Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

En cGMP-gældende Expansion Metode til aggregater af humane neurale Stem og stamceller arvet fra pluripotente stamceller eller fostrets hjerne Tissue

doi: 10.3791/51219 Published: June 15, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokol beskriver en ny mekanisk sønderdeling, der tillader udvidelse af sfæriske neurale stamceller og stamcelle aggregater uden dissociation til en enkelt cellesuspension. Fastholdelse af celle / celle kontakt giver mulighed for hurtig og stabil vækst i over 40 passager.

Abstract

En celle ekspansion teknik til at samle et stort antal celler fra et enkelt eksemplar til forskningsprojekter eksperimenter og kliniske forsøg vil være til stor gavn stamceller samfund. Mange nuværende ekspansion metoder er besværlige og dyre, og dem, der involverer komplet dissociation kan forårsage flere stamceller og stamceller typer til at gennemgå differentiering eller tidlig ældning. For at overvinde disse problemer har vi udviklet en automatiseret mekanisk passage benævnt "hakke", der er enkel og billig metode. Denne teknik undgår kemisk eller enzymatisk dissociation i enkelte celler og i stedet giver mulighed for storstilet udvidelse af suspenderet, sfæroidpartikler kulturer, der opretholder konstant celle / celle kontakt. Snittemetoden er primært blevet anvendt til fostrets hjerne-afledte neurale stamceller eller neurosfærer, og er for nylig blevet udgivet til brug med neurale stamceller fra embryoner og induceret pluripotente stamceller. Proceduren beliges seeding neurosfærer på en vævskultur petriskål og efterfølgende passerer en skarp, steril kniv gennem cellerne effektivt automatisere kedelige processen med manuelt mekanisk adskille hver sfære. Suspension af celler i kultur giver et gunstigt overfladeareal-til-volumen-forhold; som over 500.000 celler kan dyrkes i en enkelt neurosfære på mindre end 0,5 mm i diameter. I en T175 kolbe, kan over 50 millioner celler vokser i suspensionskulturer i forhold til kun 15 millioner i vedhængende kulturer. Vigtigere er det, snitning procedure blevet brugt i henhold til gældende god fremstillingspraksis (cGMP), tillader masse mængde produktion af klinisk-grade celle produkter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Der er en lang tradition for at udvide gnaver neurale stamceller i kultur som enten et monolag 1-3 eller aggregerede neurosfærer 4-7. Desuden har humane neurale stamceller (hNPCs) isoleret fra forskellige regioner i udviklingslandene centralnervesystemet 8-17 blevet udvidet in vitro. Disse celler er bi-potent, stand til at differentiere sig til både astrocytter og neuroner og har været et meget nyttigt værktøj i at studere neurale udvikling 18,19 og sygdom mekanisme 20,21. hNPCs er også blevet transplanteret ind i mange forskellige dyremodeller for sygdom i centralnervesystemet med varierende niveauer af integration, overlevelse og funktionelle virkninger 22-24.

Traditionelt er gnaver eller humane føtale afledt NPC udsættes for vækstfaktorer - ofte epidermal vækstfaktor (EGF) og / eller fibroblastvækstfaktor-2 (FGF-2) 25-28 - og både vedhæftende 29 og tre-Dimensionelle kugleformede systemer er typisk passage ved hjælp af enzymatisk dissociation i en enkelt-cellesuspension 30-34. Standarden metode til at udvide celler til forskning eller klinisk anvendelse er som tilhænger monolag på grund af let manipulation. Men vi har vist, at passage monolags og neurosfæreceller hNPCs med enzymatiske eller kemiske opløsninger resulterede i tidlig ældning 35.. Desuden kan enzymatisk dissociation resultere i forhøjede niveauer af differentiering og karyotypic abnormiteter baseret på data demonstreret med embryonale stamceller 36-38. Selv om standarden metode passaging hNPCs har produceret god fremstillingspraksis (cGMP) grade produkter, der er gået ind i fase 1 kliniske forsøg (Stamceller Inc., Neuralstem Inc.), den metode kun tilladt et par runder celleamplifikation, hvilket begrænser bank potentiale.

Det er klart, kan store forskningscentre eksperimenter og fremtidige kliniske forsøg drage fordel af muligheden for atudbrede celler i bulk og med forsinket senescens at tillade storstilet vækst og celle bankvirksomhed. For at imødekomme dette behov, har vi udviklet en ny og automatiseret måde mekanisk passaging intakte neurosfærer med "hakke" dem ind i små klynger for at opretholde celle-til-celle kontakt. Denne fremgangsmåde i høj grad øget deres levetid 39 og suspensionskultur tillader en mere effektiv udnyttelse af inkubator plads i forhold til monolag kulturer, som det ses med et alternativt 3D bioreaktor dyrkningsmetode 40. Den angivne hakke-protokollen giver mulighed for produktion af store banker fra en føtal prøve større end passage 10, en usandsynlig bedrift ved hjælp af standard passaging metoder. Selv om denne fremgangsmåde for passage hNPCs er utraditionel, det er stigende i popularitet, og blev for nylig offentliggjort med andre celletyper, såsom neurale stamceller fra humane embryonale og inducerede pluripotente stamceller, der gør det muligt i stor skala udvidelse til forskellige applikationer herunder vitro sygdom modellering 41-46. Vigtigere er det, har en cGMP-grade hNPC celle banken allerede er produceret med Snittemetoden, viser, at teknikken kan anvendes over for fremtidige kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Etisk erklæring og sikkerhed

  1. Denne fremgangsmåde involverer brugen af ​​cellekultur produkter fra mennesker eller dyr. Alle afledte væv skal godkendes før brug af den relevante Institutional Review Board (r) og / eller Institutional Animal Care og brug Udvalg (r).
  2. Skal bortskaffes i henhold til sikkerhedsreglerne den pågældende institution besluttet på All bio-farligt affald. Kende og følge alle de rammende sikkerhed og bortskaffelse retningslinjer i hele denne procedure.

2.. Forberedelse af udstyr, forsyninger, reagenser og Observationer

  1. Forberedelse
    1. Anskaf et glas petriskål, 8,5 cm filter papir cirkler og dobbelt-edge prep knive.
    2. Anbring et stykke filterpapir i petriskålen og overføre flere unsheathed vinger på filterpapir i petriskålen.
    3. Gentagne gange lag filterpapir og knive indtil petriskålen er omkring 75% fuld, dække with petriskål låg og autoklave. Opbevares i et sterilt eller lukket miljø for at bevare sterilitet.
    4. Autoklave 18 cm pincet og en autoklaverbart møtrik-chauffør i en sterilisering pose. Til cGMP produktion autoklaveres flere rustfrit stål shim diske i sterilisering poser. For mere information om shim skive, se trin 3.5.
    5. Desinficere biosikkerhed kabinet (BSC) med 70% isopropylalkohol (IPA).
    6. Alle procedurer skal udføres i et BSC at opretholde sterilitet. Overfør aseptisk følgende i BSC:
      1. McIlwain vævshakker (chopper). Tør alle overflader med 70% IPA, især chopper arm (Figur 1B). Hele chopper kan dekontamineres med ethylenoxid, hvis nødvendigt.
      2. Et autoklaveret møtrik-driver eller møtrik-nøgle (inkluderet med helikopteren, figur 1I), én 18 cm pincet, et sæt af standard størrelse mikropipetter (20 gl-1, 000 ul), en pipetaid og rør stativer.
      3. Sterile engangs serologiske pipetter, barriere pipettespidser, 15 ml koniske rør, 60 mm petriskåle, dobbelt-edge prep knive og passende størrelse T-kolber. ADVARSEL: håndtere kun de skarpe knive med en pincet.
  2. Reagenser
    1. Udvid hNPCs i Maintenance Media (MM) bestående af neural stamcelle Expansion Medium, EGF på 100 ng / ml og leukæmihæmmende Factor (LIF) på 10 ng / ml. Overfør reagenser og filtrering enhed (er), der er nødvendige for at forberede medier i BSC.
    2. Re-suspendere det frysetørrede EGF hjælp neural stamcelle Expansion Medium og forberede portioner ved 100 mg / ml til at gemme ved -80 ° C i op til 1 år. LIF er gemt som købes ved 4 ° C i op til 6 måneder eller udløbsdatoen givet af producenten.
    3. Overfør MM reagenser i BSC. Kombiner alle reagenser i en passende størrelse filtrering enhed og filter ved hjælp af et vakuumapparat. Opbevares ved 4 ° C i op til 3 uger.
    4. hNPC Observationer
      1. De to vigtigste faktorer til at løse før snitning, er kugle diameter og medier condition eller farve. Konditionerede medier (CM) er defineret som medium, der er blevet metaboliseret af hNPCs i kultur under inkubator betingelser (37 ° C, 5% CO 2, 95% luftfugtighed). Da cellerne metabolisere medierne phenol rød komponent vil skifte fra en lyserød til gul farve signalerer et mere surt miljø (figur 5D).
      2. Hold kolbe (r) hNPCs op mod lyset for at løse medierne farve (se diskussionen for detaljer).
      3. Scan gennem kolben med et mikroskop for at observere cellerne. Brug en reticle at undersøge sfære størrelse. Hvis mange kugler har en diameter på 300 m eller derover, fortsætte med snitning processen. Hak cellerne hver 7-10 dage.
      4. Hvis en hugge ikke er berettiget, udveksling 25-75% af CM med friske medier hver 3-4 dage, afhængigt af hvor hurtigt cellerne metabolizing medierne. Confortsætte til at udveksle alle indtil kuglerne er stor nok til passage.
      5. hNPCs typisk hakket i et forhold på 1:2, fra mindre kolber til større kolber. Brug Tabel 1 som en vejledning til kolben størrelse og volumen anbefalinger.
    2 T175s
    Flask Volumen af de samlede medier Pre-Chop Post-Chop
    1 T12.5 5 ml 1 T12.5 1 T25
    1 T25 10 ml 1 T25 1 T75
    1 T75 20 ml 1 T75 1 T175
    1 T175 40 ml 1 T175 2 T175s
    80 ml 2 T175s * 4 T175s
    * 2 T175s er det maksimale antal kolber, der kan hakkede ad gangen. Hak i sæt af 2 T175s og henvise til trin 7..

    Tabel 1. HNPC ekspansion paradigme. Beskrivelse af en typisk ekspansion ordning for hNPCs. Det er standard at udvide to gange volumetrisk hver 7-10 dage.

    3.. Chopper Setup

    Figur 1
    Figur 1.. McIlwain vævshakker. A) Chop tykkelse justering mikrometer, B) Chopper armbasen og fastgjort arm, C) Hook på plade holder til petriskål, D) Tabel udløserknap og bakke, E) Blade force kontrolknap, F) Reset-kontakten G) holder, Plate, H) Bolt tilknytning til klinge, lås og møtrik, I) Nut skruenøgle følger med chopper, J) Blade / lås møtrik, K) Blade lås, L ) Automatiseret hugning hastighedskontrol knop, M) Manuel snitning arm betjeningsknappen, N) afbryderen.

    1. Sæt helikopteren i en stikkontakt i BSC og tænd for hovedafbryderen (Figur 1 N). Indstil snitning afstand til 200 um (figur 1a). Indstil bladet kraft til 270 ° eller 09:00, hvis knop var et ur (Figur 1E). Bekræft, at den automatiske hastighed knop drejes så langt mod uret som muligt. (Figur 1L).
    2. Flytte bordet frigivelse hele vejen til højre bekræfte pladeholderen er stabil (figur 1D).
    3. Drej manual arm manipulator med uret for at hæve armen til sit maksimale niveau (figur 1M). Den manuelle arm manipulator må kun drejes med uret.
    4. Overfør aseptisk en steril, tveægget blenderkniv på chopper arm bolt ved hjælp af en pincet (fig. 1 H).
    5. Gennemføre dette trin for cGMP passaging, som petriskålen alene er tilstrækkeligt til forskning-grade forarbejdning. Som bemærket i trin 2.1.4, er shim skiver anbragt inde i petriskålen udgangspunkt kræves for cGMP. Shim skive forhindrer plast skårene fra indarbejde kuglerne under snitning procedure. For hver planlagt hugge, overfører en shim disk i bunden af ​​hver petriskål og dække.
    6. Aseptisk placere lås (figur 1K) over bladet ved hjælp af pincet. Den buede del af låsen skal være over den øverste kant af armen. Låsen vil ikke blive på armen, indtil møtrikken er blevet forsvarligt gammeldags. Brug pincet til at holde klasp på armen og sikre møtrikken (fig. 1J) på bolten med sterilt møtrik-driver. Lad møtrikken en ¼ omgang løs.

    4.. Pre-chop Procedure

    1. Overfør den foreslåede mængde af MM i det nye kolbe (r) pr tabel 2, kolonne C.
    2. Overfør aseptisk cellerne fra rugemaskinen i BSC. Lean kolben (r) på et rør rack (figur 2A), og lad kuglerne at bosætte sig i kolben (r).
    3. Når afregnes, aspireres op til 12 ml af supernatanten med en 5 eller 10 ml serologisk pipette og skylles alle løst adhærerende områder fra overfladen af ​​kolben (r). Gentag efter behov og afvikle sfærer mellem skylninger.
    4. Overfør den foreslåede mængde af CM i den nye kolbe (r) i henhold til tabel 2, kolonne D. Hvis passage to eller flere T175 kolber, se trin 7.1.
    5. Overfør alle resterende CM og kugler ind i en ny 15 ml konisk rør. Lad i områder til settle og brugt kolbe (r) kasseres.
    6. Kritisk Trin: Langsomt overføre kugler fra 15 ml konisk rør på 60 mm petriskål eller shim disk i laveste mulig volumen; 0,1-0,5 ml anbefales (figur 2B). Hold resterende mængde CM da det vil blive brugt til at skylle cellerne fra fadet post-chop. Prøv at minimere overfladearealet dækkes af medierne og kugler på fadet (Figur 2C).

    Figur 2
    Figur 2.. Sphere forberedelse til at hakke. A) Lean kolben (r) mod et rør rack eller lignende emne at afvikle sfærer i hjørnet af kolben. B) Overfør sfærer så tæt som muligt fra den koniske rør til Petri fad. C) Pool kuglerne fra den koniske rør i than midt i petriskål. D) Fjern så meget supernatant som muligt fra toppen af de samlede sfærer. E) Spred kugler ud ved hjælp af siden af en plastik mikropipette spids. F) forsigtigt flytte kugler til den ene side af bassinet . G) Eksempel af kugler, der er blevet flyttet til den ene side af poolen for at lette fjernelse medier. H) kondenseret kugler spredt ud på petriskålen, klar til at hakke. Klik her for at se større billede.

    1. Dernæst skal kondenseres ved at fjerne overføres over i trin 4.6 supernatant kuglerne. Supernatanten overføres tilbage i 15 ml konisk rør med en aerosol barriere spids mikropipette (figur 2D), undgå fjernelse af kugler. Start med at fjerne så meget medier som muligt fra toppen af ​​mediet / celle pool. Når det ikke er muligtat fjerne medier uden kugler, gå videre til næste trin.
    <td> 0 ml
    Kolonne A Kolonne B Kolonne C Kolonne D Kolonne E Kolonne F
    Pre-Chop Flask Størrelse Post-Chop Flask (r) Størrelse Foreslået mængde MM at overføre til ny kolbe (r) pre-chop Foreslået mængde af CM at overføre til ny kolbe (r) pre-chop Foreslået mængde af kugler / medier til at overføre til ny kolbe (r) post-chop Final Volume seedede / Flask
    T12.5 T25 5 ml 0 ml 5 ml 10 ml
    T25 T75 10 ml 10 ml 20 ml
    T75 T175 20 ml 10 ml 10 ml 40 ml
    1 T175 2 T175s 20 ml pr kolbe 15 ml pr kolbe 5 ml per kolbe 40 ml
    2 T75s 4 T175s 20 ml pr kolbe 17,5 ml pr kolbe 2,5 ml per kolbe 40 ml

    Tabel 2.. Medieoverførselstilstand guide pre / post-chop. Foreslåede mængder til brug under snitteprocessen.

    1. Spred puljen ud ved hjælp af siden af pipettespidsen for at øge overfladearealet (figur 2E).
    2. Kritisk Trin: Tip petriskålen lidt mod dig og bruge den side af pipettespids til forsigtigt slide alle kuglerne til den ene side af bassinet (figur 2F, G).
    3. Kritiske trin: Når alle celler er blevet flyttet, langsomt tip petriskålen den modsatte retning. Under processen vil medierne alene flyde væk fra sfærer. Overfør medie tilbage i 15 ml konisk rør. Minimal sfære fjernelse er acceptabel.
    4. Brug den side af pipettespids til forsigtigt at glide alle sfærer tilbage til midten af petriskålen så puljen har en diameter på 0,5 til 2,4 cm (figur 2H). Det er vigtigt at holde dybden af ​​kuglen pulje lavvandede. Hvis puljen er for dyb, vil kuglerne simpelthen blive skubbet til side under hakning. BEMÆRK: Diameteren af ​​kugle puljen kan ikke være større end 2,5 cm og klingen vil kontakte kanten af ​​petriskålen mangler cellerne.

    5.. Chop Procedure

    1. Overfør petriskålen på pladeholderen (figur 1G) og sikrer skålener sikret under pladeholderen kroge (figur 1C).
    2. Tabellen udløserknap har hak, hvor det vil passe ind i gear. Brug tabellen release knappen for at skubbe pladen holder til venstre, så bladet er klart af kugler og låst i gear (figur 1D).
    3. Kritisk Trin: Sænk chopper arm ved at dreje den manuelle manipulator knop (figur 1M) med uret, indtil kniven klikker fladt ned på petriskål. Brug den ene hånd til at trykke ned på armen mount (figur 1B), mens møtrikken strammes med nutdriver.
    4. Tryk på knappen nulstilles, når (figur 1F). Steady petriskålen med den ene hånd, mens du tænder den automatiske arm manipulator knop (figur 1L) med uret til 90 ° position eller 12:00, hvis knop var et ur. ADVARSEL: Hold fingrene væk fra bevægelige klinge på alle tidspunkter.
    5. Før kniven helt igennem puljen af ​​sfærer. Drej pladeholderen90 °.
    6. Løsn bolten, og gentag trin 5,3-5,5.
    7. Overfør aseptisk petriskålen fra pladen holderen på en arbejdsplads i BSC.

    6.. Post-chop Procedure

    1. Prime a 10 ml serologisk pipette med CM i den koniske rør fra trin 4.6 og derefter overføre 1 ml på de hakkede sfærer. Forsigtigt re-suspendere og overføres til en ny 15 ml konisk rør. Undgå bobler og gentag så mange gange som nødvendigt for at indsamle de hakkede sfærer.
      TIP: Minimer skrabning skål som plastik fragmenter kan løfte. Dette er ikke en bekymring, hvis du bruger de rustfri shim diske. Pas på celler forbundet med indersiden af ​​plast serologisk pipette. Hvis dette sker, aspiratprøver bobler intermitterende gennem medier i pipetten for at løsne cellerne.
    2. Mål mængden af ​​CM og hakkede sfærer. Derpå tilsættes en passende mængde MM til at opnå den mængde, der er anført i tabel 2, kolonne E.
    3. Triturereskugler 2-3x til at bryde op nogen løst sammensmeltede sfærer.
    4. Kritisk Trin: Afmål sfære suspensionen i hver ny kolbe. Kun overføre kuglen suspension i en kolbe ad gangen, og re-suspendere de sfærer mellem overførsler. Alikvoteringsprocessen flere kolber på et tidspunkt resulterer i et uforholdsmæssigt stort antal kugler i hver kolbe. Det endelige volumen i hver kolbe bør være lig med mængderne i tabel 2, kolonne F. Se trin 7.2, da såning mere end to T175 kolber.
    5. Fjern møtrikken med møtrikken-driveren og derefter låsen med steril pincet. Dekontaminér passende med 70% IPA eller tilsvarende. ADVARSEL: Fjern den brugte blenderkniv kun med en pincet og kassér i en bio-hazard affaldsbeholder.
    6. Dekontaminer alle overflader af helikopteren med 70% IPA.

    . 7 Proces Variationer - Flere Kolber

    Der er flere forskelle, når passage af mere end to T175s. Det skridts nedenfor er ændringer i den refererede trin.

    1. Henvisninger til trin 4.4:
      1. Når passage to T175s, kombinere alle de medier og kugler i én T175 kolber. Lad kuglerne at bosætte sig og derefter udportionerer den passende mængde CM ind i hver af de nye kolber som anført i tabel 2, kolonne D. Fortsæt til trin 4.5.
      2. Når passage mere end to T175s, få en ny T175 kolbe og etiket som CM kolben. Komplet trin 7.1.1, men overføre CM ind i CM kolben. Kolben Opbevar på siden af ​​BSC, der skal bruges til at indsamle CM fra alle kolber indtil alle kolber er blevet hugget. Derefter CM vil blive ligeligt alikvoteres i hver af de nye kolber.
    2. Henvisning trin 6.4 - Når snitning samme cellelinje flere gange, overføre hakket sfære suspension i en ny T75 kolbe mærkede kugler post-chop og registrere den overførte mængde. Fortsæt med at kombinere cellerne i dennekolbe efter hver chop og kolben opbevares i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed. Når alle koteletter er afsluttet, udportionerer kuglen suspension i volumen i hver ny kolbe. Fortsæt til trin 6.5.

    8.. Kryopræservering

    Følgende protokol er cryogenically bevare hNPCs.

    1. Optø celle frysemedium i en ren vandbad ved 37 ° C og derefter opbevares på is. Cell frysemedium kan alikvoteret og opbevaret ved -80 ˚ C i op til 6 måneder.
    2. Fire polish glas Pasteur pipetter ved at dreje åbningen af ​​pipetten i en flamme. Laves mindst to store og to små boring flammepolerede pipetter (figur 3). Kuglerne skal adskilles ved at flytte fra store til små kede pipetter.
    3. Placer TrypLE Vælg i vandbad ved 37 ° C i 5 min. Fjern og holde ved stuetemperatur, indtil klar til brug.


    Fig. 3. Fire polering glas Pasteur-pipetter. A) Hold pipetten i den øverste del af flammen og centrifugering for at jævnt runde kanter af glas pipette. B) Eksempel på en stor boring brand-poleret glas pipette. C) Eksempel på en lille boring flammepoleret glas pipette.

    1. Overfør aseptisk neurosfærerne i BSC. Lad kuglerne at bosætte sig ved at læne kolben (r) mod et rør rack og skyl bunden af ​​kolben for at fjerne eventuelle løst vedhængende sfærer. Lad i områder til genbosætte.
    2. Overfør alle, men 5-10 ml CM ind i en steril flaske og måle det samlede volumen. Placer de resterende kugler og medier i et konisk rør.
    3. Efter alle celler har afgjort, overføre alle, men en lille menisk af CM i flasken og summere VOLume.
    4. Aseptisk overførsel 5-10 ml varmet TrypLE Select i den koniske rør og re-suspendere cellepelleten. Overfør konisk rør i 37 ° C vandbad i 15-20 min. Efter 7,5-10 minutter, forsigtigt ryste den koniske rør for at blande.
    5. Brug det målte CM volumen fra trin 8.5 og forberede en tilsvarende mængde MM. Kombiner og foretage 50% CM og 50% MM opløsning (CM / MM opløsning).
    6. Overfør aseptisk en 40 um si i en 50 ml konisk rør.
    7. Når inkubationen er færdig, dreje 15 ml koniske rør til 15 sekunder ved 100 x g.
    8. Aspirer forsigtigt og kassér TrypLE Vælg og enhver træede substrat. Efterlad en lille menisk. Forsigtigt tilføje 2 - 4 ml CM / MM til at fortynde den resterende TrypLE Select mens ikke forstyrre bundfaldet. Lad enhver løsnet celler igen afregne før de kasserer vask.
    9. Tilføj 2-5 ml CM / MM løsning på rør sfærer. Adskille kugler med en 5 ml pipette ved findeling et maksimum på 10x. Lad undissocierede sfærer nøjes med 1-2 min. Overfør dissocierede cellesuspension på 40 um si helt fjerne udissocierede klynger.
    10. Gentag trin 8.12 med en brand-poleret stor diameter glas pipette og derefter en lille boring glas pipette.
    11. Skyl filteret med 2-5 ml CM / MM løsning.
    12. Bland cellesuspensionen og udtage prøver for levedygtighed analyse.
    13. Fortynd prøverne med trypanblå på et passende fortyndingsfaktor og tælle. Brug standard nedenstående ligning til at beregne den gennemsnitlige koncentration af levedygtige celler og beregne de totale levedygtige celler.
      Ligning 1
    14. Beregn det samlede volumen af celle frysning medier forpligtet til at re-suspendere cellerne ved 5,0 x 10 6 celler / ml. 1 ml celler podes i hver cryovial. Overfør kryoglas i BSC.
    15. Centrifugeres cellesuspensionen ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C i 15 ml koniske rør for bedste udbytte. Hvis der anvendes 50 ml koniske rør til en stor skala fryse ned, øge hastighed og tid til 400 xg i 10 min.
    16. Re-suspendere cellepelleten ved anvendelse af cellen frysemedium ved 5,0 x 10 6 celler / ml. Afmål 1 ml cellesuspension i hvert kryoglas. For en jævn fordeling, aspirat 6 ml suspension og alikvote 5 kryoglas x 1 ml. Overfør de resterende 1 ml suspension tilbage i den pulje af celler. Gentag indtil alle hætteglas er blevet fyldt.
    17. Aseptisk forsegle alle seedede kryoglas og overføre dem på is i 5-10 min.
    18. Brug en af følgende til kryopræservering strategier til at bevare hNPCs: isopropylalkohol Afdeling
      1. Fyld det nødvendige antal kammer (r) med 100% IPA ved stuetemperatur.
      2. Overfør podede kryoglas fra isen i kammeret (r) og overføre kammer (r) i en -80 ° C fryser natten over. Cellerne er stabile i op til én uge ved -80 ° C, menforeslås det at overføre hætteglas til langsigtet lagring i flydende nitrogen den følgende dag.

      Kontrolleret Rate Fryser

      1. Upload et passende nedfrysningsprogram til styret hastighed fryser software. Et eksempel program er anført i tabel 3.. Figur 4 viser en typisk frysning kurve for hNPCs. Imidlertid vil den nøjagtige program varierer for hver fryser model. Standarden samlede sample rate bør være tæt på -1 ° C / min, indtil den når -40 ° C, hvor satsen for frost kan være væsentligt forøget til mindst -80 ° C.
    Step Rate (° C) End Temperatur (° C) Hold (min sek) Trigger
    1 </ Td> - - 5 min 0 sec Kammer
    2 - 1,3 - 5 - Prøve
    3 - - 1 min 0 sec Kammer
    4. - 45 - 58 - Kammer
    5. + 10 - 26 - Kammer
    6 + 3 - 23 - Kammer
    7 - 0,8 - 40 - Prøve
    8. - 10 - 100 - Kammer
    9 - 35 - 160 - Kammer

    Tabel 3. Trin til frysning hNPCs i et kontrolleret rspiste fryser. Foreslået program for hNPC nedfrysning på en kontrolleret hastighed fryser.

    Figur 4
    Figur 4.. Prøve frysning kurve. Typisk frysning kurve for hNPCs på en kontrolleret hastighed fryser.

      1. Overfør kryoglas fra isen i kurvene, der er forbundet med kontrol-rate fryseren. Vær sikker på at indlæse en cryovial med kun celle frysning medier til brug for prøven temperaturføler. Overfør kurvene i fryserummet og placere prøvesonden på sonden hætteglasset. Starte programmet.
      2. Når protokollen er afsluttet, overfører hætteglas i langsigtet flydende nitrogen opbevaring.

    9.. Optøning Procedure

    Følgende protokol er til optøning cryogenically pforbeholdt hNPCs.

    1. Overfør kryoglas fra lagring i flydende nitrogen umiddelbart på tøris. ADVARSEL: Hætteglas kan have revner eller løse låg tillader flydende nitrogen for at komme ind i hætteglasset. Når den fjernes fra dybfrostemballage betingelser kan væsken koges straks eksploderer hætteglasset. Brug korrekt PPE når du fjerner hætteglas.
    2. Forbered samtlige reagenser og forsyninger under forvejen. Når optøningen er begyndt, er det vigtigt at følge op effektivt.
      1. Overfør neural stamcelle Expansion Medium, MM, en 15 ml konisk rør, en 2 ml og en 10 ml serologisk pipette for hver cryovial i BSC.
      2. Et minimum af 9 ml neural stamcelle Expansion Medium og 5 ml MM er påkrævet for hvert hætteglas. Forbered mere af hvert medie, hvis nødvendigt.
    3. Kun tø et hætteglas af hNPCs ad gangen. Overfør frosne celler fra tøris i en ren 37 ° C vandbad og omrøres hætteglasset i vandbadet kontinuerligt. Kontrollere omfanget afis, der er smeltet. Når der er et stykke af is omkring 0,5 cm tilbage i hætteglasset, spray og tør med 70% isopropylalkohol og overføres til BSC.
    4. Overfør indholdet af kryoglas til et 15 ml konisk rør med en 2 ml serologisk pipette. Der tilsættes 1 ml neural stamcelle Expansion Medium til den tomme cryovial og derefter overføre 8 ml neural stamcelle Expansion Medium på de optøede celler i en langsom, drop klog måde, mens forsigtigt at ryste røret. Dette er gjort for at mindske risikoen for osmotisk chok.
    5. Overfør skylning fra cryovialet til 9 ml cellesuspension. Overfør konisk rør på is, og gentag trin 9,4-9,5 for alle resterende hætteglas.
    6. Centrifuger koniske rør ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Under centrifugering forberede passende antal kolber til såning baseret på tabel 4.
    # Hætteglas Samlet Seedning Volumen (ml) Flask
    1 5. T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4. 20 T75
    5. 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8. 40 T175
    8 + - Kombination af Kolber

    Tabel 4. Kolbestørrelser baseret på antallet af kryoglas optøede. Foreslåede volumen og kolben størrelse til frø hNPCs efter optøning.

    1. Re-suspendere og kombinere alle rør i den passende mængde MM baseret på tabel 4.. Bland godt og reflytte en prøve for levedygtighed optælling. Se trin 8,15-8,16 til at tælle detaljer. Standarden såning er mellem 160,000-320,000 celler / cm 2.
    2. Bland cellerne godt udportionerer cellerne i kolber. Overfør kolberne til en CO 2/37 ° C/95% luftfugtighed inkubator 5%. Bland kolben ved forsigtigt at ryste og tilbage for at fordele cellerne.
    3. Cellerne vil danne sfærer inden for 24-48 timer. Lejlighedsvis cellerne vil klæbe til plastic overflade og danne en honeycomb-lignende koloni distribution. Hvis dette sker, skal du lade cellerne i 3 dage før skylning cellerne løs, medvirken i kugle-dannelse. Skyl hver 1-3 dage, indtil der ikke adhærente celler. Hvis det er nødvendigt overføre cellerne til en ny kolbe.
    4. Exchange 25-75% af medier med MM hver 3-4 dage, indtil cellerne er klar til at hugge, som regel 7-14 dage efter optøning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 5
Figur 5.. Repræsentative data. A) Forventede celletal af hNPCs fastfrosset på P19, så optøet og udvidet som en Tilhænger enkeltlags hjælp enzymatisk dissociation i forhold til neurosfærer passeret via Snittemetoden. Dag 0 betegner, når cellerne blev optøet ved p20. B) Repræsentative billeder af kugler pre-chop, 10X. C) Repræsentative billeder af kugler efter chop, 10X. D) farveprøven anvendes til at beskrive graden af medier konditionering i cGMP- sammenlignelige protokoller. E) Immuncytokemi af optøede P29 hNPCs der blev udpladet i 1 dag og farvet for nestin (rød) ekspression. Hoechst nuklear counter plet (blå). F) Immuncytokemi af optøede P29 hNPCs der blev udpladet i 7 dage og pleted for GFAP (Rød) og β-III tubulin (grøn). Klik her for at se større billede.

5A repræsenterer hNPCs optøet ved p20 (dag 0) og vedligeholdes klæbende til laminin-belagt vævskulturkolber eller som ikke-adhærente neurosfærer passeret via Snittemetoden. Omliggende celler blev enzymatisk dissocieret ved hjælp TrypLE Vælg ugentligt og senesced efter 70 dage (7-10 passager) i kultur. I modsætning hertil neurosfærerne optøede ved passage 20 og ekspanderet via snitning teknik steg til mere end 40 passager før ældning. Typiske hNPCs før snitning (figur 5B), bør være overvejende ≥ 300 um i diameter. Når hakket, er sfærer generelt indkvarteret i variabelt mellemstore sektioner, for det meste omkring 200 um i diameter (figur 5C). Det er vigtigt at bemærke, at hNPCs udvidet via Chopping metode opretholde udtryk for hNPC markører og kan producere både astrocytter og neuroner efter differentiering. Sene passage hNPCs blev dissocieret, belagte på laminin-belagt dækglas i en periode på én eller syv dage, og derefter fikseret med 4% paraformaldehyd. De hNPCs udtrykker progenitorcelleaktivitet markør nestin (Millipore, 1:1000) på 1 dag belagte hNPCs (fig. 5e) samt de differentierede neurale markører gliafibrillært surt protein (GFAP, 1:500), og β-III tubulin (1: 2.000) på syv dage belagte hNPCs (figur 5F), markører for astrocytter og umodne neuroner, hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 6
Figur 6.. Chopping Skematisk. Udvidelse klumpformet stamceller / stamceller i kultur ved hjælp af den mekaniske Snittemetoden.

Kritiske trin

En oversigt over snitning ekspansion paradigme er vist i figur 6.. HNPC sfære størrelse er en af de vigtige kriterier for at observere, før passage neurosfærerne. Selv om der er en stor varians i kugle størrelse, bør mindst 30% af kuglerne har en diameter større end 300 um. Hvis kuglerne er for små til passage, skal du blot udveksle CM med frisk MM (25% -50%) og revurdere efter 1-4 dage. Dårlig ekspansion satser opstår, når kuglerne passage ved en for lille diameter.

hNPC ekspansion satser er også afhængig sfære tæthed og medier conditioning grund secernerede faktorer 47. Men hvis medierne overdrevent metaboliseres og vigtige vækstfaktorer er formindsket, kan cellerne erhverve en karyotypiske abnorm population af celler 48. Derfor skal udskiftning næringsstoffer og vækstfaktorer være afbalanceret med udskilte trofiske faktorer. Når såning hNPCs post-chop eller post-tø, er variabelt antal neurosfærer pr cm 3 medier. Den generelle regel er, at jo større tæthed, jo hurtigere kan medierne tilstand og jo højere udvidelseshastighed, forudsat at mediet udskiftes efter behov. Bruge medierne-condition farvespektrum (figur 5D), der spænder fra pink, når un-metaboliseret, til gul, når mediet er fuldt metaboliseret. Den ideelle medie farve til logaritmisk vækst er en rødlig-orange farve, # 3 på farveprøven. Dette indikerer mediet indeholder tilstrækkelige næringsstoffer og vækstfaktorer og samtidig opretholde en tilstrækkelig koncentration af udskilt Trophic faktorer. Medierne må ikke betinge forbi # 4 på farveprøven. Alternativt når cellerne ikke metabolizing medier hurtigt (# 1 på farveprøven), vil hNPCs vokse langsommere og kræver en hugge hver 10-20 dage i modsætning til hver 7-10 dage. Det er vigtigt at øge kultur tæthed for at øge condition, hvilket igen vil forbedre ekspansion satser.

Under snitning procedure notere følgende kritiske trin. Sørg for, at klingen er monteret parallelt med chopper arm. Hvis kniven ikke er flad på overfladen af ​​petriskålen eller shim disken, kan mange områder ikke hakket. Bemærk spredningen af ​​celler diskuteres i trin 4.11. Kuglerne skal forblive i midten af ​​petriskålen eller bladet vil kontakte væggen, før alle sfærer er blevet hugget. Endelig er det vigtigt at undgå tørring af hNPCs for en længere periode under snitning processen. Efter at have placeret kugler i skålen, hakke og oversvømme dem med friske medier, så snartmuligt.

Da denne teknik kræver flere stykker udstyr, kan der være risiko for sterilitet af kulturen. I betragtning af denne risiko, skal korrekt steril teknik anvendes under hele proceduren. Til grundforskning niveau produktion, tørre ned alt udstyr med 70% IPA eller tilsvarende er tilstrækkeligt sammen med valgfri ultraviolet inkubation i mindst 15 min. Udfør alle trin inde i en steril BSC. Til produktion cGMP niveau, skal helikopteren steriliseres med ethylenoxid som foreslået af producenten. Alle andre forsyninger kan købes steril eller autoklaveres.

Fremtidige applikationer

Overgangen enhver grundforskning terapi fra bænken til bedside kan være en udfordring. Den hakke procedure blev designet med denne overgang i tankerne. Proceduren er allerede blevet brugt til at fremstille en cGMP-kompatibel hNPC bank ved University of Wisconsin Waisman center Bio-produktionsanlæg. That hNPC Banken blev indkøbt til udvidelse af en farmaceutisk kvalitet hNPC celle masse, der vil blive brugt til nye prækliniske lægemiddelkandidat studier og et klinisk fase 1-forsøg efter Federal Drug Administration godkendelse. Der er andre celletyper, der bruger denne fremgangsmåde for ekspansion. Et eksempel er EZ kugler, neurale stamceller genereret fra pluripotente stamceller 41. Denne teknik har et stort potentiale til brug med andre typer af væv, der kræver konstant celle-til-celle-kontakt under ekspansion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Soshana Svendsen til kritisk gennemgang og redigering af denne rapport. Dette arbejde blev medvirket til af NIH / NINDS 1U24NS078370-01 og CIRM Dr2a-05320.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45, (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

En cGMP-gældende Expansion Metode til aggregater af humane neurale Stem og stamceller arvet fra pluripotente stamceller eller fostrets hjerne Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter