Summary
Timidin iki analoglarının Yönetimi, edu ve BrdU, hamile farelerde embriyonik fare beyninde sinir ve progenitör hücrelerde hücre döngüsü ilerlemesinin analizine izin verir. Bu yöntem, beyin gelişimi sırasında iyonizan radyasyon içeren genotoksik stres, etkilerini belirlemek için yararlıdır.
Abstract
Serebral korteks nöronlar embriyonik beynin lateral ventriküller astar bir yalancı epiteli oluşturan nöral kök hücrelerin farklı (NSPC), beyin gelişimi sırasında oluşturulur. Gibi iyonize radyasyon gibi genotoksik stresler, NSPC yüksek duyarlılığı ile ilgili gelişen beyin üzerinde son derece zararlı etkileri vardır. Dahil hücresel ve moleküler mekanizmaların açıklanması, hasarlı doku, hücre döngüsü boyunca NSPC ilerlemesi belirlemek için güvenilir bir yöntem gerektirir hücreleri, bu özel tiplerinin DNA hasarı yanıtın karakterizasyonu bağlıdır. Burada hamile farelerde embriyonik ve koronal beyin bölümlerinde bu iki timidin analogları daha saptanmasında edu ve BrdU ardışık intraperitonal enjeksiyonlar göre bir yöntem gösterilmektedir. Edu ve BrdU hem S fazında kopyalayan hücre DNA olarak dahil edilmiştir ve iki farklı teknikler (azid ile tespit edilir ya dabunların aynı anda algılanmasını kolaylaştırmak spesifik bir antikor, sırasıyla). Edu ve BrdU boyama daha sonra dorsal telencephalon standart bir bölgede ventriküler kenar onun mesafesinin bir fonksiyonu olarak her bir NSPC çekirdeği için belirlenir. Bu nedenle bu çift etiketleme tekniği DNA hasarına tepki olarak hücre siklüs hapsinin yol açan bir hücre döngüsü kontrol noktası aktive olması, bu ikinci hücre döngüsü yoluyla ilerleme hücreleri ayırt sağlar.
Deneyin bir örnek edu hemen sonra ışınlama ve BrdU önce enjekte edilmiş ve ışınlama sonra 4 saat içinde analiz yapılmıştır ki, sunulmuştur. Bu protokol ışınlanır edilmiş hangi hücre döngüsü faz fonksiyonunda NSPC akut DNA hasarı yanıtın doğru bir analizini sağlar. Bu yöntem, canlı dokuda, hücre devir gelişiminin belirli bir tedavinin etkisini tespit etmek amacıyla kolayca yer değiştirebilir diğer sistemlerin etmektir.
Introduction
Embriyonik beyin gelişimi sırasında, serebral korteksin projeksiyon nöronlar nöral kök ve progenitör hücrelerin (NSPC) farklı türde oluşan bir yalancı epitel bu satırları yan ventrikül, ventriküler bölge oluşturulur. NSPC arasında, nöral kök hücre olarak hizmet eden radyal glial hücreleri (RGC), (INM) interkinetic nükleer göç tabi tutulur: bunlar ventriküler bölgesinin bazal sınırında ventrikül ve S-fazı yüzeyinde mitoz yerine (VZ) 1., 2,3. Bölündüklerinde ya simetrik iki RGC oluşturmak için ya da asimetrik bir RGC ve bir nöron veya bir ara progenitör hücre (IPC) 4, 5 üretir. IPC son bir simetrik bölünme sonra da iki olgunlaşmamış projeksiyon nöronları 6-8 üretmek bölge subventricular denilen bir üstteki çoğalan tabakası (SVZ), göç. RGC aksine, IPC (9 gözden) Inm girmezler. Yeni üretilen nöronlar Migrkortikal plaka (CP) 10, 8 onların nihai hedefe ulaşmak için ara bölge (IZ) ile radyal lifleri boyunca radyal yedik. Tüm bu olayların mükemmel zamanlama doğru kortikal gelişim için gereklidir. Örneğin nöral projenitör popülasyonlarının farklılaşma çoğalmasından anahtar G1 faz süresi 11, 12 tarafından kontrol edilir. G1 fazının uzatılması hücre farklılaşması ile bu şekilde ilişkilidir.
Bu tür (13 gözden) iyonize radyasyon, bozan beyin gelişimi gibi genotoksik stres. Biz ve diğerleri NSPC radyasyon kaynaklı apoptoz 14, 15,16 derece yatkın olduğunu göstermiştir. İyonlaştırıcı ışınım çoğalan hücrelere en ağır hasarı DNA çift iplikli kırılmalara neden. Bisiklet hücrelerde DNA Damage Müdahale (DDR) esas bir bileşeni, G1 / S ya da G2 / M geçişlerinde ve S esnasında hücre siklüs kontrol noktalarının aktivasyonufaz (intra-S kontrol noktası) 17-21. Bunlar, DNA hasarı tamiri ya da çok hasar görmüş hücrelerin ortadan kaldırılması için zaman sağlamak için, hücre döngüsü ilerlemesini bloke eder. Sonuç olarak, hücre ölümü hem de gecikmiş hücre döngüsü ilerlemesi radyasyona maruz 22-24 iyonize yanıt beyin gelişimini değiştirebilir. Bu ışınlanmış fare embriyonik beyin NSPC hücre döngüsü kontrol noktası aktivasyonunu değerlendirmek için bir yöntem geliştirmektir, böylece ilginçti.
Hücre döngüsünün ilerlemesi rutin bir timidin analogu, 5-Bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) 'nin bileşimi kullanılarak takip edilir. BrdU DNA çoğaltma işlemini hücre döngüsünün S fazı esnasında dahil edilmektedir. BrdU karşı bir antikorun kullanılması BrdU darbesi sırasında S fazında olan hücreler daha sonra belirlenmesini sağlar.
Bir yeni timidin analogu, 5-etinil-2'-deoksiuridin (EGT), floresan azit ile tespit edilir. Edu ve B tespit etmek için farklı yolları RDU hücre döngüsü ilerlemesinin çalışma için yararlı olan iki timidin analogları aynı anda algılama sağlayan, 25, çapraz reaksiyona girmezler. Genellikle hücreler ilk edu ile darbeli ve daha sonra her iki birleştirmeleri arasındaki süre sonrası 25, 26 bir çift sürer BrdU, ile birlikte titreşim uygulanır. Edu ihtiva eden kültür ortamı içinde BrdU eklenmesi edu hariç olmak üzere DNA'ya BrdU tercihli olarak dahil sonuçlanır ise sadece BrdU dahil 27 ortam sonuçlara eşit mol ya da eşit molar yarım BrdU ile edu 25 eşzamanlı eklenmesi. Bu, normal olarak önce ikinci etiketin ilave etmek için kültür ortamından birinci etiket çıkarmak için gerekli olan yıkama adımları ortadan kaldırarak çift etiketleme protokolü kolaylaştırır. Bu, aynı zamanda, S fazına girişin ya da hücre nüfusunun çıkış kesin zamanlama belirlemek için yıkama adımları mümkün olmayan in vivo çalışmada,, için özel bir önem taşımaktadır.
t "> Son zamanlarda, edu ve BrdU 23, 24,22 kullanılarak embriyonik fare beyninde çift nabız da etiketlenmesi için bir yöntem utero ışınlama sonra hücre döngüsü ilerlemesini ve NSPC İNM analiz etmek için geliştirilmiştir. Üstelik gösterilmiştir sırasında, bu S fazı, fare hücreleri ilk Ökromatin bölgeleri ve daha sonra perisentrik heterokromatine 28,29,30 çoğaltmak. İlginçtir, interphasic çekirdeklerinde kümelenmiş farklı kromozomlar perisentrik heterokromatinin da chromocenters olarak bilinen ve parlak odakları olarak DAPI boyama tarafından kolayca tespit heterokromatik odağı oluşturması. Bu nedenle, ökromatin ve chromocenters diferansiyel Edu ve BrdU boyamaları daha doğrusu NSPC S fazı ilerlemesini analiz için bize yardımcı oldu.Bu yöntem, bu kontrol noktası genom istikrar açısından kritik olması gerekiyordu çünkü oldukça şaşırtıcı NSCP 22-24 G1 / S kontrol noktasında, belirgin eksikliği gösteri sağladı. Çeşitli expedu ve BrdU bakliyat çeşitli kombinasyonlarına dayanan tasarımları erimental ventral ve dorsal telencephalon hücre döngüsü ilerlemesini analiz etmek için kullanılmıştır. Burada, E14.5 fare embriyo utero ışınlama sonraki ilk 4 saat içinde NSPC akut DNA hasarının çalışma sağlayan protokollerin bir örnek verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hayvan Prosedürleri
Bu protokol 24 Kasım Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi, 1986 (86/609/EEC) uygun olarak dizayn edilmiştir ve hayvan refahı (CETEA-CEA DSV IdF'nin) bizim kurumsal komitesi tarafından onaylandı.
- Edu / BrdU ve E14.5 gebe farelerin ışıması (Şekil 2A) ile Enjeksiyonlar.
- PBS içinde 5 mg / ml 'de ml BrdU ve 1 mg / at edu içinde bir çözeltisi hazırlandı. Hamile farelere, bir 25 G iğne kullanılarak edu çözeltinin 100 ul'lik bir intra-peritoneal enjeksiyon (IP) yapın. 1.5 saat sonra, 0 Gy veya 2 Gy (0.6 Gy / dk) fareler (toplam vücut ışınlaması) ışın tedavisi. Hemen sonra, hamile farelere, bir 25 G iğne kullanılarak BrdU çözeltisi (IP) 200 ul enjekte edilir.
- Embriyonik beyin koronal dilimlerinin hazırlanması.
- Radyasyona maruz bırakıldıktan sonra 1 saat ya da 4 saat sonra, karbon dioksit ile gebe farelerin euthanize.
- Karın Cavi açınmakas kullanarak üç santimetre üzerinde ty. Boynuzları her iki ekstremite kesit tarafından rahim kalanından iki rahim boynuzları ayırın. PBS% 0.6 glikoz içeren bir Petri kabı içine rahim boynuzları aktarın. Embriyoları izole etmek için forseps ile rahim boynuzları açın. Forseps kullanarak her bir embriyonun amniyon kesesi çıkarın.
- Forseps ile embriyonik kafaları inceleyin ve 4 ° C 'de% 4 paraformaldehit (PFA, pH = 7.4) O / N daldırılarak bunları düzeltmek
- 4 ° C de en az bir gece boyunca PBS içerisinde embriyonik kafaları durulayın Kafalar birkaç gün boyunca PBS içinde tutulabilir.
- Tablo 1 'de gösterildiği gibi bir vakum infiltrasyon işlemcisi kullanılarak parafine gömme kafa. Gömme Başlıkları da etanol ve Xylen banyoları için kimyasal bir başlık altında gerçekleştirilir ve daha sonra parafin banyoları için bir 65 ° C fırın içinde olabilir.
- Bir mikrotom ile 5 mikron kalınlığında koronal kesitler hazırlamak.
- Polilizin kaplı mikroskop lamı üzerine monte edin. </ Li>
- Slaytlar, birkaç ay boyunca oda sıcaklığında (RT) tutulabilir.
2.. Edu / BrDU Boyama
- Parafinden arındırma lamların ve antijen maskelenmesinin
- 5 dakika boyunca tolüen 3 hamam slaytların daldırma ile parafine gömülmüş beyin bölümleri Deparaffinize.
- % 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve 5 dk H2O içinde: Aşağıdaki gibi etanol konsantrasyonunun azaltılması her çözümler 2 banyoları içinde 3 dakika için rehidrate Slaytlar birkaç saat boyunca deiyonize edilmiş su içinde tutulabilir.
- Sitrat çözeltisi (10 mM, pH 6) içinde 10 dakika için dilimleri kaynatılır ve daha sonra 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su içinde inkübe edilir.
- Edu boyama
- Üreticinin protokolüne göre edu algılama yapın. 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 triton X-100 hücreleri geçirgenliği.
- Iyonu giderilmiş su içinde 10X solüsyon seyreltilmesi ile 1X tampon edu katkı hazırlayın. Bu çözelti taze yapılmış ve aynı Da kullanılmalıdıry.
- Edu Alexa Fluor 488 azitle dahil, Edu reaksiyon kokteyl hazırlayın. Aksi takdirde, reaksiyon en iyi şekilde devam olmaz, Tablo 2'de listelenen sırada aşağıdaki maddeleri eklemek için önemlidir. Hazırlık 15 dakika içinde edu reaksiyon kokteyl kullanın.
- Permeabilization tampon (adım 2.1.1) çıkarın, sonra PBS ile iki kez yıkayın.
- Edu kokteyl Reaksiyon 150 ul, bir lamel koymak ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Edu reaksiyon kokteyl kaldırmak, sonra PBS ile bir kez yıkayın.
- BrdU boyama
- % 7,5 keçi serumu ve PBS içinde% 7.5 fetal sığır serumu ile çökelti tamponu hazırlayın. Beyin dilimleri üzerinde doyurma tampon 150 ul bir lamel koymak ve spesifik olmayan bağlanma antikoru engellemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
- Lamel çıkarın. Satürasyon tamponu içinde 1/300 seyreltilmiş fare anti-BrdU birincil antikor, 150 ul, / a lamel koymak ve O inkübe4 ° C 'de N
- Lamel çıkarın, daha sonra PBS 3 kez yıkayın.
- Satürasyon tamponu içinde 1/400 seyreltilmiş keçi anti-fare-Alexa594 ikincil antikor, 150 ul, bir lamel koymak ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
- Lamel çıkarın, daha sonra PBS kez yıkayın.
- Nükleer boyama: 4 150 ul ', PBS içinde 1 ug / ml' de ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin, bir lamel koymak ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir.
- Orta montaj slaytlar monte edin.
3. Analizi
- Bir 20X objektif veya konfokal mikroskop ile bir floresan mikroskobu altında beyin bölümleri inceler ve dosya ayıran olarak üç kanal (488 nm, 594 nm ve UV) görüntü elde.
- Photoshop yazılımı ile görüntüler yığını.
- Dorsomedial serebral duvarın bir standart sektörde beyin bölümlerini analiz. Bu sektör, medial-yanal boyutta 100 um ve 10 μ 18 kutuları (veya daha fazla) ayrılmıştırgibi görüntülerde üst üste bir ızgara (Şekil 1) kullanılarak radyal boyutta m yükseklik 31, daha önce tarif edildiği.
- Örneğin ilk kutusu olarak ızgara hizalama ventriküler sınırına uzun eksenine paralel olan, ventriküler yüzeyindedir. Sonra her bin etiketli edu, BrdU'yu ve / veya piknotik çekirdekleri (apoptotik çekirdekler karşılık) numara. Çekirdeği iki bidonları içinde eşit alanları kaplar zaman onun büyük bir kısmını, ya da alt bin içerir bin iki bidonları sınırında bulunan bir çekirdek numara.
- İstatistiksel analiz.
Embriyo başına en az iki kortikal dilim analiz edin. Farklı litre en az 3 embriyo üzerinde deney tekrarlayın. Sonuçlar, ortalama (SEM) ortalama ± standart hatası olarak verilmelidir. İstatistiksel analizler iki yönlü ANOVA ve Bonferroni çoklu karşılaştırma posthoc testleri kullanılarak Graphpad Prism ile yürütülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2'de tarif edilen deneyde, edu sadece ışınlama sonrası ışınlama ve BrdU önce 1.5 saat uygulanmıştır. Hücrelerin Dört tip sonra Edu veya BrdU, her ikisi veya hiçbiri ya birleşmesiyle göre, 1 veya 4 saat sonrası ışınlama hazırlanan kortikal dilimleri ayırt edilmiştir (Şekil 2A ve 2B). Önemli olarak, ne de edu BrdU eklenmesi de radyasyon kaynaklı apoptosis (veriler gösterilmemiştir) seviyesini değiştirdi. Ayrıca, boyama yöntemleri EDU ve BrdU sadece algılama S-Faz DNA çoğaltma sırasında dahil edilmeyecekleri, fakat daha sonra ışınlama tamiri ile ilgili olduğu DNA sentezini algılamak için hassasiyeti yok izin verir. Gerçekten de, i) edu ne BrdU lekeleme de G0 aşamasında postmitotic nöronlar merkezi ve ii) edu (+) ve / veya BrdU (sayısı + olan kortikal levha, hücreler 1 saat sonrası radyasyon (PI) gözlenmiştir ) unirr göre ışınlanan artmamıştırbeyinleri adiated.
Edu (+) BrdU (+) çekirdekler
Edu (+) BrdU (+) çekirdekler 0 saat PI öncesi ve sonrası S fazında olduğu NSPC karşılık gelmektedir. Bunlar, bu nedenle, S fazında ışınlanmıştır. Şekiller 3B ve 3C'de gösterildiği gibi, kendi Ökromatin edu (+) ve aynı zamanda BrdU (+) olabilir. (-). Onların chromocenters BrdU (+) veya BrdU vardı ya (1 saat PI, edu (+) BrdU (+) çekirdekler S fazı bidonları lokalize olduğu Şekil 2B kurban anda S fazı tamamlanmasına bağlı olarak, yani Bunların dağılımı ve numaralar ışınlama etkilenmemiştir kutuları NSPC S fazı 31 yerine bilinmektedir 10, 4.. bu radyasyon bu zamanda DNA sentezinin bir tam blok uyarmadı göstermektedir.
Sürekli G2 fazında apikal nükleer göç bazal ile, NSPC en edu (+) BrdU (+) çekirdekler Işınlanmamış brai 4 saat PI ventrikül yakınlarında bulunduns (Şekil 2C). Bu 2'de Gy çekirdekleri S fazı bidonları kaldı ki beyinleri, çoğu apoptotik olmak ışınlanmış meydana gelmedi. Özet olarak bu veriler, NSPC S fazında ışınlanmış gecikmeli INM ve hücre ölümü ile birlikte intra-S kontrol noktaları aktive olduğunu göstermiştir.
Edu (+) BrdU (-) çekirdekler
Edu (+) BrdU (-) çekirdekler önce değil, ışınlama sonrası S fazında olan hücrelere karşılık gelmektedir. Bu çekirdeklerin Chromocenters edu (Şekil 3A) farelere enjekte edildiği zaman hücreler, geç S-fazında olduğunu gösteren edu (+) bulunmaktadır. NSPC G2 / M aşamalarında bu yana geçen 2 gelişen fare beyinde saat, edu (+) BrdU (-) NSPC 0 saat PI G2 vardı. Sürekli, en edu (+) BrdU (-) çekirdekler 1 saat PI Işınlanmamış beyinlerinde ventrikül yakın ilk bin bulundu. Bu birçoğu tipik mitoz (Şekil 2B) meydana S fazı, sonra NSPC of INM bir sonucudur. At1 saat PI, Edu sayısı (+) BrdU (-) çekirdekler belirgin ventrikül yüzeyinde azalır ve hiçbir mitoz rakam ışınlanmış beyinlerinde saptanabilir oldu. Bu veriler açık bir şekilde G2 ışınlanmış hücreler 1 saat PI içindeki G2 / M kapısının aktif olduğunu göstermektedir. Ayrıca, Edu çoğu (+) BrdU (-) bu çekirdeklerin NSPC G2 (Şekil 2C) sırasında çok radyosensitiftir olduğunu gösteren 4 saat PI apoptotik idi.
Edu (-) BrdU (-) çekirdekler
(-) Bir edu ile Hücreleri BrdU (-) çekirdeği G0 (çoğunlukla immatür nöronlar) hücreleri, ya da hayvan kurban (Şekil 3E) Edu katılmasından G1 kaldı NSPC ya karşılık gelmektedir. Şekil 2C'de, 1 saat ve 4 saat arasında karşılaştırma S fazında olan çekirdekleri ventric doğru gitmiş, oysa interkinetic nükleer taşıma, 1 saat sonra G1 ventriküle yakın çekirdekleri 4 saat sonra bazal göç apikal geçirdiğini göstermektedir yapmakular yüzey.
Şekil 2C'de gösterildiği gibi, bu çekirdeklerin çok 4 saat PI apoptotik edildi. Apoptotik edu sayısı (-) BrdU (-) çekirdekler ventriküler yüzeye yakın maksimal ve üst bidonları azalır. Bu veriler, bu nedenle, bu radyasyon kaynaklı apoptosis erken G1 fazında ve / veya post-mitotik nöronlar boyunca göç ışınlanmış olduğunu NSPC oluştu göstermektedir. Buna karşılık, hiç ya da çok az sayıda apoptotik çekirdekler kortikal plaka bulundu. Bu nihai hedefe ulaşmış nöronların radyasyon direnci ile uyumludur.
Edu (-) BrdU (+) çekirdekler
Edu (-) BrdU (+) çekirdekler ışınlama sonrası S evresine girdi hücrelere karşılık gelmektedir. Genellikle 1 saat PI, onlar değil chromocenters arasında ökromatin bir yaygın BrDU etiketleme gösterdi. Böylece o zaman (Şekil 3D) erken S fazında idi. 1 saat PI S phas içinde sayı ve yerelleştirmeEdu e ambarlar (-) BrdU (+) çekirdekler kontrol ve ışınlanmış beyinleri arasında benzer. Böylece 1. hr PI sırasında S-faz giriş fare gelişen beyin (Şekil 2B) radyasyon tarafından etkilenmemiştir. (-) BrdU (+) çekirdekleri ve bu çekirdeklerin en fazla 4 saat PI apoptotik vardı İlginçtir, ışınlanmış beyinlerinde 1 saat ve 4 saat PI karşılaştırılması Edu sayısında bir düşüş gösterir. Bu radyasyon sonrası S evresine girdi hücreler içi-S kontrol noktaları aktive ve (Şekil 2C) sonra apoptozise düşündürmektedir.
Şekil 1.. Dapi. Edu ve BrdU boyama yanı sıra nükleer morfoloji dorsomedial Cerebra standart bir sektörde analiz edilir ile boyandı E14.5 fare embriyoları serebral hemisfer Beyin bölümü koronal bölümünde Analizimetinde tarif edildiği gibi 18 depo (veya daha fazla) halinde bölünmüş bir ızgara kullanarak l duvar. Ölçek çubuğu:. 20 um , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Işınlanmış nöral kök ve progenitör hücre Şekil 2.. Hücre döngüsünün ilerlemesi (Roque ark Şekil., Hücreler, 2012 Kök). Deneysel tasarım ve DAPI (mavi) (A) şematik diyagramı, edu (yeşil) ve BrdU (kırmızı) 1 ve 4 saat PI (2 Gy) de koronal kortikal dilimleri bulundu boyanma. . Ölçek çubuğu = 20 mikron (B, C) edu Sayılar / bin (+) BrdU (-), Edu (+) BrdU (+), Edu (-) BrdU (+) veya edu (-) BrdU (- Normal bir mo ile) çekirdeklerışınlanmamış kontroller (mavi) ve normal (kırmızı) veya apoptotik ışınlanmış olarak (piknotik, siyah) morfoloji (2 Gy) ile rphology 1 saat (B) veya 4 saat PI (C) kortisler. Resim apoptotik nüve proteinleri, 1 saat PI (B) 'de tespit edilmiştir. İstatistiksel analiz Bonferroni post hoc testleri kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: BrdU, 5-bromo-2'-deoksiüridin; DAPI, 4'-6-diamidino-2-fenilindol; Edu, 5-etinil-2'deoxyuridine; IZ, ara bölge; SVZ'una, bölge subventricular; VZ, ventriküler bölge. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
. Şekil 3. Diferansiyel Edu ve ökromatin ve chromocenters Üst panel BrdU boyama: Z-yığınedu (yeşil) konfokal görüntüleri, BrdU boyama (kırmızı) ve DNA parlak mavi odakları olarak chromocenters algılanmasını sağlayan DAPI (mavi) ile zıt. Boyamaları ışınlama ve BrdU 0 saat önce PI (Ölçek çubuğu: 5 mikron) (sadece Işınlanmamış kontrol gösterilir) edu 1.5 saat teslim edildi deneylerde 1 saat PI toplanan bir embriyonik beyin bölümünde yapıldı. bir görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.
Alt paneller Edu ve koronal beyin dilimleri tespit BrdU boyanma 5 farklı desen örneklerini göstermektedir. Görüntü birleştirme ve tek kanal (Ölçek çubuğu: 2 mikron) gösterilmiştir:
A) edu ile Nucleus (+) chromocenters ve Edu (+) veya edu (-) Ökromatin. Edu böylece perisentrik Heterokromatinin replikasyonu sırasında geç S fazında dahil edilmiştir: hücreler i vardı0 saat PI n G2.
B) edu ile Nucleus (+) Ökromatin ve BrdU (+) chomocenters: ökromatin en çoğaltılır zaman Edu erken S fazında dahil edilmiştir ve BrdU geç S fazında dahil edilmiştir: hücreler 0 saat PI S fazında vardı .
Edu ile C) Nucleus (+) BrdU (+) Ökromatin ve Edu (-) BrdU (-) chromocenters. Edu ve BrdU S fazının ilk bölümünde dahil edilmiştir: Hücreler 0 saat PI erken S fazında idi.
BrdU D) Nucleus (+) Ökromatin ve Edu (-) BrdU (-) chromocenter. BrdU S safhasının başında dahil edilmiştir. Hücreler 0 saat PI geç G1 vardı ve bundan sonra S evresine girdi.
Edu ile E) Nucleus (-) BrdU (-) Ökromatin ve chromocenters. Hücreler G0 (immatür nöronlar) veya G1 fazında ve Edu ve BrdU bakliyat S fazına girmediniz.
| Çözüm | Kuluçka | Sıcaklık | Basınç | Çalkalama | |
| 1 | Alkol% 70 | 30 dakika | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 2 | alkol% 95 | 15 dakika | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 3 | alkol% 95 | 30 dakika | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 4 | alkol% 95 | 45 dakika | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 5 | alkol% 100 | 15 dakika | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 6 | alkol% 100 | 30 dakika | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 7 | alkol% 100 | 1 saat | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 8 | Toluen% 100 | 30 dakika | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 9 | Toluen% 100 | 45 dakika | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 10 | Toluen% 100 | 1 saat | 35 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 11 | Parafin | 30 dakika | 58 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 12 | Parafin | 1 saat | 58 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 13 | Parafin | 1 saat | 58 ° C | üzerinde | üzerinde |
| 14 | Parafin | 1.5 saat | 58 ° C | üzerinde | üzerinde |
TabloParafine 1. Vakum infiltrasyon işlemci programı.
| 1 slayt için reaksiyon bileşenleri | |
| 1X Edu reaksiyon tamponu | 128.64 ul |
| CuSO 4 | 6 ul |
| Edu Alexa Fluor azid | 0.36 ul |
| 1X Edu Reaksiyon tamponu katkı | 15 ul |
| Toplam hacmi | 150 ul |
Tablo 2.. Edu reaksiyon kokteyller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Edu 1.5 saat katılmasıyla göre burada anlatılan deneysel tasarım önce ışınlama izin hemen sonra ışınlama ve BrdU birleşme NSPCs bir sonra S ve G2 / M kontrol noktaları etkinleştirmek mümkün ancak 1 st saat boyunca G1 / S noktası değildir gösteri fetal fare beyninde genotoksik stres. Bize özel olarak, S fazına girişin oranını takdir izin edu sadece 1 saat farenin kurban öncesinde, ışınlama ve BrdU sonra farklı zamanlarda enjekte edildiği ve diğer deneyler gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler NSPC vivo 22,23 bir genotoksik stres sonra G1 / S tutuklama aktive olmadığını göstermiştir.
Bu nedenle, DNA onarımı ve apoptoz arasında seçim, bu hücrelerde genom stabilitesini garanti altına mekanizmaların doğasına sorununu koyma G1 / S noktasında oluşmaz.
Protokol kolay ve hızlı. Farklıadımlar belirgin bir zorluk mevcut. Bu teknik, çapraz reaksiyona 32 gösterilmiştir kloro-deoksiüridin kullanımı (CldU) ve iyodo-deoksiüridin (damar içi) bir alternatiftir.
Protokol pek çok biyolojik sorulara kolaylıkla esnek ve uyarlanabilir gibi uygulamaların geniş bir paneli, kabul edilebilir. Değişikliklere örnek Roque önerilen ve 23 işbirlikçileri, Etienne ve işbirlikçileri 22, ve Rousseau ve işbirlikçileri 24 edilmektedir. Ayrıca birçok hücre belirteçleri ya da örneğin DNA hasar yanıt olarak ilgili proteinlerin immünofloresan tespiti ile birleştirilebilir. Bu durumda, BrdU ve edu tespiti hem de diğer işaretleyicilerin bağışıklık algılama lehine, ticari farklı florofor ile gerçekleştirilebilir ki, dikkat edin.
NSPC in vivo dahil edu ve BrdU tarafından da daha fazla biyokimyasal analiz için akış sitometrisi ayırma hücresinde kullanılabilir. Son olarak, inciyöntem mutant farelerin farklı tipte ya da (iyonize radyasyon dışında) genotoksik gerilimlerin veya hücre döngüsü ilerlemesini etkileyen herhangi bir başka tedavinin diğer türlerde NSPC hücre döngüsü ilerleyişini izlemek için gerçekleştirilebilir gelebilir. Ayrıca kolayca başka bir çoğaltma dokulara uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Şerefe-ENVIRONNEMENT - bu sonuçlara yol açan araştırma Electricité de France (EDF) dan ve l'Agence Nationale de la Recherche dan, 323.267 hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon aldı n ° etti et Santé-Travail'in (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
