Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황

doi: 10.3791/51209 Published: May 7, 2014

Summary

티미 딘의 두 개의 아날로그의 행정, 에듀와 BrdU의는 임신 한 생쥐의 배아 마우스의 뇌에있는 신경 및 전구 세포의 세포주기 진행의 분석을 할 수 있습니다. 이 방법은 두뇌 개발 중에 전리 방사선 등의 유전 독성 스트레스의 효과를 확인하는 데 유용합니다.

Abstract

대뇌 피질의 신경 세포는 배아 뇌의 좌우 심실을 안감 pseudostratified 상피 세포를 형성하는 신경 줄기 및 전구 세포의 다른 유형 (NSPC)에서 뇌를 개발하는 동안 생성됩니다. 같은 이온화 방사선으로 유전 독성 스트레스는 NSPC의 높은 감도와 관련된 뇌의 발달에 매우 해로운 영향이있다. 관련된 세포 및 분자 메커니즘의 해명은 손상된 조직에서 세포주기를 통해 NSPC 진행 상황을 확인하는 정확한 방법을 필요로 세포의 이러한 특정 유형의 DNA 손상 반응의 특성에 의존한다. 여기에 임신 한 쥐와 태아 뇌의 관상 섹션이 두 티미 딘 유사체의 추가 검출 에듀와 BrdU의 연속 복강 내 주사에 근거하는 방법을 보여줍니다. 에듀와 BrdU의 양쪽 S 단계에서 복제 세포의 DNA에 통합되어 두 개의 서로 다른 기술 (아 지드 또는에 의해 감지자신의 동시 검출을 용이하게 특정 항체, 각각). 에듀와 BrdU의 염색은 다음 지느러미 telencephalon의 표준 영역에서 심실 마진으로부터의 거리의 함수의 각 NSPC 핵에 대해 결정된다. 따라서이 이중 라벨 기술은 DNA 손상에 반응하여 세포주기 정지로 이어지는 세포주기 체크 포인트를 활성화 한 것과에서 세포주기의 진행을 통해 세포를 구별 할 수 있습니다.

실험의 예는 듀가 직후 조사 및 BrdU의 전에 주입 및 사출 다음 4 시간 이내에 실시하는 분석에서 제시된다. 이 프로토콜들이 조사되었다하는 세포주기의 위상의 함수 NSPC의 급성 DNA 손상 반응의 정확한 분석을 제공한다. 이 방법은 생체 조직의 세포주기 진행에 대한 특정 치료의 효과를 결정하기 위해 쉽게 transposable 많은 다른 시스템이다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

배아 두뇌 개발하는 동안 대뇌 피질의 투사 신경 세포는 신경 줄기 및 전구 세포 (NSPC)의 다른 유형으로 구성 pseudostratified 상피는 라인 측면 심실, 심실 영역에 생성됩니다. NSPC 중, 신경 줄기 세포의 역할을 방사 아교 세포 (RGC)가,, (INM) interkinetic 핵 마이그레이션을 받아야 : 그들은 심실 영역의 기저 한계에서 뇌실과 S 상의 표면에 유사 분열을 수행 (VZ) 1,2,3. 그들은 나눌 수 있습니다 대칭으로 두 RGC를 생성하거나 불균형 한 RGC 하나의 신경 세포 또는 중간 전구 세포 (IPC) 4, 5를 생성합니다. IPC는 마지막으로 대칭 분할 후 그들은 두 개의 미성숙 투사 뉴런 6-8을 생성 subventricular 영역라는 상부의 확산 층 (SVZ)로 이동한다. RGC는 달리, IPC (9 검토) INM를 받아야하지 않습니다. 새로 생성 된 신경 세포는 백분율대뇌 피질의 플레이트 (CP) 10, 8 최종 목적지에 도달하기 위해 중간 영역 (IZ)를 통해 방사 섬유를 따라 방사형으로 먹었다. 모든 이벤트의 완벽한 타이밍은 정확한 대뇌 피질의 발달에 필수적이다. 예를 들어 신경 전구 인구의 분화 증식에서 스위치는 G1 단계 지속 기간 (11), (12)에 의해 제어된다. G1 단계의 연장은 세포 분화에 따라서 상관 관계.

(13에서 검토) 이온화 방사선, 심각하게 손상 뇌의 발달로 유전자 독성 스트레스. 우리와 다른 NSPC 방사선에 의한 세포 사멸 14, 15, 16에 대한 높은 경향이있는 것으로 나타났습니다. 전리 방사선은 세포 증식에​​ 가장 심각하게 손상되어 DNA 이중 가닥의 휴식을 유도한다. 자전거 세포의 DNA 손상 반응 (DDR)의 하나의 필수 구성 요소는 G1 / S 또는 G2 / M 전환이나 S시 세포주기 체크 포인트의 활성화입니다상 (내 S 체크 포인트) 17-21. 이들은 DNA 손상 보수 또는 너무 손상 세포의 제거를위한 시간을 제공하는 세포주기 진행을 차단. 따라서, 세포 사멸뿐만 아니라 지연 세포주기 진행은 방사선 노출 22-24 이온화에 응답 뇌 발달을 변경할 수있다. 이것은 조사 된 마우스 태아 뇌 NSPC에서 세포주기 체크 포인트의 활성화를 평가하는 방법을 개발하는 것이 흥미 있었다.

세포주기의 진행을 일상적 티미 딘 유사체, 5 - 브로 모-2'-데 옥시 우리 딘 (BrdU의)의 혼입을 사용하여 이어진다. BrdU의은 DNA가 복제되어 세포주기의 S 단계에서 통합된다. BrdU의에 대한 항체의 사용은 BrdU의 펄스 동안의 S 단계에서 세포의되었습니다 이후 검출을 허용한다.

신규 티미 딘 유사체, 5 -에 티닐-2'-데 옥시 우리 딘 (EDU)는 형광 지드에 의해 검출된다. 듀와 B를 검출하는 다른 방법 RDU는 세포주기 진행의 연구에 유용 모두 티미 딘 아날로그의 동시 검출을 가능하게 25을 교차 반응하지 않는다. 보통 세포는 처음 EDU와 펄스와 다음 모두 포함 과정 사이의 시간이 시간 (25, 26)의 커플을 지속 BrdU의와 펄스된다. 에듀을 포함하는 배지에서 BrdU의 첨가 EDU의 배제와 DNA에 BrdU의의를 우선적으로 편입 결과, 동안 만 BrdU의 내장 27 미디어 결과에 몰 또는 반 몰의 BrdU와 EDU (25)의 동시뿐만 아니라. 이것은 일반적으로 이전의 두 번째 레이블의 첨가 배양 배지에서 첫 번째 레이블을 제거하는 데 필요한 세척 단계를 제거하여 이중 라벨 프로토콜을 단순화합니다. 이것은 또한 S 상 항목 또는 세포 인구의 출구의 정확한 타이밍을 결정하는 세척 단계는 할 수 없습니다 생체 내 연구에 대한 특별한 관심입니다.

t "> 최근, 에듀와 BrdU의 23, 24 및 22을 사용하여 배아 마우스 뇌의 듀얼 펄스 표시하는 방법은 자궁 조사에 후 세포주기의 진행과 NSPC의 INM을 분석하기 위해 개발되었습니다. 또한이 입증되었습니다 동안, 그 S 단계는, 마우스 세포는 먼저 euchromatin 영역 다음 근심 이질 염색질 28,29,30를 복제합니다. 흥미롭게도, interphasic 핵으로 클러스터 된 다른 염색체의 근심 이질 염색질도 chromocenters로 알려진 밝은 초점으로 DAPI 염색에 의해 쉽게 감지 염색질 초점을 형성한다. 따라서, euchromatin과 chromocenters의 차이 에듀와 BrdU의 염색에보다 정확하게 NSPC의 S 단계의 진행을 분석하는 것을 도왔다.

이 메서드는이 체크 포인트는 게놈의 안정성을 위해 중요한 것으로되어 있기 때문에 매우 놀라운 일이다 NSCP 22-24에서 G1 / S 체크 포인트의 명백한 부족의 데모를 허용했다. 여러 특급듀 및 BrdU의 펄스의 다양한 조합에 기초 erimental 디자인은 복부와 등쪽 telencephalon에서 세포주기의 진행을 분석하기 위해 사용되어왔다. 여기, 우리는 E14.5 마우스 배아의 자궁 조사에서 다음과 같은 제 4 시간 내 NSPC의 급성 DNA 손상의 연구를 허용하는 프로토콜의 예를 제공합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 동물 절차

이 프로토콜은 11 월 24 일의 유럽 공동체위원회 지침, 1986 (86/609/EEC)에 따른 설계되어 동물 복지 (CETEA-CEA DSV IDF)에 대한 우리의 기관위원회에 의해 승인되었습니다.

  1. 에듀 / BrdU의 및 E14.5 임신 한 생쥐의 조사 (그림 2A)로 주입.
    1. PBS에서 5 ㎎ / ㎖에서 ML과 BrdU의 1 ㎎ /에 EDU의 솔루션을 준비합니다. 임신 한 생쥐에 25 G 바늘을 사용하여 에듀 용액 100 μL의 복강 내 주사 (IP)을 수행합니다. 1.5 시간 후, 0 Gy를 2 Gy의 (0.6 Gy를 / 분)에서 마우스 (전신 방사선 조사)를 조사. 직후, 임신 한 생쥐에 25 G 바늘을 사용하여 BrdU의 솔루션 (IP) 200 μl를 주입.
  2. 배아 뇌의 관상 조각의 준비.
    1. 조사 후 1 시간 또는 4 시간에서 이산화탄소에 의해 임신 한 쥐를 안락사.
    2. 복부 CAVI를 엽니 다가위를 사용 삼cm에 타이. 뿔의 양극을 구획하여 자궁의 나머지 부분에서 두 개의 자궁 뿔을 분리합니다. PBS 0.6 %의 포도당이 포함 된 배양 접시에 자궁 뿔을 전송합니다. 배아를 분리하기 위해 집게로 자궁 뿔을 엽니 다. 집게를 사용하여 각 태아의 양막을 제거합니다.
    3. 집게와 배아의 머리를 해부하고 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 산도 = 7.4) O / N에 침지하여이를 수정
    4. 4 ℃에서 적어도 하룻밤 PBS에서 배아의 머리를 씻어 헤드는 며칠 동안 PBS에 보관 될 수있다.
    5. 표 1에 나타낸 바와 같이 진공 침윤 프로세서를 사용하여 파라핀에 포함 헤드. 매립 헤즈 또한 에탄올과 xylen 욕탕 화학 후드 하에서 수행 한 후 파라핀 욕탕 65 ° C의 오븐에서 할 수있다.
    6. 마이크로톰으로 5 μm의 두께 코로나 섹션을 준비합니다.
    7. 폴리 라이신 코팅 현미경 슬라이드에 장착합니다. </ 리>
    8. 슬라이드 수개월 동안 실온 (RT)에서 유지 될 수있다.

2. 에듀 / BrdU의 얼룩

  1. 탈 파라핀과 항원 마스크 해제
    1. 5 분 동안 톨루엔 3 화장실에 슬라이드 침지하여 파라핀 뇌 부분을 Deparaffinize.
    2. 에탄올 100 %, 에탄올 95 %, 에탄올 70 %, 5 분 H 2 O에서 : 다음과 같은 에탄올의 농도가 감소하는 각 솔루션의 2 화장실에서 3 분 동안 재수 슬라이드는 몇 시간 동안 탈 이온수에 보관하실 수 있습니다.
    3. 구연산 용액 (10 mM의, 산도 6)에서 10 분 동안 조각을 삶아 한 다음 5 분 동안 탈 이온수에 품어.
  2. 에듀 염색
    1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 에듀 감지를 수행합니다. 10 분간 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100 세포를 투과.
    2. 탈 이온수의 10 배 솔루션을 희석하여 1X 에듀 버퍼 첨가제를 준비합니다. 이 솔루션은 갓과 같은 다 사용해야합니다예.
    3. 에듀 알렉사 플 루어 488 아 지드를 포함, 에듀 반응 칵테일을 준비합니다. 이것은, 그렇지 않으면 반응이 최적으로 진행되지 않으며, 표 2에 나열된 순서로 다음의 성분을 추가하는 것이 중요하다. 준비 15 분 이내에 에듀 반응 칵테일을 사용합니다.
    4. permeabilization 버퍼 (단계 2.1.1)를 제거하고 PBS로 두 번 세척한다.
    5. 에듀 반응 칵테일의 150 μl를 추가, 커버 슬립을 넣어 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 배양한다.
    6. 에듀 반응 칵테일을 제거한 다음 PBS로 한번 세척한다.
  3. BrdU의 염색
    1. 7.5 % 염소 혈청과 PBS에 7.5 % 소 태아 혈청 포화 버퍼를 준비합니다. , 뇌 조각에 포화 버퍼 150 μl를 추가 coverslip에 넣어 구속력이 특정 항체를 차단하기 위해 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
    2. 커버 슬립을 제거합니다. 포화 버퍼 1 /는 300 희석 마우스 방지 BrdU의 차 항체 150 μl를 추가, / 커버 슬립을 넣고 O를 품다4 ℃에서 N
    3. 커버 슬립을 제거한 다음 PBS로 3 회 세척한다.
    4. 포화 버퍼에 1 / 400으로 희석 한 염소 항 - 마우스 Alexa594 차 항체 150 μl를 추가, 커버 슬립을 넣어 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
    5. 커버 슬립을 제거한 다음 PBS에 한 번 씻는다.
    6. 핵 염색 : 4의 150 μL 'PBS에 1 ㎍ / ml로 -1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)를 추가, 커버 슬립을 넣고 실온에서 2 분 동안 품어.
    7. 매체를 장착에 슬라이드를 장착합니다.

3. 분석

  1. 20X 목적 또는 공 초점 현미경과 형광 현미경으로 뇌의 부분을 검사하고 파일을 분리 등 세 개의 채널 (488 nm의, 594 nm의 UV)에서 이미지를 수집.
  2. 포토샵 소프트웨어를 사용하여 이미지를 스택.
  3. dorsomedial 대뇌 벽의 표준 분야에서 뇌 부분을 분석합니다. 이 분야는 중간 자적 차원에서 100 μM과 10 μ의 18 쓰레기통 (또는 그 이상)으로 나누어 져 있습니다로 이미지를 중첩 그리드 (그림 1)를 사용하여 반경 차원에서 m 높이 이전에 31을 설명했다.
    1. 상기 제 1 빈으로 그리드 정렬은 심실 국경의 긴 축과 평행, 심실 표면에 있습니다. 그런 다음 각 bin에 표시된 에듀, BrdU의 및 / 또는 pyknotic 핵 (세포 사멸 핵에 대응)의 번호. 핵이 두 개의 쓰레기통에서 동일한 영역을 점유 할 때 그것의 큰 부분, 또는 하단 용지함에를 포함 함 두 쓰레기통의 경계에 위치한 핵을 수.
  4. 통계 분석.

배아 당 최소 두 개의 대뇌 피질의 조각을 분석합니다. 다른 새끼에서 최소 3 배아에 대한 실험을 반복합니다. 결과는 평균 (SEM)의 평균 ± 표준 오차로 제공해야한다. 통계 분석은 양방향 ANOVA와 Bonferroni 다중 비교 posthoc 테스트를 사용을 Graphpad 프리즘으로 실시하고 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

도 2에 설명 된 실험에서, EDU 단지 조사 후의 조사 및 BrdU의 1.5 시간 전에 투여 하였다. 세포의 네 가지 유형은 다음 에듀 또는 BrdU의 모두 또는 없음 중 하나의 결합에 따라 1 또는 4 시간의 사후 조사에서 준비 대뇌 피질의 조각 구별되었다 (그림 2A와 2B). 중요한 사실은, 듀 이용 BrdU의 내장 둘다 방사선 유도 아폽토시스 (데이터 미도시)의 레벨을 변화. 또한, 염색 방법은 EDU 및 BrdU의 만 검출이 S 상에있는 DNA 복제시 포함하지만도 조사 후 수리와 관련된 DNA 합성을 검출하는 감도가없는 수 있습니다. 사실, 나는) 에듀도 BrdU의 염색도는 G0 단계에서 postmitotic 뉴런 있으며 II) 에듀 (+) 및 / 또는 BrdU의 (의 수 +있는 대뇌 피질 판의 세포에서 1 시간 후 조사 (PI)에서 관찰되었다 ) unirr에 비해 조사에서 증가하지 않았다두뇌를 adiated.

EDU (+) BrdU의 (+) 핵

EDU (+) BrdU의 (+) 핵 0 시간의 PI 전후 S 단계에 있었다 NSPC에 해당합니다. 이들은 이와 S 단계에서 조사 하였다. 도 3B3C에 나타낸 바와 같이 자신의 euchromatin은 EDU (+)이며, 또한 BrdU의 (+) 일 수있다. (-). 그들의 chromocenters는 BrdU의 (+) 또는 BrdU의 하나가되었습니다 (1 시간 PI에서, EDU (+) BrdU의 (+) 핵이 S 상 쓰레기통에 지역화 된 것을 그림 2B 보여줍니다 희생의 시간에 S 상 완료에 따라 즉, 이들의 분포와 숫자가 조사에 의해 영향을받지 않았다 빈들 NSPC가 S 상 (31)을 수행하는 것으로 알려져있다 (10), 4.. 이는 방사선이 시간에 DNA 합성의 완전한 차단을 유발하지 않았다는 것을 시사한다.

지속적으로 G2 단계에서 정점 핵 이주 기초로, NSPC 대부분의 EDU (+) BrdU의 (+) 핵은 미 조사 꼰 로프에 4 시간의 PI에서 심실 근처에서 발견되었다NS (그림 2C). 이 2 Gy의이 핵 S 상 쓰레기통에 남아있는 두뇌, 그들 중 많은 사람들이 사멸되는을 조사 발생하지 않았다. 모두이 데이터는 NSPC는 S 단계에서 조사 지연 INM 및 세포의 죽음과 관련하여 내부 S 체크 포인트를 활성화 것을 보여 주었다.

EDU (+) BrdU의 (-) 핵

EDU (+) BrdU의 (-) 핵 이전이 아니라 조사 후 S 단계에 있던 세포에 해당합니다. 이러한 핵의 Chromocenters이 EDU는 (그림 3A) 쥐에 주입했을 때 세포가 늦은 S 상에 있던 것을 나타내는, EDU (+)입니다. NSPC의 G2 / M 단계 이후 지난 2는 개발 마우스의 뇌에있는 시간, EDU (+) BrdU의 (-) NSPC는 0 시간의 PI에서 G2에 있었다. 지속적으로, 대부분의 EDU (+) BrdU의 (-)를 핵은 1 시간 PI에서 미 조사 뇌의 뇌실 주변의 첫 번째 빈에서 발견되었다. 이것은 그들 중 많은 사람들이 일반적으로 유사 분열 (그림 2B)을 형성 S 상, 후, NSPC의 INM의 결과입니다. 에1 시간 PI는 EDU의 수 (+) BrdU의 (-) 핵은 크게 심실 표면에서 환원 더 유사 분열 그림은 조사 두뇌에서 검출되었다 없었다. 이러한 데이터는 명확하게 G2에 조사 세포는 1 시간 PI에서 G2 / M의 검사 점을 활성화 것을 보여줍니다. 또한, 에듀 대부분의 (+) BrdU의 (-)이 핵은 NSPC은 G2 (그림 2C) 동안 높은 방사선에 있다는 것을 보여주는 4 시간의 PI에서 세포 사멸했다.

EDU (-) BrdU의 (-) 핵

(-) 에듀와 세포 BrdU의 (-)를 핵 G0 (주로 미성숙 신경 세포)에있는 세포 또는 동물의 희생 (그림 3E)에 듀 법인에서 G1에 남아 NSPC 중 하나에 해당합니다. 그림 (c)에 1 시간과 4 시간의 비교는 S 단계에 있던 핵 ventric으로 갔다 반면 interkinetic 핵 마이그레이션, 1 시간에 G1에서 심실에 가까웠다 핵이 4 시간에 기초 마이그레이션에 자신의 혀끝을받은 것을 만드는 보여줍니다신경근면.

도 2c에 도시 된 바와 같이 이러한 핵의 대부분은 4 시간의 PI에서 사멸되었습니다. 사멸 듀의 수는 (-) BrdU의 (-) 핵은 심실 표면 부근에 최대 였고 상부 빈들에서 감소한다. 이러한 데이터는 따라서 방사선에 의한 세포 사멸이 초기 G1 단계 및 / 또는 사후 유사 분열 신경을 마이그레이션하는 동안 조사 된 그 NSPC에서 발생하는 것이 좋습니다. 대조적으로, 아무도 또는 거의 사멸 핵은 대뇌 피질의 플레이트에서 찾을 수 없습니다. 이것은 그들의 최종 목적지에 도달 한 뉴런의 방사 저항에 따른다.

EDU (-) BrdU의 (+) 핵

EDU (-) BrdU의 (+) 핵은 조사 후 S의 위상을 입력 셀에 해당합니다. 일반적으로 1 시간 PI에서, 그들은 있지만 chromocenters의, euchromatin의 확산 BrdU의 라벨을 보여 주었다. 따라서 그들은 그 시간 (그림 3D)에 이른 S 단계에 있었다. 1 시간 PI에서 S의 PHA를 내 수 및 현지화에듀의 전자 쓰레기통 (-) BrdU의 (+) 핵 통제 및 조사 두뇌 사이의 유사하다. 따라서 1 차 인사 PI 동안 S 상 항목은 마우스 두뇌 개발 (그림 2B)의 방사선에 의해 영향을받지 않았다. (-) BrdU의 (+) 핵 이러한 핵의 대부분은 4 시간의 PI에서 세포 사멸했다 흥미로운 조사 두뇌에 1 시간과 4 시간의 PI의 비교는 EDU의 수의 감소를 보여줍니다. 이 조사 후 S 단계에 진입 ​​세포 내 S의 체크 포인트를 활성화하고 (그림 2C) 후 세포 사멸을 시행하는 것이 좋습니다.

그림 1
그림 1. DAPI. 에듀와 BrdU의 얼룩뿐만 아니라 핵의 형태가 dorsomedial 대뇌의 표준 분야에서 분석 물들 E14.5 마우스 배아의 대뇌 반구의 뇌 부분 코로나 섹션의 분석텍스트에 설명 된대로 18 쓰레기통 (또는 그 이상)으로 나누어 격자를 사용하여 L 벽. 스케일 바 :. 20 μm의는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
조사 된 신경 줄기 및 전구 세포의 그림 2. 세포주기의 진행 (로케 등의 그림., 셀, 2012 년 줄기). 실험 설계 및 DAPI (파란색)의 (A) 회로도, EDU (녹색), 및 BrdU의 (적색) 1과 4 시간의 PI (2 Gy의)에서 관상 대뇌 피질의 조각에서 발견 염색 패턴. . 스케일 바 = 20 μm의 (B, C) ​​EDU의 수 / 빈 (+) BrdU의 (-), 에두 (+) BrdU의 (+), 에두 (-) BrdU의 (+), 또는 EDU (-) BrdU의 (- 일반 개월)와 핵nonirradiated 컨트롤 (파란색)과 일반 (빨강) 또는 세포 사멸 조사에서 (pyknotic, 블랙) 형태 (2 Gy의)와 rphology 1 시간 (B) 또는 4 시간의 PI (C)에서 피질. 어떤 세포 사멸 핵은 1 시간 PI (B)에서 검출되지 않았다. 통계 학적 분석은 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 실시 하였다. 약어 : BrdU의 5 - 브로 모-2'-데 옥시 우리 딘; DAPI, 4'-6-diamidino-2-페닐 인돌; 에듀, 5 -에 티닐 - 2'deoxyuridine; IZ, 중간 영역; SVZ, subventricular 영역; VZ, 심실 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
. 그림 3 차동 에듀과 euchromatin과 chromocenters 상단 패널의 BrdU의 얼룩 : Z-스택EDU (녹색)의 공 촛점 이미지는 BrdU의 염색 (빨강) 및 DNA는 밝은 파란색 초점으로 chromocenters의 검출을 허용 DAPI (파란색)과 대조. 염색에가 조사 및 BrdU의 0 시간의 PI 전에 (스케일 바 : 5 μm의) (만의 미 조사 컨트롤이 표시됩니다) EDU는 1.5 시간을 제공 한 실험에서 1 시간 PI에서 수집 된 배아 뇌 부분에서 수행되었다. 를 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전.

하단 패널은 에두와 코로나 뇌 조각에서 검출 BrdU의 염색의 5 가지 패턴의 예를 보여줍니다. 이미지를 병합하고 단일 채널 (스케일 바 : 2 μm의) 표시됩니다 :

A) 에듀와 핵 (+) chromocenters 및 에듀 (+) 또는 EDU (-) euchromatin. 에듀 따라서 근심 이질 염색질의 복제 중 후반 S 단계에 통합되었습니다 : 세포는 내가했다0 시간의 PI에서 N의 G2.

B) 에듀와 핵 (+) euchromatin과 BrdU의 (+) chomocenters : euchromatin의 대부분이 복제 될 때 EDU 초기 S 단계에 통합되어 BrdU의 늦은 S 단계에 통합되었습니다 : 세포는 0 시간의 PI에서 S 단계에 있었다 .

에듀와 함께 C) 핵 (+) BrdU의 (+) euchromatin과 에듀 (-) BrdU의 (-) chromocenters. 듀 및 BrdU의는 S 단계의 첫 번째 부분에 포함되었다 : 세포 공 인사 PI 이른 S 상에 있었다.

BrdU의와 D) 핵 (+) euchromatin과 에듀 (-) BrdU의 (-) chromocenter. BrdU의 S는 단계의 시작 부분에 포함되었다. 세포는 0 시간의 PI 늦은 G1에 있던 그 후 S 단계에 들어갔다.

에듀와 E) 핵 (-) BrdU의 (-) euchromatin과 chromocenters. 세포는 G0 (미성숙 신경 세포) 또는 G1 단계에 있었고, 에듀와 BrdU의 펄스 동안 S 단계를 입력하지 않았습니다.

해결 잠복 온도 압박 동요
1 알코올 70 % 30 분 35 ° C
2 알코올 95 % 15 분 35 ° C
3 알코올 95 % 30 분 35 ° C
4 알코올 95 % 45 분 35 ° C
5 알콜 100 % 15 분 35 ° C
6 알콜 100 % 30 분 35 ° C
7 알콜 100 % 1 시간 35 ° C
8 톨루엔 100 % 30 분 35 ° C
9 톨루엔 100 % 45 분 35 ° C
10 톨루엔 100 % 1 시간 35 ° C
11 파라핀 30 분 58 ° C
12 파라핀 1 시간 58 ° C
13 파라핀 1 시간 58 ° C
14 파라핀 1.5 시간 58 ° C

테이블파라핀 임베딩 1. 진공 침투 프로세서 프로그램입니다.

1 슬라이드에 대한 반응의 구성 요소
1X 에듀 반응 버퍼 128.64 μL
CuSO 4 6 μL
에듀 알렉사 형석 아 지드 0.36 μL
1X 에듀 반응 버퍼 첨가제 15 μL
총 양 150 μL

표 2. 에듀 반응 칵테일.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

에듀 1.5 시간의 정관에 따라 여기에 설명 된 실험 설계하기 전에 조사가 허용 된 후 즉시 조사 및 BrdU의 정관 NSPCs이 후 S 및 G2 / M의 체크 포인트를 활성화 할 수 있지만, 1 차 시간 동안 G1 / S 체크 포인트 수 없습니다 시위 태아 쥐의 뇌에서 유전자 독성 스트레스. 우리는 우리가 구체적으로 S 상 항목의 비율을 감상 할 수 있도록, 에듀 단지 1 시간 마우스를 희생하기 전에, 조사 및 BrdU의 후 다른 시간에 주입 된 다른 실험을 수행 하였다. 이러한 실험 NSPC 생체 (22, 23)의 유전자 독성 스트레스 후 G1 / S의 체포를 활성화하지 않는 것이 증명하고있다.

따라서, DNA 수리 및 세포 사멸 사이의 선택이 세포에 유전체의 안정성을 guarantying 메커니즘의 특성에 문제를 제기 G1 / S 체크 포인트에서 발생하지 않습니다.

이 프로토콜은 쉽고 빠르게합니다. 다른단계는 명백한 어려움을 제시하지 않습니다. 이 기술은 상호 반응 (32)에 표시되었습니다 클로로-데 옥시 우리 딘의 사용 (CldU) 및 요오 데 옥시 우리 딘 (IDU)에 대한 대안입니다.

프로토콜은 여러 가지 생물학적 질문에 쉽게 유연하고 적응력이 같은 애플리케이션의 광범위한 패널은 고려 될 수있다. 변화의 예는 로케 제안 및 23 공동 작업자, 에티엔 느와 공동 22 루소와 공동 24에 있습니다. 또한 몇몇 세포 마커 또는 인스턴스의 DNA 손상 반응에 관여하는 단백질의 면역 형광 검출과 조합 될 수있다. 이 경우, BrdU의 및 에듀 감지가 모두 다른 마커의 면역 검출을 선호하는, 상용화 다른 형광으로 수행 될 수 있음을 유의하십시오.

NSPC 생체 설립에 에듀와 BrdU의도에 의해 더 생화학 분석 유동 세포 계측법 정렬 셀에 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 일방법은 돌연변이 생쥐의 다른 유형 또는 (전리 방사선 이외) 유전자 독성 스트레스 또는 세포주기 진행에 영향을 미치는 다른 치료의 다른 유형 후에 NSPC의 세포주기의 진행을 모니터하기 위해 수행 될 수있다. 또한 그것은 쉽게 다른 복제 조직에 적용 할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 이익에 대한 갈등이 없습니다.

Acknowledgments

상테 - 환경 회사 - 이러한 결과로 이어지는 연구는 프랑스 전력 (EDF)에서 그리고 난 직원은 국립 드 라 공들인보기에서, 323,267을 부여 계약에 따라 유럽 연합의 제 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)로부터 자금을받은 N °있다 등 상테 - 진통 (ANR-SEST, Neurorad).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EdU Life Technologies A10044 1 mg/ml
BrdU Life Technologies B5002 5 mg/ml
IBL 637 CIS BIO International
Tissu Tek VIP Leica
Microtome Leica RM 2125 RT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit Life Technologies C10083
Anti-BrdU GE Healthcare RPN202 1/300
Goat anti mouse-Alex594 Life Technologies A11001 1/400
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01
Polysine slide Thermo scientific J2800AMNZ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Life Technologies 20012-068
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Microscope BX51 Olympus
Confocal microscope SPE Leica
Prism software Graphpad Version 5.0c
Photoshop software Adobe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
  2. Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. 377-399 (1935).
  3. Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
  4. Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
  5. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
  6. Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
  7. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
  8. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
  9. Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
  10. Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
  11. Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
  12. Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
  13. Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
  14. Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
  15. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
  16. Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
  17. Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
  18. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
  19. Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
  20. Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
  21. Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
  22. Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
  23. Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
  24. Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
  25. Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. (2011).
  26. Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
  27. Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
  28. Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
  29. Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
  30. Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
  31. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  32. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (2010).
유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).More

Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter