tilstrækkelige mængder ved hjælp af E. coli (upublicerede observationer og Harburger et al. 14). Der er betydelig medicinsk interesse i kindlin-3 og dens function, sammen med de to andre familiemedlemmer, og for nylig har vi genereret milligram mængder af det ved rekombinant ekspression i Spodoptera frugiperda-celler drevet af baculovirusinfektion 12. Vi har derfor her beskriver fremgangsmåder til fremstilling af milligram-mængder af rekombinant muse kindlin-3 i insekt cellekultur, der er egnede til omfattende strukturelle undersøgelser og biokemisk analyse.

I denne protokol vi gør brug af en manipuleret knockout bacmid (BAC10 KO: 1629) der er alene, ude af stand til at producere levedygtige virioner 28. Det virale DNA er således reddet ved rekombination med transfer-vektor, som i dette tilfælde omfatter også kindlin-3-genet (FERMT3) og resulterer i FERMT3 genet erstatter virus meget sent gen, som er overudtrykt, men overflødig, hvilket resulterer i et rekombinant virus, der udtrykker muse kindlin-3 som del af virus livscyklus 28. Vi identificerede dettemetode til fremstilling af kindlin-3 efter forsøg på at udtrykke og rense den i andre ekspressionsværter bevist uoverkommeligt vanskeligt (upublicerede observationer), men også på grund af den alsidighed POPIN vektor suite, som vi har brugt til kloning og som kan anvendes i mange udtryk vært 29.

Protocol

Denne protokol forudsætter, at muse kindlin-3-genet (FERMT3) er blevet klonet ind i en vektor nedstrøms for den meget sene p10-promotor, og at vektoren har flankerende baculovirus-sekvenser for at muliggøre rekombination med bacmidet BAC10 KO: 1629 udviklet af IM Jones og kollegaer 28. Til denne protokol blev kindlin-3-genet klonet i pOPINE 29 og primerne og kloning anvendte strategi kan findes beskrevet andetsteds 12. Plasmidet er manipuleret således, at FERMT3 genet (kindlin-3) er under kontrol af p10 baculoviralt promotoren og vektor indeholder 5 'UTR/ORF603 og ORF 1629 og koder for et C-terminal His 6-tag for downstream rensning 29.

1.. Insect Celledyrkning og vedligeholdelse

  1. Forud for rekombinant baculovirus forstærkning, Spodoptera frugiperda-celler tilpasset suspension kultur (Sf9-celler), børdyrkes og opretholdes. Insektceller bør altid håndteres ved anvendelse af aseptisk teknik i en dedikeret vævskultur stinkskab.
  2. Suspension kulturer af insektceller inkuberes i Sf-900 II (SFM) serumfrit flydende medium suppleret med 100 ug / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin i kolber ved 27 ° C med rystning ved 100 rpm.
  3. Oprethold insektcellekulturen tæthed mellem 1 x Oktober 06-01 x 10 7 celler / ml ved spaltning og fortynde cellekulturen med friske Sf-900 II media.
    Bemærk: sund celler skal se ensartede i størrelse og bør være kugleformet.
  4. Tæl cellerne i et prøvevolumen ved anvendelse af et hæmocytometer og lysmikroskopi at beregne kultur celletæthed.

2. Fremstilling af rekombinant baculovirus

  1. Kultur og vedligeholde Sf9-celler i suspension ved hjælp af Sf-900 II medium suppleret med 100 ug / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. For baculovirus generation bør insektceller dyrkes til en tæthed på 5 x 05-01 oktober x 10 6 celler / ml.
  2. Frø cirka 1 x 10 6 Sf9-celler per brønd af en steril 6-brønds vævskulturplade i 2 ml Sf-900 II medium suppleret med 100 ug / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Lad Sf9 cellerne ved RT i stinkskab til at klæbe til bunden af ​​plastbrønde og dermed danne et monolag.
  3. Udfør rekombinant baculovirus generation ved cotransfektion bacmid DNA og plasmid-DNA på monolagskultur.
    1. For hver transfektion, bland 1-2 ug renset pOPINE-mFERMT3, der besidder de ORF1629 baculovirus elementer, med 0,5 ug renset BAC10 KO: 1629 i 100 ul Sf-900 II SFM uden antibiotika (opløsning A).
    2. I et separat rør, fortyndes 6 pi Cellfectin II Reagens med 100 ul Sf-900 II SFM uden antiantibiotika for hver transfektion reaktion (opløsning B). Der kan oprettes en 'master mix her, for reduceret væskehåndtering, hvis der kræves mange transfektioner.
    3. De to opløsninger blandes (A og B, cirka 200 ul) og inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter til dannelse af et lipid-DNA-kompleks.
    4. Fortynde lipid-DNA-komplekser med 800 ul Sf-900 II SFM uden antibiotika. Aspireres forsigtigt Sf9 cellemonolag medier og omhyggeligt pipette løsning A / B og medier oven på Sf9 monolag.
    5. Inkuberes de transficerede celler i en fugtig inkubator ved 27 ° CO / N og tilsættes yderligere 1 ml Sf-900 II SFM uden antibiotika til hvert monolagskultur den følgende dag. Cellerne inkuberes ved 27 ° C i yderligere 5 dage.
  4. Høste rekombinante baculovirus direkte fra dyrkningsmediet (ca. 2 ml i alt) og overføres til et rent centrifugerør (for eksempel et 15 ml Falcon-rør).
    1. Afklare eventuelle Sf9 celle debrer ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør-virus, som er i den resulterende supernatant og betegnet P1, til et rent rør og opbevares ved 4 ° C i mørke indtil brug. På dette stadium kan anvendes de resterende Sf9 monolag at vurdere rekombinant virus generation ved vurdering af tilstedeværelsen af ​​rekombinant kindlin-3 i insektceller.
  5. Resuspender monolaget med 0,5 ml PBS og fortyndes en 10 pi prøve med lige volumener af 2x SDS-PAGE loadingbuffer. Opvarm prøverne ved> 95 ° C i mindst 10 minutter.
    1. Lydbehandle prøven til 1 sek ved 10% amplitude ved hjælp af en mikro-sonikator tip, hvis det er for tyktflydende til korrekt gelpåsætning.

3. Amplifikation af rekombinant baculovirus

  1. Til amplifikation af virus i suspension bruge en celledensitet på 1,4 x 10 6 celler / ml, og dette bør indtage 1/20 af det samlede kolbens volumen (dvs. 50 ml kulturen 2 L kolbe).
  2. Opnå amplifikation af det rekombinante virus ved infektion insektcellekulturen med P1 virusstampræparation ved en multiplicitet af infektion (MOI) på 0,1 ved hjælp af følgende formel;

    Bemærk: P1 virus generation kan antages at have en forventet viral titer på 1 x 10 7 pfu / ml. Dog kan en plaqueanalyse udføres før dette tidspunkt.
  3. Inkubér P1-inficerede insekt kultur ved 27 ° C med rystning ved 100 rpm i 3 dage (72 h).
  4. Harvest virus ved adskillelse af cellerne fra mediet ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Gem den resulterende cellepellet på dette stadium om bekræftelse af rekombinant virus produktion ved at vurdere kindlin-3 protein-ekspression ved SDS-PAGE og western blotting.
  5. Overfør præciserede virus-berigede medier til et rent rør og opbevares ved 4 ° C imørke indtil brug. Denne viral lager benævnes P2.
    Bemærk: En viral titer på 2 x 10 8 pfu / ml (eller en forstærkning på 100 pfu / celle) kan forventes.

4.. Ekspression af kindlin-3 i baculovirus-inficerede Sf9

  1. Dyrk et passende volumen af ​​Sf9 cellekulturer i suspension i Sf-900 II SFM suppleret med 100 ug / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin, før storstilet rekombinant kindlin-3 udtryk for rensning. Inkubér suspensionskulturer ved 27 ° C med rystning ved 100 rpm og med en samlet kultur volumen: kolbe volumenforhold på 1:5.
  2. Infect suspensionskulturer af Sf9 ved en densitet på 2 x 10 6 celler / ml.
  3. Supplement Sf9 kulturer med en endelig koncentration på 1% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) efterfulgt af forstærket rekombinant virus (P2-virusstamopløsning) til opnåelse af en MOI på 1.. Inkubér inficerede kulturer ved 27 ° C med rystning ved 100 rpm.
  4. Harvest recombinant kindlin-3-CHIS 6-udtrykkende Sf9-celler 72 timer efter infektion ved centrifugering ved 1000 xg   og den resulterende cellepellet opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse eller -80 ° C til langtidsopbevaring.

5.. Oprensning af rekombinant Kindlin-3

  1. Tø frosne baculovirus-inficerede insekt celle (Sf9) pellets udtrykker rekombinant kindlin-3 på is.
  2. Resuspender den optøede cellepellet med lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), suppleret med EDTA-free protease inhibitor cocktail og 1.000-2.000 U DNase1.
    Bemærkning: Alternativt kan modificerede phosphatbufret saltvand (PBS) også anvendes, når NaCl-koncentrationen indstilles til 500 mM for at forhindre ikke-specifikke interaktioner mellem endogene Sf9 celleproteiner og immobiliseret metal-affinitetssøjle anvendes til nedstrøms oprensning (se nedenfor).
  3. Lyserer cellerne ved inkubering af resuspenderede celler med detergent og vortexing. Lydbehandles (40% amplitude, 10 cykler af 10 sek puls efterfulgt af 10 sek køling) prøven yderligere cellesprængning i et isbad eller alternativt anvende en Dounce homogenisator.
  4. Præcisere lysatet ved centrifugering ved 48.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Indlæse den resulterende supernatant på en HisTrap kolonne (5 søjlevolumen ml) præ-ækvilibreret med lysisbuffer, ved 4 ° C ved en hastighed på 1 ml / min.
    Bemærk: Alternativt kan den klarede lysat inkuberes med en 1-5 ml lejevolumen af præ-ækvilibreret nikkel sepharoseperler (f.eks Ni Sepharose 6 Fast Flow) ved 4 ° C i 1-2 timer. En søjle af Ni-sepharose kan dannes efter trinnet med binding ved hjælp af en tyngdestrømning kolonne.
  5. Vask søjlen med søjlevolumener vaskepuffer 10 (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 500 mM NaCI, 10 mM imidazol) for at fjerne ubundne proteiner.
  6. Brug en lineær imidazolgradient 10-500 mm ved en hastighed på 10 mm / ml (eller i søjlevoluminer 10) ved hjælp af en Äkta FPLC at elueredet bundne rekombinante kindlin-3-CHIS 6.
  7. Fraktionere elueringen i 0.5-1 ml fraktioner ved hjælp af Äkta FPLC med de fraktioner, der indeholder kindlin-3-CHIS 6 normalt eluerede ved en imidazol koncentration på 300 mM.
  8. Vurdere proteinsammensætningen eluenten ved SDS-PAGE og for første gang oprensninger bekræfte ved western blotting under anvendelse af et anti-His 6-antistof eller anti-muse kindlin-3-antistof.
  9. Pool fraktionerne indeholdende kindlin-3 og buffer udveksling i 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 200 mM NaCI via en række fortyndinger i buffer og Prøvekoncentrationerne ved hjælp af en centrifugal-protein-koncentrator med en 50 kDa molekylvægt cut-off (MWCO) ved 4 ° C.
    Bemærkning: Alternativt dialyseres proteinet opløsning ved anvendelse Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette med en MWCO på 30 kDa ved 4 ° C i 4 timer til O / N i 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 200 mM NaCl.
    Bemærk: For ionbytning (se nedenfor) en lavere koncentration af NaCl,
  10. Påfør puffer-udvekslet proteinopløsning på en præækvilibreret HiTrap heparin HP kolonne (5 søjlevolumen ml) under anvendelse af en Äkta FPLC ved en hastighed på 0,5 ml / min.
    Bemærk: Det bundne kindlin-3 elueres med en lineær NaCl-gradient (0,2 M NaCI til 1 M NaCl) i den samme buffer, stiger med en hastighed på 10 mM / ml. Kindlin-3-CHIS6 forventes at elueres ved ~ 0,6 M NaCl.
  11. Fraktionere elueringen i 0.5-1 ml fraktioner og vurdere proteinsammensætningen ved SDS-PAGE og western blotting, hvis det er hensigtsmæssigt.
    Bemærk: man kan forvente en proteinrenhed tæt på 95%, som vurderet ved SDS-PAGE.
  12. Pool fraktioner indeholdende kindlin-3 og koncentreres ved hjælp af en centrifuge protein koncentrator med en 50 kDa MWCO til et endeligt volumen på 0,5-2 ml.
  13. I et sidste trin, polere det koncentrerede protein og buffer udveksle proteinet ved anvendelse af gelpermeationskromatografi (SEC).
    1. Påfør det oprensede protein på en Superdex S200 (16/60) eller (10/30) præ-ækvilibreret i 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT ved en hastighed på 1 ml / min eller 0,5 ml / min afhængig søjlestørrelse anvendes.
      Bemærk: Gelpermeationskromatografi kan også udføres i phosphatbufret saltvand (PBS), hvis det kræves.
    2. Oprense proteiner efter størrelse ved anvendelse af buffer på søjlen med en hastighed på 1 ml / min eller 0,5 ml / min, afhængig søjlestørrelse anvendes.
      Bemærk: protein eluerer fra søjlen fraktioneres og overvåges ved hjælp af absorbansen ved 280 nm.
    3. En enkelt absorbanstop bør forventes fra SEC, som fraktioneres og vurderes ved SDS-PAGE til at bestemme homogenitet og er typisk> 95% rent efter dette trin.
  14. Koncentrer oprenset kindlin-3-CHIS 6 ved anvendelse af en centrifuge protein koncentrator med en 50 kDa MWCO til ~ 15 mg / ml vurderet spektrofotometrisk under anvendelse af en beregnet ekstinktionskoefficient (ε) på 109.320 M-1cm-1 </ Sup> (forudsat alle cysteinresterne reduceres).
  15. For opbevaring ved -20 ° C og langtidsopbevaring ved -80 ° C, alikvot proteinet i PCR-rør og flash-fryse prøverne i flydende nitrogen. Alternativt kan proteinet anvendes direkte til undersøgelse ved anvendelse af en række biokemiske og biofysiske teknikker.

Representative Results

De store ekspression af rekombinant muse kindlin-3 under anvendelse af baculovirus-inficerede Sf9-celler kan tage mindre end to uger for at opnå milligram mængder som vist i den skematiske figur 1A og kræver kun en lille mængde af plasmid DNA fra en QIAprep Miniprep kit, for eksempel. Fremstillingen af rekombinant baculovirus opnås ved co-transfektion af Sf9-celler med muse kindlin-3 (FERMT3)-indeholdende plasmid sammen med en manipuleret lineariseret bacmid (BAC10: KO 1629) og høst af nydannede virioner efter 5-7 dage, som vist i figur 1A. Denne metode til baculovirus generation resulterer i 100% rekombinante vira og hovedsagelig dispenserer behovet for plakoprensning 28,30. En repræsentativ lille målestok (2 ml monolag) kultur vil generere en rekombinant virus-indeholdende opløsning med en forventet viral titer på 1 x 10 7 plakdannende enheder (pfu) pr mlkultur. Man kan udføre en plaque assay for at bestemme den faktiske virale titer, men det er måske også arbejdskrævende, da et stort antal konstruktioner testes for strukturelle studier. Succesen med trin virus generation kan vurderes ved hjælp af en eGFP-indeholdende plasmid i parallel eller til dette kindlin-3-konstruktionen kan Sf9 monolag resuspenderes i PBS og vurderet ved SDS-PAGE og western blotting, der typisk viser et klart bånd svarende til et 75 kDa-His-mærket protein, som vist i figur 1B. Virussen efterfølgende forstærkes til at generere tilstrækkelige mængder til stor skala (liter volumen) insektcellen infektion og rekombinant protein isolation. Den anden passage virus (P2) genereres ved at inficere suspensionskulturer med en anslået MOI på 0,1 (se protokol). Det er afgørende, at forstærkningen Sf9 suspension kultur indtager kun 1/20 af det samlede kolben volumen. Denne yderligere beluftning sikrer, at den resulterende viros-holdige medier, høstet efter 3 dage (72 timer) post-infektion, vil generere tilstrækkelige mængder kindlin-3 i den efterfølgende udtryk kultur. Det forstærkede virus lager (P2) antages at besidde en forventet viral titer på 2 x 10 8 pfu / ml baseret på et konservativt skøn på 100 pfu / celle ved hjælp af en celle tæthed på 2 x 10 6 celler / ml i forstærkning 31. Generelt for optimal baculovirus amplifikation og proteinproduktion, bør Sf9-celler være ensartet i størrelse og sfærisk, som vist i figur 1C. Derudover viral amplifikation og protein-ekspression er maksimal ved 72 timer efter infektion, og begge er betydeligt reduceret ved 96 timer efter infektion.

Når virus er blevet forstærket og anvendt til at inficere Sf9-celler i stor skala af rekombinant kindlin-3 er delvist oprenset i kraft af sin manipuleret C-terminal His6-tag under anvendelse af immobiliseret metalaffinitetskromatografi chromatography, som vist i figur 2. Det er vigtigt at udføre oprensningen ved 4 ° C og at der er tilstrækkelige proteasehæmmere er tilføjet for at forhindre proteolyse. Den delvist oprenset kindlin-3 er yderligere oprenset til næsten homogenitet ved ionbytningskromatografi (IEC) under anvendelse af en heparin-kolonne, som vist i figur 3.. Anvendte vi anvendelsen af ​​en heparin-kolonne i stedet for en konventionel ionbytning kolonne, som vi forudså, at det store antal af basiske rester, herunder en poly-lysin-strækning i kindlin-3 F1 domæne ville interagere stærkt med de negativt ladede sulfatgrupper af kolonnen. Denne strategi er især anvendelig til DNA-og RNA-bindende proteiner med grundlæggende nukleinsyrebindende plastre, for eksempel RNA-bindende terminal uridylyltransferase Cid1 32. Endelig kindlin-3 renhed er "blank" af gelpermeationskromatografi at fjerne aggregater og opnå homogenitet, som vist iFigur 4.. De buffere er angivet i protokollerne er standard buffere, der ofte anvendes proteinrensning til strukturel analyse. Generelt er phosphatbaserede puffere undgås til oprensning af proteiner til strukturelle studier, især krystallisation screening på grund af dannelsen af ​​phosphatkrystaller i udkrystallisering dråber (især til eksperimenter ved 4 ° C). Men vi udført en Thermofluor baseret termisk ændring-assayet til at bestemme hvilke buffere blev stabiliserende for kindlin-3, som vist i figur 5. Kort fortalt, er en renset protein løsning fortyndet i buffere, der dækker en række pH-og natriumchloridkoncentrationer derfor danner en 2-dimensional skærm. Smeltningen af ​​proteinet måles ved at observere fluorescensen fra Sypro Orange farvestof (molekylære prober), som binder til hydrofobe rester i foldet protein kerne, over temperaturområdet 20-95 ° C (293-368 K). Temperaturen midt-punkt, hvor the protein folder (overgang temperatur, T m) blev beregnet ved anvendelse af Opticon Monitor-softwaren og er beskrevet andetsteds 33. Kindlin-3 blev observeret at være stabil ved høje natriumchloridkoncentrationer (500 mm) i pH-området 7,0-9,0, med en konsekvent overgang temperatur (T m) 55 ° C. Det blev også observeret, at T m Kindlin-3 var ca 55 ° C i pH-området 7,0-7,5 uanset natriumchloridkoncentrationen.

Vi fandt, at der var begrænset proteolyse af kindlin-3 under oprensning, men SDS-PAGE-analyse af stærkt koncentreret protein (~ 15 mg / ml) viste begrænset forurening med yderligere to polypeptider af samme intensitet. Mærkeligt, men der er ingen angivelse af yderligere arter ved gelpermeationskromatografi, som vist i Figur 4.. Det er således tænkt at proteinet hakker af proteaser, men forbliver foldet og hydrodynamically skelnes fra fuld-længde proteinet. Interessant calpain er en kendt protease, som spalter kindlin-3 på Tyrosine373, som er i β1-β2 loop pleckstrin-homologi (PH)-domænet 34 og kan forklare vore observationer. Endvidere western blotting afslører, at en af ​​de polypeptid dubletter besidder en C-terminal His-mærke og den tilsyneladende molekylvægt af dublet, når summeres lig 75 kDa, den samme molekylvægt som det native protein. Udbyttet af oprenset rekombinant kindlin-3 per liter Sf9-celler (~ 2 g celle vægt) er i bedste, 5 mg.

Figur 1
Figur 1. Oversigt over baculovirus-inficeret insektcelle heterolog proteinekspression. (A) en skematisk oversigt over baculovirus generation og udtryk for kindlin-3 i Sf9 celler. I DNA-vektor skemaer er 5'UTR / ORF603 farvet røde, den ORF1629 er farvet i grønt, og genet af proteinet af interesse (POI) er farvet blå. (B) Western blot ved hjælp af en anti-His 6-antistof, seks små (2 ml monolag) kulturer (banerne mærket i henhold til kultur) af Sf9 celler, der producerer rekombinant baculovirus og rekombinant murin kindlin-3. (C) Lysmikroskopi billede af raske Sf9-celler dyrket i suspension i Sf-900 II SFM suppleret med antibiotika og overført til en 35 mm brønd vævsdyrkningsskål (se protokol). Billedet er 20X forstørrelse.

Figur 2
Figur 2. Representative oprensning af kindlin-3 ved immobiliseret metal-affinitetskromatografi (IMAC). SDS-PAGE af nikkel affinitetsoprenset rekombinant murin kindlin-3 udtrykt i baculovirus-inficerede Sf9-celler (~ 2 g celle vægt). Adsorberet protein blev elueret under anvendelse af en imidazolgradient (vist ovenfor gelen). Banerne er mærket som følger: MW, molekylvægtmarkør, Lys, helcellelysat, FT, flyde igennem (ubundet), WI, vask 1, WII, vask 2. Western blot-analyse (se nedenfor) blev også udført ved hjælp elueringsfraktionerne at bekræfte tilstedeværelsen af den konstruerede His-tag på rekombinant protein. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Repræsenrepræsentative oprensning af kindlin-3 af heparinaffinitetschromatografi. (A) Elueringsprofil observeret ved 280 nm (blå) viser en enkelt symmetrisk elueredes under en lineær natriumchlorid-gradient (grøn) ved hjælp af NaCl-koncentration området 0,05-1,0 M. ( B) SDS-PAGE analyse af fraktioneret eluering viser tilstedeværelsen af 75 kDa-protein, kindlin-3 (mærket K3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. Repræsentant gelfiltreringskromatografi og koncentreret kindlin-3. (A) Gelfiltrering elueringsprofil oprenset kindlin-3 under anvendelse afen Superdex S200 (16/60) i Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl og 1 mM DTT ved 20 ° C. Baseret på elueringsvolumenet, kindlin-3 migrerer som forventet for en 75 kDa-protein, hvilket tyder på, at det er overvejende monomer. (B) SDS-PAGE af stærkt koncentreret oprenset rekombinant kindlin-3 på 14,5 mg / ml. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Thermofluor baseret Termisk Shift Assay for Buffer Screening. Kindlin-3 blev fortyndet i forskellige buffere, der omfatter en todimensional skærm pH versus natriumchloridkoncentrationen. Transition temperaturer (temperatur midtpunkter) blev observeret ved fluorescens afhydrofobt bundet farvestof, Sypro orange (molekylære prober), og beregnes ved hjælp af Opticon Monitor-softwaren. (A) En 3D histogram over overgangen temperaturer er afbildet sammen med (B) ændringen i overgangstemperatur fra det beregnede gennemsnit på 50,4 ° C. For klarhedens skyld søjlerne er farvet i henhold til den række af temperaturer, som de svarer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Baculovirusekspressionssystemer bliver stadig mere populære, og et vigtigt redskab til produktion af milligram mængder af rekombinant protein til protein karakterisering ved hjælp af biofysiske undersøgelser, herunder røntgenkrystallografi. På trods af at mere eksperimentelt krævende baculovirusekspressionssystemer tilbyde flere fordele i forhold til E. coli hvoraf den ene er en nær-native miljø for proteiner af eukaryot oprindelse fx tilstedeværelsen af passende chaperoner og mulighed for post-translationel modifikation. I vores egne bestræbelser på at udtrykke kindlin-3 blev alternative ekspressionsværter anvendes, herunder pattedyr cellelinier og bakterielle ekspressionsstammer (upublicerede observationer). Generelt mange E. coli testede stammer produceres meget små mængder af rekombinant kindlin-3 (~ 0,5 mg / l kultur upublicerede observationer). Men baculovirus-drevet ekspression i insektceller var særlig effektiv, og i samarbejdemparison til transient ekspression i pattedyrceller, mere modtagelig for at generere den store biomasse kræves for at isolere et milligram rekombinant cytoplasmatiske proteiner (upublicerede observationer). Vi spekulere i, at tilstedeværelsen eukaryote chaperoner kan tillade effektiv produktion af kindlin-3.

De baculoviridae inficere insektceller og rekombinant protein ekspression baculovirus anvendt i dette arbejde er baseret på Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). I naturen AcNPV, som inficerer Autographa californica (lucerne grensaks) insektlarver, kræver polyhedrinprotein at danne tillukning hvorved vironer er indkapslet i en krystallinsk protein matrix dermed give den nødvendige beskyttelse af deres løsladelse. I dyrkede celler er ikke påkrævet dannelsen af ​​okklusionslegemer for replikation og er derfor undværes. I tilfælde af at udtrykke fremmede proteiner polyhedrin-protein-gen kan være replaced i en rekombinant AcNPV med genet for proteinet af interesse. AcNPV kan inficere andre Lepidopteron arter og med henblik på rekombinant protein udtryk hær orm Spodoptera frugiperda anvendes puppe ovarieceller. I den her skitserede fremgangsmåde er AcNPV bacmid (BAC10) manipuleret således, at en væsentlig virale gen, ORF1629, inaktiveres ved indsættelse af chloramphenicolacetyltransferase resulterer i en knock-out bacmid (BAC10: KO 1629), således at det er i stand til at danne infektiøse baculovirions 28. Cotransfektion af Sf9-celler med lineariseret BAC10: KO 1629 og FERMT3-holdige transfervektor reparerer inaktive ORF1629 gennem gennemførelse, hvilket resulterer i en levedygtig genom, som også har indarbejdet FERMT3 genet under kontrol af polyhedrinpromotoren 28.

Vi beskriver en oprensningsprotokol til isolering af højrent rekombinant muse kindlin-3 via en three trin kromatografisk fremgangsmåde. De metoder, der anvendes her let kunne anvendes på andre His-mærkede proteiner. Vi ansat en ionbyttertrin til yderligere oprensning kindlin-3, men vi mener, at dette er en yderligere pseudo-affinitetstrin som kindlin-3 besidder et stort antal grundlæggende rester, herunder en poly-lysin strækning inden for sit F1 domæne. Derudover er kindlin-3 anses for at binde til og interagere med den cytoplasmatiske side af plasmamembranen, hvor det fungerer, og derfor har vi forudsige, at klynger af basiske rester, vil gøre det muligt for proteinet at imødegå den negativt ladede membran.

De er beskrevet i oprensningsprotokoller buffere betragtes standard og bruges ofte i strukturel biologi. Den thermofluor assay (figur 5) viser, at kindlin-3 er stabil i de fleste pufferbetingelser pH over 6,0. Dette var især nyttigt og vigtigt for at informere vores eksperimenter, når de studerer kinldin-3: β1A-hale interaktion ved NMR, som viste fremragende spektre ved pH 6,1 med lave koncentrationer af NaCl 12.

Før der kan foretages nogen biofysiske undersøgelse, er det vigtigt at vise, at det rensede protein af interesse faktisk er foldet korrekt og er funktionelt aktiv. I en tidligere publikation har vi vist, at den rekombinante kindlin-3 udtrykt og oprenset ved hjælp af denne fremgangsmåde var en monomer og monodispergeret i opløsning, som vurderet ved gelpermeationskromatografi, dynamisk lysspredning, analytisk ultracentrifugering og lille vinkel røntgenspredning, og var også i stand til at binde og anerkende membran-distale NPxY og opstrøms serin / threonin klynge af β 1A cytoplasmatiske haler 14, hvilket bekræfter, at det opfører sig som det native protein, som er i overensstemmelse med tidligere cellulære og fysiologiske studier 14,20,22. Anvendelsen af ​​et termisk stabilitet assay er en yderligere måde at foreslå the korrekt foldning af et protein af interesse, som ukorrekt foldet protein vil resultere i en høj fluorescens baggrund på grund af eksponerede hydrofobe rester.

Den kindlin familie af proteiner har været genstand for megen opmærksomhed, da deres uventet rolle som væsentlige coaktivatorer af integriner in vivo blev opdaget. Dette har udløst en stor indsats for at udtrykke dem rekombinant og løse deres strukturer. Til dato begrænset succes er blevet rapporteret at udtrykke milligram mængder af fuldlængde rekombinant protein, men vi har her beskrevet anvendelsen af ​​et baculovirus-system, der tillader stor skala ekspression på et niveau, hvor strukturelle studier bliver mulig. Ved at generere store mængder af rekombinant kindlin-3 forventer vi, at dette vil bidrage yderligere undersøgelser af dette protein. Baculovirus-drevet fremgangsmåde og oprensning arbejdsgang beskrives her til rekombinant murin kindlin-3 kan også anvendes til at udtrykke og oprense andre kindlin isoformer, Som også er vanskeligt at udtrykke, og også besidder polylysin-strækninger, og kan yderligere tilpasses til andre cytoplasmiske proteiner, såsom nukleinsyrebindingsproteiner, der undlader at udtrykke bakteriestammer.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Weixan Lu til teknisk bistand i kulturen og vedligeholdelse af Sf9 celle bestande. LAY blev understøttet af en Medical Research Council (MRC) graduate studentship. RJCG var en Royal Society University Research Fellow. The Oxford Division Strukturel Biologi er en del af Wellcome Trust Center for Human Genetik, Wellcome Trust Core Award Grant Number 090532/Z/09/Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf-900 II serum free media (SFM) 1x liquid Life Technologies 10902-096 store at 4 °C and warm to RT before use
Cellfectin II Reagent Invitrogen 10362-100 Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used
Streptomycin sulphate (solid) Melford S0148 Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
Penicillin G, potassium salt (solid) Melford P0580 Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate Greiner Bio-One 657160
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10100-147
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8849 Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I  Sigma D5025
HisTrap FF (5 ml) GE Heathcare 17-5286-01 Requires an Äkta FPLC machine
HiTrap Heparin (5 ml) GE Heathcare 17-0407-01 Requires an Äkta FPLC machine
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) Millipore UFC905024 15 ml capacity and a MWCO of 50 kDa protein concentrator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. The tail of integrins, talin, and kindlins. Science. 895, 899- (2009).
  2. Yu, Y., et al. Kindlin 2 forms a transcriptional complex with β-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling. EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).
  3. Yu, Y., et al. Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family. Int J Cancer. , (2013).
  4. Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins. Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).
  5. Siegel, D. H., et al. Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome. Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).
  6. Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration. J. Biol. Chem. , (2013).
  7. Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
  8. Qu, H., et al. Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins. J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).
  9. Yates, L. A., et al. Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain. J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).
  10. Bouaouina, M., et al. A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated αIIbβ3 integrin coactivation. J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).
  11. Goult, B. T., et al. The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation. J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).
  12. Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal β-Subunit NPXY motif. J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).
  13. Anthis, N. J., Campbell, I. D. The tail of integrin activation. Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).
  14. Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects. J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).
  15. Tadokoro, S., et al. Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation. Science. 302, 103-106 (2003).
  16. Garcia-Alvarez,, et al. Structural determinants of integrin recognition by talin. Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).
  17. Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation. Structure. 19, 1664-1671 (2011).
  18. Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development. Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).
  19. Bialkowska, K., et al. The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell. J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).
  20. Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation. Nat. Med. 14, 325-330 (2008).
  21. Lefort, C. T., et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119, 4275-4282 (2012).
  22. Moser, M., et al. Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells. Nat. Med. 15, 300-305 (2009).
  23. Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption. J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).
  24. Malinin, N. L., et al. A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans. Nat. Med. 15, 313-318 (2009).
  25. Svensson, L., et al. Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation. Nat. Med. 15, 306-312 (2009).
  26. Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation. Protein Cell. 3, 434-440 (2013).
  27. Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
  28. Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. Improving baculovirus recombination. Nucleic Acids Res. 31, (2003).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).
  30. Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J Struct. Biol. 172, 55-65 Forthcoming.
  31. Wasilko, D. J., et al. The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).
  32. Yates, L. A., Fleurdépine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).
  33. Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58. Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).
  34. Zhao, Y., et al. Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain. J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 Forthcoming.

Tags

Virology Heterolog proteinekspression insektceller proteinoprensning kindlin celleadhæsion
Effektiv Produktion og oprensning af rekombinant murin Kindlin-3 fra Insect Celler til Biofysiske Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, L. A., Gilbert, R. J. C.… More

Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J. Vis. Exp. (85), e51206, doi:10.3791/51206 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter