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Neuroscience

Genotoxic तनाव के बाद तंत्रिका स्टेम और माउस विकासशील मस्तिष्क में पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का आकलन कोशिका चक्र प्रगति

doi: 10.3791/51209 Published: May 7, 2014

Summary

Thymidine की दो analogs के प्रशासन, शिक्षा और BrdU, गर्भवती चूहों में भ्रूण माउस मस्तिष्क में तंत्रिका और पूर्वज कोशिकाओं में कोशिका चक्र प्रगति का विश्लेषण की अनुमति देता है. इस विधि के मस्तिष्क के विकास के दौरान विकिरण सहित genotoxic तनाव,, के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए उपयोगी है.

Abstract

सेरेब्रल कॉर्टेक्स के न्यूरॉन्स भ्रूण के मस्तिष्क के पार्श्व ventricles अस्तर एक pseudostratified उपकला रूप है जो तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार (NSPC) से मस्तिष्क के विकास के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं. इस तरह के विकिरण के रूप में genotoxic तनाव, NSPC की उच्च संवेदनशीलता से संबंधित विकासशील मस्तिष्क पर अत्यधिक हानिकारक प्रभाव पड़ता है. शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र की व्याख्या क्षतिग्रस्त ऊतकों में कोशिका चक्र के माध्यम से NSPC प्रगति निर्धारित करने के लिए एक सटीक विधि की आवश्यकता है जो कोशिकाओं के इन विशेष प्रकार के डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया की विशेषताओं पर निर्भर करता है. यहां गर्भवती चूहों और भ्रूण के मस्तिष्क के राज्याभिषेक वर्गों में इन दो thymidine analogues के आगे का पता लगाने में edu और BrdU की लगातार intraperitoneal इंजेक्शन के आधार पर एक विधि दिखाया गया है. Edu और BrdU दोनों एस चरण के दौरान नकल कोशिकाओं के डीएनए में शामिल कर रहे हैं और दो विभिन्न तकनीकों (azide या द्वारा पता चला रहे हैंउनके साथ पता लगाने की सुविधा है, जो एक विशिष्ट एंटीबॉडी, क्रमशः),. Edu और BrdU धुंधला हो जाना तो पृष्ठीय telencephalon का एक मानक क्षेत्र में निलय मार्जिन से इसकी दूरी के समारोह में प्रत्येक NSPC नाभिक के लिए निर्धारित कर रहे हैं. इस प्रकार इस दोहरे लेबलिंग तकनीक डीएनए की क्षति के जवाब में सेल चक्र गिरफ्तारी के लिए अग्रणी एक सेल चक्र जांच की चौकी को सक्रिय किया है कि उन लोगों से सेल चक्र के माध्यम से प्रगति की है कि कोशिकाओं भेद देता है.

प्रयोग का एक उदाहरण edu तुरंत बाद विकिरण और BrdU पहले इंजेक्ट किया गया था और विकिरण निम्नलिखित 4 घंटा के भीतर प्रदर्शन का विश्लेषण जो में, प्रस्तुत किया है. इस प्रोटोकॉल वे विकिरणित किया गया है, जिस पर सेल चक्र के चरण के समारोह में NSPC की तीव्र डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया का एक सटीक विश्लेषण प्रदान करता है. इस विधि जीवित ऊतकों में कोशिका चक्र प्रगति पर एक विशेष उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए आसानी से transposable कई अन्य प्रणालियों के लिए है.

Introduction

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भ्रूण के मस्तिष्क के विकास के दौरान, सेरेब्रल कॉर्टेक्स का प्रक्षेपण न्यूरॉन्स तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NSPC) के विभिन्न प्रकार से बना एक pseudostratified उपकला लाइनों है कि पार्श्व निलय, निलय क्षेत्र में उत्पन्न कर रहे हैं. NSPC के अलावा, तंत्रिका स्टेम सेल के रूप में काम जो रेडियल glial कोशिकाओं (RGC), (INM) interkinetic परमाणु प्रवास गुजरना: वे निलय क्षेत्र के बेसल सीमा पर वेंट्रिकल और एस चरण की सतह पर पिंजरे का बँटवारा प्रदर्शन (VZ) 1, 2,3. वे विभाजित कर सकते हैं या तो संतुलित रूप से दो RGC उत्पन्न करने के लिए या asymmetrically एक RGC और एक न्यूरॉन या एक मध्यवर्ती पूर्वज सेल (आईपीसी) 4, 5 उत्पन्न करने के लिए. आईपीसी पिछले एक सममित विभाजन के बाद वे दो अपरिपक्व प्रक्षेपण न्यूरॉन्स 6-8 उत्पन्न जहां subventricular क्षेत्र कहा जाता है एक overlying proliferating परत (SVZ), की ओर पलायन. RGC के विपरीत, भारतीय दंड संहिता (9 में समीक्षा) INM से गुजरना नहीं है. नव सृजित न्यूरॉन्स migrcortical प्लेट (सीपी) 10, 8 में अपने अंतिम गंतव्य तक पहुंचने के मध्यवर्ती क्षेत्र (IZ) के माध्यम से रेडियल फाइबर साथ त्रिज्यात खा लिया. इन सभी घटनाओं का सही समय एक सही cortical विकास के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए तंत्रिका पूर्वज आबादी के भेदभाव को प्रसार से स्विच G1 चरण की अवधि 11, 12 के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. G1 चरण की लंबी सेल भेदभाव के साथ इस प्रकार इसे संबद्ध.

इस तरह के (13 में समीक्षा) विकिरण, गंभीर रूप से क्षीण मस्तिष्क के विकास के रूप में genotoxic तनाव,. हम और दूसरों NSPC विकिरण प्रेरित apoptosis 14, 15,16 को अत्यधिक प्रवण हैं कि पता चला है. आयनीकरण विकिरण proliferating कोशिकाओं के लिए सबसे गंभीर नुकसान कर रहे हैं कि डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता प्रेरित. साइकिल कोशिकाओं में डीएनए की क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) की एक आवश्यक घटक G1 / एस या G2 / एम संक्रमण पर या एस के दौरान सेल चक्र चौकियों की सक्रियता हैचरण (इंट्रा एस जांच की चौकी) 17-21. वे डीएनए की क्षति की मरम्मत या भी क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए समय प्रदान करने के लिए सेल चक्र प्रगति ब्लॉक. नतीजतन, कोशिका मृत्यु के साथ ही देरी सेल चक्र प्रगति विकिरण जोखिम 22-24 ionizing के जवाब में मस्तिष्क के विकास को बदल सकता है. यह विकिरणित माउस भ्रूण के मस्तिष्क में NSPC में सेल चक्र चौकियों की सक्रियता का आकलन करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए इस प्रकार दिलचस्प था.

सेल चक्र की प्रगति नियमित रूप से एक thymidine अनुरूप, 5 ब्रोमो 2'-deoxyuridine (BrdU) के समावेश का उपयोग कर पीछा किया जाता है. BrdU डीएनए नकल है जब सेल चक्र, के एस चरण के दौरान शामिल किया है. BrdU के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग BrdU की नब्ज दौरान एस चरण में थे कि कोशिकाओं की उसके बाद पता लगाने की अनुमति देता है.

एक उपन्यास thymidine अनुरूप, 5 Ethynyl 2'-deoxyuridine (edu) एक फ्लोरोसेंट azide ने पता लगाया है. edu और बी का पता लगाने के लिए विभिन्न तरीके RDU सेल चक्र प्रगति का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है जो दोनों thymidine analogs के साथ पता लगाने, सक्षम करने, 25 पार प्रतिक्रिया नहीं है. आम तौर पर कोशिकाओं पहले edu के साथ स्पंदित और फिर दोनों incorporations के बीच के समय घंटे 25, 26 के जोड़े रहता है जहां BrdU, साथ स्पंदित कर रहे हैं. Edu युक्त संस्कृति मीडिया में BrdU के अलावा edu के बहिष्कार के साथ डीएनए में BrdU की रियायत के समावेश में यह परिणाम है, जबकि केवल BrdU समावेश 27 में मीडिया के परिणाम को equimolar या आधा equimolar BrdU साथ edu 25 के एक साथ इसके अलावा. यह सामान्य रूप से पहले दूसरा लेबल के अलावा संस्कृति मीडिया से पहले लेबल को दूर करने के लिए आवश्यक हैं कि धोने के कदम को नष्ट करने से दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल सरल करता है. यह भी एस चरण प्रविष्टि या सेल की आबादी के बाहर निकलने का सटीक समय निर्धारित करने के लिए धोने कदम संभव नहीं हैं जहां vivo में अध्ययन, के लिए एक विशेष रुचि का है.

टी "> हाल ही में, edu और BrdU 23, 24,22 का उपयोग भ्रूण माउस मस्तिष्क में दोहरे पल्स लेबलिंग की एक विधि utero विकिरण में बाद सेल चक्र प्रगति और NSPC की INM का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है. इसके अलावा यह प्रदर्शन किया गया है के दौरान, कि एस चरण, माउस कोशिकाओं पहले euchromatin क्षेत्रों और फिर pericentric हेट्रोक्रोमैटिन 28,29,30 को दोहराने. दिलचस्प है, interphasic नाभिक में क्लस्टर अलग गुणसूत्रों की pericentric हेट्रोक्रोमैटिन भी chromocenters के रूप में जाना जाता है और उज्ज्वल foci के रूप में DAPI धुंधला द्वारा आसानी से detectable heterochromatic foci के रूप में. इसलिए, euchromatin और chromocenters का अंतर edu और BrdU stainings ज्यादा ठीक NSPC के एस चरण प्रगति का विश्लेषण करने के लिए हमारी मदद की.

इस विधि में इस जांच की चौकी जीनोम स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है क्योंकि बहुत आश्चर्य की बात है जो NSCP 22-24 में G1 / एस जांच की चौकी, की स्पष्ट कमी के प्रदर्शन की अनुमति दी. कई ऍक्स्पedu और BrdU दालों के विभिन्न संयोजनों पर आधारित erimental डिजाइन उदर और पृष्ठीय telencephalon में सेल चक्र प्रगति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम E14.5 माउस भ्रूण की गर्भ विकिरण में निम्नलिखित पहले 4 घंटे के भीतर NSPC की तीव्र डीएनए की क्षति के अध्ययन की अनुमति प्रोटोकॉल का एक उदाहरण दे.

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Protocol

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1. पशु प्रक्रियाओं

इस प्रोटोकॉल 24 नवंबर से यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक, 1986 (86/609/EEC) के अनुपालन में बनाया गया है और पशु कल्याण (CETEA-सीईए DSV आईडीएफ) पर हमारे संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.

  1. Edu / BrdU और E14.5 गर्भवती चूहों के विकिरण (2A चित्रा) के साथ इंजेक्शन.
    1. पीबीएस में 5 मिलीग्राम / एमएल पर मिलीग्राम और BrdU 1 मिलीग्राम / पर edu के एक समाधान तैयार करें. गर्भवती चूहों में एक 25 जी सुई का उपयोग edu समाधान के 100 μl के एक अंतर peritoneal इंजेक्शन (आईपी) करें. 1.5 घंटे बाद, 0 Gy या 2 GY (0.6 Gy / मिनट) पर चूहों (कुल शरीर विकिरण) चमकाना. इसके तत्काल बाद, गर्भवती चूहों में एक 25 जी सुई का उपयोग BrdU समाधान की (आईपी) 200 μl इंजेक्षन.
  2. भ्रूण दिमाग का राज्याभिषेक स्लाइस की तैयारी.
    1. विकिरण के बाद 1 घंटा या 4 घंटा में, कार्बन डाइऑक्साइड से गर्भवती चूहों euthanize.
    2. पेट CAVI खोलेंकैंची का उपयोग तीन सेंटीमीटर से अधिक Ty. सींग का दोनों हाथ - पांव सेक्शनिंग द्वारा गर्भाशय के बाकी हिस्सों से दो गर्भाशय सींग अलग करें. पीबीएस 0.6% ग्लूकोज युक्त एक पेट्री डिश में गर्भाशय सींग स्थानांतरण. भ्रूण को अलग करने के क्रम में संदंश के साथ गर्भाशय सींग खोलें. संदंश का उपयोग प्रत्येक भ्रूण की गर्भ थैली निकालें.
    3. संदंश के साथ भ्रूण सिर काटना और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde (पीएफए, = पीएच 7.4) ओ / एन में विसर्जन से उन्हें ठीक
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम एक रात के लिए पीबीएस में भ्रूण सिर कुल्ला प्रमुखों कई दिनों के लिए पीबीएस में रखा जा सकता है.
    5. तालिका 1 में संकेत के रूप में एक निर्वात घुसपैठ प्रोसेसर का उपयोग आयल में शामिल करें सिर. Embedding प्रमुखों भी इथेनॉल और xylen स्नान के लिए एक रासायनिक हुड के तहत किया है, और फिर पैराफिन स्नान के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में किया जा सकता है.
    6. एक सूक्ष्म साथ 5 माइक्रोन मोटी राज्याभिषेक वर्गों को तैयार है.
    7. Polylysine लेपित खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट. </ ली>
    8. स्लाइड्स कई महीनों के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर रखा जा सकता है.

2. Edu / BrdU धुंधला हो जाना

  1. Deparaffinization और प्रतिजन unmasking
    1. 5 मिनट के लिए टोल्यूनि के 3 स्नान में स्लाइड्स के विसर्जन से आयल एम्बेडेड मस्तिष्क वर्गों Deparaffinize.
    2. इथेनॉल 100%, इथेनॉल 95%, इथेनॉल 70%, और 5 मिनट एच 2 ओ में: निम्नलिखित के रूप में इथेनॉल एकाग्रता को कम करने के लिए प्रत्येक समाधान के 2 स्नान में 3 मिनट के लिए rehydrate स्लाइड्स कई घंटे के लिए विआयनीकृत पानी में रखा जा सकता है.
    3. साइट्रेट समाधान (10 मिमी, पीएच 6) में 10 मिनट के लिए स्लाइस उबाल लें, और फिर 5 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में सेते हैं.
  2. Edu धुंधला
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार edu पता लगाने के कार्य करें. 10min के लिए पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं Permeabilize.
    2. विआयनीकृत पानी में 10X समाधान गिराए द्वारा 1X edu बफर additive तैयार करें. यह समाधान ताजा बना और उसी दा पर इस्तेमाल किया जाना चाहिएवाई.
    3. Edu एलेक्सा Fluor 488 azide सहित edu प्रतिक्रिया कॉकटेल तैयार करें. यह अन्यथा, प्रतिक्रिया बेहतर आगे नहीं बढ़ेगा, 2 टेबल में सूचीबद्ध के आदेश के बाद सामग्री जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है. तैयारी के 15 मिनट के भीतर edu प्रतिक्रिया कॉकटेल का प्रयोग करें.
    4. Permeabilization बफर (कदम 2.1.1) निकालें, तो पीबीएस के साथ दो बार धोने.
    5. Edu प्रतिक्रिया कॉकटेल के 150 μl जोड़ें, एक coverslip रखा, और आरटी पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    6. Edu प्रतिक्रिया कॉकटेल निकालें, तो पीबीएस के साथ एक बार धोने.
  3. BrdU धुंधला हो जाना
    1. 7.5% बकरी सीरम और पीबीएस में 7.5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ संतृप्ति बफर तैयार करें. , मस्तिष्क स्लाइस पर संतृप्ति बफर के 150 μl जोड़ें एक coverslip रखा, और बाध्यकारी गैर विशिष्ट एंटीबॉडी ब्लॉक करने के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
    2. Coverslip निकालें. संतृप्ति बफर में 1/300 में पतला माउस विरोधी BrdU प्राथमिक एंटीबॉडी के 150 μl जोड़ें, / एक coverslip डाला और हे सेते4 डिग्री सेल्सियस पर एन
    3. Coverslip निकालें, तो पीबीएस में 3 बार धोएं.
    4. संतृप्ति बफर में 1/400 में पतला बकरी विरोधी माउस Alexa594 माध्यमिक एंटीबॉडी के 150 μl जोड़ें, एक coverslip रखा, और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
    5. Coverslip निकालें, तो पीबीएस में एक बार धोने.
    6. परमाणु धुंधला: 4 की 150 μl 'पीबीएस में 1 ग्राम / मिलीलीटर में ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) जोड़ने के लिए, एक coverslip डाला और आरटी पर 2 मिनट के लिए सेते हैं.
    7. बढ़ते मध्यम में स्लाइड माउंट.

3. विश्लेषण

  1. एक 20x उद्देश्य या एक confocal खुर्दबीन के साथ एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे मस्तिष्क वर्गों की जांच करने और फ़ाइलों को अलग रूप में तीन चैनलों (488 एनएम, 594 एनएम और यूवी) में छवियों को प्राप्त.
  2. फ़ोटोशॉप सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को हो चुकी है.
  3. Dorsomedial मस्तिष्क दीवार का एक मानक क्षेत्र में मस्तिष्क वर्गों का विश्लेषण करें. इस क्षेत्र में अपनी औसत दर्जे का पार्श्व आयाम में 100 माइक्रोन है और 10 μ के 18 डिब्बे (या अधिक) में बांटा गया हैके रूप में चित्र पर superposed एक ग्रिड (चित्रा 1) का उपयोग कर अपने रेडियल आयाम में मीटर ऊंचाई पहले 31 में वर्णित है.
    1. इस तरह पहली बिन के रूप में ग्रिड संरेखित निलय सीमा को अपने लंबे अक्ष समानांतर साथ, निलय सतह पर है. फिर एक बिन में लेबल edu, BrdU और / या pyknotic नाभिक (apoptotic नाभिक को इसी) संख्या. नाभिक दो डिब्बे के भीतर बराबर क्षेत्रों में रह रहे हैं जब अपने बड़े हिस्से, या कम बिन में शामिल हैं, जो बिन में दो डिब्बे की सीमा पर स्थित एक नाभिक संख्या.
  4. सांख्यिकीय विश्लेषण.

भ्रूण के अनुसार कम से कम दो cortical स्लाइस का विश्लेषण करें. विभिन्न litters से कम से कम 3 भ्रूण पर प्रयोग दोहराएँ. परिणाम मतलब (SEM) का मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में दी जानी चाहिए. सांख्यिकीय विश्लेषण दो तरह से एनोवा और Bonferroni एकाधिक तुलना posthoc परीक्षण का उपयोग कर GraphPad चश्मे के साथ आयोजित की जाती हैं.

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Representative Results

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चित्रा 2 में वर्णित प्रयोग में, edu बस विकिरण के बाद विकिरण और BrdU पहले 1.5 घंटा दिलाई. कोशिकाओं के चार प्रकार तो edu या BrdU, दोनों या कोई भी या तो के समावेश के अनुसार, 1 या 4 घंटा बाद विकिरण पर तैयार cortical स्लाइस में प्रतिष्ठित थे (आंकड़े 2A और 2 बी). महत्वपूर्ण बात है, edu और न ही BrdU समावेश न तो विकिरण प्रेरित apoptosis (नहीं दिखाया डेटा) का स्तर बदला है. इसके अलावा, धुंधला तरीकों edu और BrdU का ही पता लगाने के एस चरण में डीएनए प्रतिकृति के दौरान शामिल किया है लेकिन फिर भी विकिरण के बाद मरम्मत के साथ जुड़ा हुआ है कि डीएनए संश्लेषण का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता नहीं है अनुमति देते हैं. दरअसल, मैं) edu और न ही BrdU धुंधला न तो G0 चरण में postmitotic न्यूरॉन्स स्थित और द्वितीय) edu (+) और / या BrdU (की संख्या + कर रहे हैं जहां cortical थाली, की कोशिकाओं में 1 घंटे बाद विकिरण (पीआई) में मनाया गया ) unirr की तुलना में विकिरणित में वृद्धि नहीं की गई थीदिमाग adiated.

Edu (+) BrdU (+) नाभिक

Edu (+) BrdU (+) नाभिक 0 घंटा गड़बड़ी से पहले और बाद एस चरण में थे कि NSPC के अनुरूप हैं. वे इस प्रकार एस चरण में विकिरणित थे. आंकड़े 3 बी और 3 सी में दिखाया गया है उनके euchromatin edu (+) है और यह भी BrdU (+) हो सकता है. (-). उनके chromocenters BrdU (+) या BrdU या तो थे (1 घंटा गड़बड़ी पर, edu (+) BrdU (+) नाभिक एस चरण डिब्बे में स्थानीयकृत थे कि चित्रा 2B से पता चलता है बलिदान के समय एस चरण पूरा होने पर निर्भर करता है यानी उनका वितरण और संख्या विकिरण से प्रभावित नहीं थे डिब्बे NSPC एस चरण में 31 प्रदर्शन करने के लिए जाना जाता है, जहां 10, 4.. यह विकिरण इस समय डीएनए संश्लेषण का एक पूरा ब्लॉक प्रेरित नहीं किया है कि पता चलता है.

लगातार G2 चरण के दौरान शिखर परमाणु प्रवास करने के लिए बेसल साथ, NSPC की सबसे edu (+) BrdU (+) नाभिक unirradiated बीआरएआई में 4 घंटा गड़बड़ी पर वेंट्रिकल के पास पाए गएएनएस (चित्रा -2). इस 2 में Gy नाभिक एस चरण डिब्बे में बने रहे, जिसमें दिमाग, उनमें से कई apoptotic जा रहा है विकिरणित नहीं होती थी. कुल मिलाकर इस डेटा NSPC एस चरण में विकिरणित देरी INM और कोशिका मृत्यु के साथ मिलकर अंतर एस चौकियों को सक्रिय कर दिखाया.

Edu (+) BrdU (-) नाभिक

Edu (+) BrdU (-) नाभिक से पहले और नहीं विकिरण के बाद एस चरण में थे कि कोशिकाओं के अनुरूप हैं. इन नाभिक की Chromocenters edu (चित्रा 3) चूहों में इंजेक्ट किया गया था जब कोशिकाओं देर एस चरण में थे यह दर्शाता है कि edu (+) कर रहे हैं. NSPC की G2 / एम चरणों के बाद से पिछले 2 विकासशील माउस मस्तिष्क में मानव संसाधन, शिक्षा (+) BrdU (-) NSPC 0 घंटा गड़बड़ी पर G2 में थे. लगातार सबसे edu (+) BrdU (-) नाभिक 1 घंटा गड़बड़ी पर unirradiated दिमाग में वेंट्रिकल के पास पहले बिन में पाए गए. यह उनमें से कई ठेठ mitotic आंकड़े (चित्रा 2 बी) का गठन जहां एस चरण के बाद, NSPC की INM का परिणाम है. पर1 घंटा गड़बड़ी, edu की संख्या (+) BrdU (-) नाभिक काफी निलय सतह पर कम और कोई mitotic आंकड़ा विकिरणित दिमाग में detectable था. ये आंकड़े स्पष्ट रूप से G2 में विकिरणित कोशिकाओं 1 घंटा गड़बड़ी के भीतर G2 / एम चेकपॉइंट सक्रिय दिखा. इसके अलावा, edu के सबसे (+) BrdU (-) इन नाभिक की NSPC G2 (चित्रा -2) के दौरान अत्यधिक radiosensitive हैं कि प्रदर्शन 4 घंटा गड़बड़ी पर apoptotic थे.

Edu (-) BrdU (-) नाभिक

(-) एक edu के साथ कोशिकाओं BrdU (-) नाभिक G0 (मुख्य अपरिपक्व न्यूरॉन्स) में कोशिकाओं, या पशु बलि (चित्रा 3E) को edu समावेश से G1 में बने रहे कि NSPC या तो के अनुरूप हैं. चित्रा -2 में 1 घंटा और 4 घंटे के बीच तुलना एस चरण में थे कि नाभिक ventric की ओर चला गया, जबकि interkinetic परमाणु प्रवास, 1 घंटा में G1 में निलय के करीब थे कि नाभिक 4 घंटा में बेसल प्रवास को उनके शिखर लिया कि बनाने से पता चलता हैular सतह.

चित्रा -2 में दिखाया गया है कि इन नाभिक के कई 4 घंटा गड़बड़ी पर apoptotic थे. apoptotic edu की संख्या (-) BrdU (-) नाभिक निलय सतह के पास अधिक से अधिक था और ऊपरी डिब्बे में कम हो जाती है. ये आंकड़े इसलिए कि विकिरण प्रेरित apoptosis जल्दी G1 चरण और / या बाद mitotic न्यूरॉन्स पलायन दौरान विकिरणित किया गया है कि NSPC में हुई सुझाव देते हैं. इसके विपरीत, कोई नहीं या बहुत कम apoptotic नाभिक cortical थाली में पाए गए. यह अपने अंतिम गंतव्य तक पहुँच चुके हैं कि न्यूरॉन्स के विकिरण प्रतिरोध के अनुसार है.

Edu (-) BrdU (+) नाभिक

Edu (-) BrdU (+) नाभिक विकिरण के बाद एस चरण में प्रवेश किया है कि कोशिकाओं के अनुरूप हैं. आम तौर पर 1 घंटा गड़बड़ी पर, वे नहीं बल्कि chromocenters की, euchromatin की एक फैलाना BrdU लेबलिंग से पता चला है. इस प्रकार वे उस समय (चित्रा 3 डी) पर जल्दी एस चरण में थे. 1 घंटा गड़बड़ी पर है phas भीतर संख्या और स्थानीयकरणedu के ई डिब्बे (-) BrdU (+) नाभिक नियंत्रण और विकिरणित दिमाग के बीच इसी तरह की है. इस प्रकार 1 घंटा गड़बड़ी दौरान एस चरण प्रविष्टि माउस विकासशील मस्तिष्क (चित्रा 2 बी) में विकिरण से प्रभावित नहीं था. (-) BrdU (+) नाभिक और इन नाभिक की सबसे 4 घंटा गड़बड़ी पर apoptotic थे दिलचस्प है, विकिरणित दिमाग में 1 घंटा और 4 घंटा गड़बड़ी की तुलना edu की संख्या में गिरावट को दर्शाता है. यह विकिरण के बाद एस चरण में प्रवेश किया है कि कोशिकाओं के अंदर एस चौकियों को सक्रिय और (चित्रा -2) उसके बाद apoptosis लिया है कि पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. DAPI. Edu और BrdU धुंधला के साथ ही परमाणु आकारिकी dorsomedial प्रमस्तिष्क के एक मानक क्षेत्र में विश्लेषण कर रहे हैं के साथ दाग E14.5 माउस भ्रूण के मस्तिष्क गोलार्द्ध के मस्तिष्क अनुभाग राज्याभिषेक अनुभाग का विश्लेषणपाठ में वर्णित के रूप में 18 डिब्बे (या अधिक) में विभाजित एक ग्रिड का उपयोग एल दीवार. स्केल बार:. 20 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
विकिरणित तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल का चित्रा 2. कोशिका चक्र प्रगति (रोक एट अल से चित्रा., कोशिकाओं, 2012 स्टेम). प्रयोगात्मक डिजाइन और DAPI (नीला) (ए) योजनाबद्ध आरेख, edu (हरा), और BrdU (लाल) 1 और 4 घंटा पीआई (2 Gy) में राज्याभिषेक cortical स्लाइस में पाया धुंधला पैटर्न. . स्केल बार = 20 माइक्रोन (बी, सी) edu की संख्या / बिन (+) BrdU (-), edu (+) BrdU (+), edu (-) BrdU (+), या edu (-) BrdU (- एक सामान्य मो के साथ) नाभिकnonirradiated नियंत्रण (नीला) में और एक सामान्य (लाल) या apoptotic विकिरणित में (pyknotic, काला) आकारिकी (2 Gy) के साथ rphology 1 घंटा (बी) या 4 घंटा पीआई (सी) में cortices. कोई apoptotic नाभिक 1 घंटा पीआई (बी) में पाया गया. सांख्यिकीय विश्लेषण Bonferroni पद अस्थायी परीक्षण का उपयोग कर प्रदर्शन किया था. लघुरूप: BrdU, 5 ब्रोमो 2'-deoxyuridine; DAPI, 4'-6 diamidino-2-phenylindole; Edu, 5 ethynyl-2'deoxyuridine; IZ, मध्यवर्ती क्षेत्र; SVZ, subventricular क्षेत्र; VZ, निलय क्षेत्र. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
. चित्रा 3 विभेदक edu और euchromatin और chromocenters ऊपरी पैनल की BrdU धुंधला: Z-ढेरedu (हरा) की confocal छवियों, BrdU धुंधला हो जाना (लाल) और डीएनए चमकदार नीली foci के रूप में chromocenters का पता लगाने की अनुमति DAPI (नीला) के साथ counterstained. Stainings विकिरण और BrdU 0 घंटा गड़बड़ी से पहले (स्केल पट्टी: 5 माइक्रोन) (केवल unirradiated नियंत्रण दिखाया गया है) edu 1.5 घंटा दिया गया था जहां प्रयोगों में 1 घंटा गड़बड़ी पर एकत्र एक भ्रूण के मस्तिष्क खंड पर प्रदर्शन किया गया. एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण.

नीचे पैनलों edu और राज्याभिषेक मस्तिष्क स्लाइसें में पता चला BrdU धुंधला के 5 विभिन्न पैटर्न के उदाहरण दिखाते हैं. छवि मिलाएं और एकल चैनल (स्केल पट्टी: 2 माइक्रोन) दिखाए जाते हैं:

ए) edu साथ न्यूक्लियस (+) chromocenters और edu (+) या edu (-) euchromatin. Edu इस प्रकार pericentric हेट्रोक्रोमैटिन की प्रतिकृति के दौरान देर चरण में शामिल किया गया है: कोशिकाओं मैं थे0 घंटे गड़बड़ी पर एन जी 2.

बी) edu साथ न्यूक्लियस (+) euchromatin और BrdU (+) chomocenters: euchromatin के सबसे दोहराया है जब edu जल्दी एस चरण में शामिल किया गया है और BrdU देर चरण में शामिल किया गया है: कक्षों 0 घंटा गड़बड़ी पर एस चरण में थे .

Edu के साथ सी) न्यूक्लियस (+) BrdU (+) euchromatin और edu (-) BrdU (-) chromocenters. Edu और BrdU एस चरण के पहले भाग में शामिल किया गया है: कक्षों 0 घंटा गड़बड़ी पर जल्दी एस चरण में थे.

BrdU के साथ डी) न्यूक्लियस (+) euchromatin और edu (-) BrdU (-) chromocenter. BrdU एस चरण की शुरुआत में शामिल किया गया है. कोशिकाओं 0 घंटा गड़बड़ी पर देर G1 में थे और उसके बाद एस चरण में प्रवेश किया.

Edu के साथ ई) न्यूक्लियस (-) BrdU (-) euchromatin और chromocenters. कोशिकाओं G0 (अपरिपक्व न्यूरॉन्स) में या G1 चरण में थे और edu और BrdU दालों के दौरान एस चरण में प्रवेश नहीं किया था.

समाधान ऊष्मायन तापमान दबाव आंदोलन
1 शराब 70% 30 मिनट 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
2 शराब 95% 15 मिनट 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
3 शराब 95% 30 मिनट 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
4 शराब 95% 45 मिनट 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
5 शराब 100% 15 मिनट 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
6 शराब 100% 30 मिनट 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
7 शराब 100% 1 घंटा 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
8 टोल्यूनि 100% 30 मिनट 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
9 टोल्यूनि 100% 45 मिनट 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
10 टोल्यूनि 100% 1 घंटा 35 डिग्री सेल्सियस पर पर
11 तेल 30 मिनट 58 डिग्री सेल्सियस पर पर
12 तेल 1 घंटा 58 डिग्री सेल्सियस पर पर
13 तेल 1 घंटा 58 डिग्री सेल्सियस पर पर
14 तेल 1.5 घंटा 58 डिग्री सेल्सियस पर पर

तालिकाआयल embedding के लिए 1. वैक्यूम घुसपैठ प्रोसेसर कार्यक्रम.

1 स्लाइड के लिए रिएक्शन घटकों
1X edu प्रतिक्रिया बफर 128.64 μl
CuSO 4 6 μl
Edu एलेक्सा Fluor azide 0.36 μl
1X edu प्रतिक्रिया बफर additive 15 μl
कुल मात्रा 150 μl

तालिका 2. Edu प्रतिक्रिया कॉकटेल.

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Discussion

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edu 1.5 घंटे का समावेश पर आधारित यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक डिजाइन से पहले विकिरण की अनुमति दी तुरंत बाद विकिरण और BrdU का समावेश NSPCs एक के बाद एस और G2 / एम चौकियों को सक्रिय करने में सक्षम है, लेकिन 1 घंटा दौरान G1 / एस जांच की चौकी नहीं कर रहे हैं कि प्रदर्शन भ्रूण माउस मस्तिष्क में genotoxic तनाव. हम हमें विशेष रूप से एस चरण प्रविष्टि की दर की सराहना करने के लिए अनुमति edu बस 1 घंटा चूहों बलिदान से पहले, विकिरण और BrdU के बाद अलग अलग समय पर इंजेक्शन दिया गया है जिसमें अन्य प्रयोगों का प्रदर्शन किया. इन प्रयोगों NSPC विवो 22,23 में एक genotoxic तनाव के बाद एक G1 / एस गिरफ्तारी सक्रिय नहीं करते हैं कि प्रदर्शन किया है.

इसलिए, डीएनए की मरम्मत और apoptosis के बीच चुनाव इन कोशिकाओं में जीनोम स्थिरता guarantying तंत्र की प्रकृति पर सवाल उठा G1 / एस चौकी पर नहीं होती है.

प्रोटोकॉल आसान और तेज है. अलगकदम कोई स्पष्ट कठिनाई उपस्थित थे. इस तकनीक को पार प्रतिक्रिया 32 को दिखाया गया है जो क्लोरो deoxyuridine का उपयोग (CldU) और iodo-deoxyuridine (आईडीयू) के लिए एक विकल्प है.

प्रोटोकॉल कई जैविक सवालों को आसानी से लचीला और अनुकूलनीय है के रूप में आवेदन की एक व्यापक पैनल, माना जा सकता है. परिवर्तन के उदाहरण Roque में प्रस्तावित और 23 सहयोगियों एटीन और सहयोगियों को 22, और रूसो और सहयोगियों को 24 में कर रहे हैं. यह भी कई सेल मार्कर या उदाहरण के लिए डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया में शामिल प्रोटीन के immunofluorescence का पता लगाने के साथ जोड़ा जा सकता है. इस मामले में, BrdU और edu पता लगाने के दोनों अन्य मार्करों की प्रतिरक्षा का पता लगाने के पक्ष में, commercialized रहे हैं कि विभिन्न fluorophores के साथ किया जा सकता है, ध्यान दें.

NSPC में विवो समावेश में edu और BrdU भी आगे जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए प्रवाह cytometry छँटाई सेल में इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, वेंविधि उत्परिवर्ती चूहों के विभिन्न प्रकारों में या (विकिरण के अलावा अन्य) genotoxic तनाव या सेल चक्र प्रगति को प्रभावित करने के लिए किसी भी अन्य उपचार के अन्य प्रकार के बाद NSPC की कोशिका चक्र प्रगति की निगरानी करने के लिए किया जा सकता है. इसके अलावा यह आसानी से अन्य नकल ऊतकों को रूपांतरित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

Sante-Environnement - इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान ELECTRICITE डी फ्रांस (EDF) से और ल Agence Nationale डे ला Recherche से, 323,267 अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) से धन प्राप्त n ° गया है एट SANTE-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EdU Life Technologies A10044 1 mg/ml
BrdU Life Technologies B5002 5 mg/ml
IBL 637 CIS BIO International
Tissu Tek VIP Leica
Microtome Leica RM 2125 RT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit Life Technologies C10083
Anti-BrdU GE Healthcare RPN202 1/300
Goat anti mouse-Alex594 Life Technologies A11001 1/400
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01
Polysine slide Thermo scientific J2800AMNZ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Life Technologies 20012-068
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Microscope BX51 Olympus
Confocal microscope SPE Leica
Prism software Graphpad Version 5.0c
Photoshop software Adobe

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References

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Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).More

Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).

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