Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress
Summary
Verwaltung der beiden Analoga von Thymidin, EDU und BrdU, bei schwangeren Mäusen ermöglicht die Analyse des Zellzyklus in neuronalen und Vorläuferzellen im embryonalen Gehirn der Maus. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Auswirkungen der genotoxischen Stress, einschließlich ionisierender Strahlung, während der Gehirnentwicklung zu bestimmen.
Abstract
Neuronen der Hirnrinde während der Gehirnentwicklung von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC), die einen mehrreihigen Epithel der lateralen Ventrikel des embryonalen Gehirn bilden erzeugt. Genotoxischen Stress, wie ionisierende Strahlung, haben hocheilige Wirkungen auf das sich entwickelnde Gehirn, um die hohe Empfindlichkeit NSPC bezogen. Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen hängt von der Charakterisierung der DNA-Schadensantwort dieser bestimmten Arten von Zellen, die ein genaues Verfahren erfordert NSPC Progression durch den Zellzyklus in der beschädigten Gewebe zu bestimmen. Hier ist eine Methode, die auf aufeinanderfolgende intraperitoneale Injektionen von EdU und BrdU bei schwangeren Mäusen und weiteren Nachweis dieser zwei Thymidin-Analoga in koronalen Abschnitte des embryonalen Gehirns gezeigt. EdU und BrdU sowohl in DNA replizierender Zellen während der S-Phase eingearbeitet und werden von zwei verschiedenen Techniken (Azid oder detektiertein spezifischer Antikörper bezeichnet), die ihre gleichzeitige Detektion zu erleichtern. EdU und BrdU-Färbung werden dann für jedes NSPC Kern in Abhängigkeit von seinem Abstand von der ventrikulären Marge in einem Standardbereich der dorsalen Telen bestimmt. Damit diese doppelte Markierungstechnik ermöglicht die Unterscheidung Zellen durch den Zellzyklus von denen, die Zellzyklus-Kontrollpunkt, die zu Zellzyklusarrest in Reaktion auf DNA-Schäden aktiviert fortgeschritten.
Ein Beispiel für ein Experiment vorgestellt, in dem EdU wurde vor der Bestrahlung und unmittelbar nach BrdU injiziert und Analysen innerhalb der 4 Stunden nach der Bestrahlung durchgeführt. Dieses Protokoll stellt eine genaue Analyse der DNA-Schadensantwort akuten NSPC der in Abhängigkeit von der Phase des Zellzyklus in der sie bestrahlt wurden. Dieses Verfahren ist leicht umstellbar auf viele andere Systeme, um die Wirkung einer bestimmten Behandlung auf die Zellzyklus-Progression in lebenden Geweben zu bestimmen.
Introduction
Während der embryonalen Entwicklung des Gehirns, werden Projektionsneuronen des zerebralen Kortex in der ventrikulären Zone erzeugt wird, ein mehrreihigen Epithel von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC) besteht, die Linien der lateralen Ventrikel. Unter NSPC die radialen Gliazellen (RGC), die als neuronale Stammzellen dienen, unterzogen interkinetic Kernwanderung (INM): sie Mitose führen an der Oberfläche der Herzkammer und der S-Phase an der Grundgrenze des ventrikulären Zone (VZ) 1, 2,3. Sie können entweder symmetrisch teilen, um zwei RGC erzeugen oder asymmetrisch um ein RGC und ein Neuron oder eine Zwischenvorläuferzelle (IPC) 4, 5 zu erzeugen. IPC wandern zu einer darüberliegenden Schicht wuchernden genannt Subventrikularzone (SVZ), wo nach einem letzten symmetrische Teilung sie zwei unreifen Projektionsneuronen 6-8 generieren. Im Gegensatz zu RGC, IPC nicht unterziehen INM (9 Bewertung). Neu erzeugte Neuronen MIGRaß radial entlang der radialen Fasern durch die Zwischenzone (IZ) an ihren Bestimmungsort in der kortikalen Platte (CP) 10, 8 zu erreichen. Das perfekte Timing aller dieser Ereignisse ist von wesentlicher Bedeutung für eine korrekte kortikalen Entwicklung. Zum Beispiel der Wechsel von Proliferation, die Differenzierung von neuronalen Vorläuferpopulationen wird durch die Dauer der G1-Phase 11, 12 gesteuert. Die Verlängerung der G1-Phase korreliert somit mit der Zelldifferenzierung.
Genotoxische Stress, wie ionisierende Strahlung, stark beeinträchtigen die Entwicklung des Gehirns (in 13 überprüft). Wir und andere haben gezeigt, dass NSPC sind sehr anfällig für strahlungsinduzierte Apoptose 14, 15,16. Ionisierende Strahlung induziert DNA-Doppelstrangbrüche, die am meisten zu schweren Schäden an wuchernden Zellen sind. Eine wesentliche Komponente der DNA-Schadensantwort (DDR) in Rad-Zellen die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in der G1 / S oder G2 / M-Übergänge oder während SPhase (intra-S-Checkpoint) 17-21. Sie blockieren die Zellzyklus-Progression, um Zeit für DNA-Schäden zu reparieren oder Beseitigung von beschädigten Zellen zu liefern. Folglich kann Zelltod sowie verzögerte Progression des Zellzyklus die Entwicklung des Gehirns als Reaktion auf ionisierende Strahlung 22-24 verändern. Es war daher interessant, ein Verfahren, um die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in NSPC im bestrahlten Maus embryonale Gehirn beurteilen zu entwickeln.
Das Fortschreiten des Zellzyklus wird routinemäßig mit dem Einbau eines Thymidin-Analogon, 5-Bromo-2'-desoxyuridin (BrdU) gefolgt. BrdU während der S-Phase des Zellzyklus, wenn die DNA repliziert aufgenommen. Die Verwendung von einem Antikörper gegen BrdU ermöglicht danach die Detektion von Zellen, in die S-Phase während des Pulses von BrdU waren.
Eine neuartige Thymidin-Analogon, 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EDU) von einem fluoreszierenden Azid detektiert. Die verschiedenen Möglichkeiten, um EdU und B zu erkennen RDU nicht kreuzreagieren, 25, die den gleichzeitigen Nachweis beider Thymidin-Analoga, die nützlich für das Studium der Zellzyklusprogression ist. Normalerweise Zellen werden zunächst mit EdU gepulst und dann mit BrdU, wo die Zeit zwischen den beiden Eingemeindungen dauert zwei Stunden 25, 26 gepulst. Zugabe von BrdU in Kulturmedien, die EdU führt vorzugsweise Einbau von BrdU in die DNA unter Ausschluss von Bildung, während gleichzeitiger Zugabe von 25 EdU mit äquimolare oder äquimolare BrdU Hälfte der Medien ergibt nur BrdU-Inkorporation 27. Dies erleichtert die doppelten Markierungsprotokoll durch die Beseitigung der Waschschritte, die normalerweise erforderlich sind, um die erste Markierung aus dem Kulturmedium vor der Zugabe des zweiten Etiketts zu entfernen. Dies ist auch von besonderem Interesse für die in-vivo-Studie, in der die Waschschritte sind nicht möglich, den genauen Zeitpunkt der S-Phase Eintritt oder Austritt von Zellpopulation zu bestimmen.
t "> Kürzlich wurde ein Verfahren zur Zwei-Puls-Markierung in embryonalen Mäusehirn EdU und mit BrdU 23, 24,22 ist entwickelt worden, um die Zellzyklusprogression und INM der NSPC nach Bestrahlung in utero zu analysieren. Außerdem wurde nachgewiesen, dass bei S-Phase, Maus-Zellen replizieren zunächst die Euchromatin Regionen und dann die perizentrischen Heterochromatin 28,29,30. Interessanterweise perizentrischen Heterochromatin von verschiedenen Chromosomen in interphasic Kerne gruppiert, um heterochromatischen Herde auch als Chromozentren bekannt und leicht durch DAPI-Färbung als helle Herde nachweisbar bilden. Daher werden die Differenz EdU und BrdU-Färbungen von Euchromatin und Chromozentren half uns, genauer zu analysieren Fortschreiten der S-Phase NSPC.Diese Methode erlaubt die Demonstration der scheinbaren Mangel an G1 / S Kontrollpunkt in NSCP 22-24, die ganz überraschend ist, da diese Checkpoint soll entscheidend für die Genomstabilität sein. Mehrere experimental Designs basierend auf verschiedenen Kombinationen von Bildung und BrdU-Impulse werden verwendet, um die Zellzyklusprogression in der ventralen und dorsalen Telen analysieren. Hier geben wir ein Beispiel für die Protokolle, die die Untersuchung der akuten DNA-Schäden von NSPC innerhalb der ersten 4 Stunden nach der Bestrahlung in utero E14.5 Mausembryonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier auf der Grundlage Einbau von EdU 1,5 h beschriebenen Versuchsaufbau vor der Bestrahlung und der Einbau von BrdU unmittelbar nach der Bestrahlung erlaubt die Demonstration, die nach einer NSPC sind in der Lage, S und G2 / M Kontrollpunkte aktivieren, nicht aber die G1 / S Kontrollpunkt während der 1. Stunde genotoxischen Stress in der fetalen Gehirn der Maus. Wir führten weitere Experimente, in denen EdU hat zu verschiedenen Zeiten nach der Bestrahlung und BrdU injiziert worden, nur 1 Stunde vor Mä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 323267 erhalten, von der Electricité de France (EDF) und von l'Agence Nationale de la Recherche – Santé-Environnement Santé et Travail-(ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
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