Summary
El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.
Abstract
Endocítica tráfico regulado es el mecanismo central facilitar una variedad de eventos neuromoduladores, mediante el control de forma dinámica del receptor, canal de iones, transportador y presentación de la superficie celular en una escala de tiempo de minutos. Hay una gran diversidad de mecanismos que controlan el tráfico endocítica de las proteínas individuales. Los estudios que investigan las bases moleculares de la trata se han basado principalmente en la superficie de biotinilación para medir cuantitativamente los cambios en la expresión de proteínas de superficie de membrana en respuesta a estímulos exógenos y la manipulación genética. Sin embargo, este enfoque se ha limitado principalmente a las células cultivadas, que pueden no reflejar fielmente los mecanismos fisiológicamente relevantes en juego en las neuronas adultas. Por otra parte, los enfoques de células cultivadas pueden subestimar las diferencias específicas de la región en los mecanismos de la trata. Aquí se describe un enfoque que se extiende biotinilación superficie de la célula a la preparación de cortes de cerebro aguda. Nosotrosdemuestran que este método ofrece un enfoque de alta fidelidad para medir los cambios rápidos en los niveles de proteínas de superficie de membrana en las neuronas adultas. Este enfoque es probable que tenga una amplia utilidad en el ámbito del tráfico neuronal endocítica.
Introduction
Endocítica tráfico es un mecanismo celular ubicua que afina la presentación membrana plasmática de una variedad de proteínas integrales de membrana. Endocitosis proporciona nutrientes vitales para el medio intracelular 1 y desensibiliza la señalización del receptor en respuesta a la activación del receptor 2. Endocítica reciclar de nuevo a la membrana de plasma puede mejorar adicionalmente la señalización celular mediante el aumento de los niveles de expresión de proteínas en la superficie celular 3. Por otra parte, las perturbaciones de transporte de membrana están implicadas en numerosas enfermedades y condiciones patológicas 4,5, haciendo hincapié en la necesidad de investigar los mecanismos moleculares que regulan el tráfico de proteínas endocítica. Mientras que muchas proteínas utilizan mecanismos de internalización clásicos clatrina dependiente, pruebas de montaje en los últimos años demuestra que los múltiples mecanismos de endocitosis clathrin independiente gobiernan el potencial endocítica de un conjunto cada vez mayor deproteínas 6,7. Por lo tanto, la necesidad de investigar los mecanismos de endocitosis que favorecen la trata en los sistemas fisiológicos relevantes ha crecido considerablemente.
En el cerebro, el tráfico endocítica de receptores, canales iónicos y transportadores de neurotransmisores tiene un papel principal en el establecimiento de la plasticidad sináptica 8-11 y la respuesta a drogas de abuso 12-15, en última instancia afectan a la excitabilidad neuronal y las respuestas sinápticas. Hasta la fecha la mayoría de los estudios de tráfico neuronales, apoyarse en los sistemas de expresión heterólogos o neuronas en cultivo primario, ninguno de los cuales puede reflejar de forma fiable los mecanismos en juego en las neuronas adultas. Aquí, se presenta un enfoque que utiliza biotinilación superficie para medir cuantitativamente los niveles de proteína de superficie en rodajas de cerebro agudas derivadas de roedores adultos. Con este enfoque, se presentan datos que demuestran que el ratón estriatal de dopamina transportador internaliza rápidamente en rerespuesta a forbol éster mediada por la activación de la proteína quinasa C (PKC).
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Protocol
Todo el manejo de animales y la recolección de tejido se realizó de acuerdo con las directrices de la Universidad de Massachusetts Medical School Comité de Uso Institucional Cuidado de Animales (IACUC), siguiendo el protocolo aprobado # A1506 (Melikian, PI).
Soluciones requeridas
Líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) - Hacer fresco todos los días
NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3, y 11 mM de glucosa
Nota: Prepare ACSF como una solución madre de 10 veces, con exclusión de NaHCO3 y glucosa. Hacer las soluciones de trabajo 1x todos los días de la 10x, que complementa con frescos glucosa NaHCO3 y.
ACSF sacarosa suplementados (SACSF) - Hacer fresco todos los días
Suc 250 mMrosa, KCl 2,5, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO3 y glucosa 11 mM
Nota: Prepare SACSF como una solución madre de 10 veces, con exclusión de NaHCO3 y glucosa. Hacer las soluciones de trabajo 1x todos los días de la 10x, que complementa con frescos glucosa NaHCO3 y.
Sulfo-N-hidroxisuccinilo-SS-biotina (sulfo-NHS-SS-biotina, Pierce Chemical Company)
Las soluciones madre deben ser de 200 mg / ml en DMSO y son resistentes a múltiples ciclos de congelación / descongelación. Las alícuotas se almacenaron a -20 ° C. El éster de succinil se hidroliza rápidamente en solución acuosa, por lo que las soluciones de trabajo debe prepararse inmediatamente antes de aplicar a las rebanadas.
Slice Solución Quench
ACSF suplementado con glicina 100 mM
Lisis RIPA Buffer
Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1,0 mM, 1% de Triton-X-100, 0,1% de SDS, 1% de Na desoxicolato
RIPA con inhibidores de la proteasa (RIPA / PI) - Hacer fresco todos los días
RIPA suplementado con leupeptina 1 mM, pepstatina 1 mM, 1 mM de aprotinina, y 1 mM fenilmetil sulfonil fluoruro.
1. Preparar cerebrales Slices
- Hacer SACSF 1x fresco y 1x ACSF
- Chill SACSF en el hielo en un vaso pequeño. Esto se utiliza para mantener el cerebro de ratón recién cosechado.
- Saturar la ACSF y SACSF con oxígeno mediante burbujeo con 95% / 5% de O 2 / CO 2, 20 min en hielo.
- P30-38 ratones se deben utilizar para la viabilidad del tejido óptimo. Sacrificar animales por dislocación cervical y decapitación, y eliminar rápidamente los cerebros en previamente enfriado, SACSF oxigenada.
- El uso de un microtomo vibrante, hacer 300 micras secciones cerebrales en la región de interés.
- Si se desea, las rebanadas se pueden disecados más antes de la recuperación para enriquecer en regiones particulares del cerebro o derecho por separado y los hemisferios izquierdo para utilizar como control y rebanadas experimentales, respectivamente.
- Utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, transferir las rebanadas a la malla de fondo en las cámaras establecidas en placas de 24 pocillos.
- Permitir que las rebanadas se recuperen durante 40 min, 31 ° C en ACSF oxigenada, con continua, suave burbujeo.
2. Tratamiento de Drogas (si procede) y Slice Biotinilación
- Después de la recuperación, lavar 3 veces en rodajas precalentado (37 º C), burbujeante ACSF oxigenada constantemente con un 95% / 5% O 2 / CO 2.
- Añadir los compuestos de ensayo y se incuba con oxigenación continua.
- Para mayor comodidad, agregue un th volumen de 10x fármaco concentrado 1/10, y mezclar por inversión suave.
- Agitar las placas suavemente en un baño de agua a la temperatura deseada.
- Después de tratamiento de drogas, rápidamenterodajas de frío por lavar 3 veces en el hielo frío ACSF.
3. Las proteínas de superficie biotinilar
- Preparar 1,0 mg / ml de sulfo-NHS-SS-biotina en hielo frío ACSF inmediatamente antes de etiquetado.
- Añadir 0,75 ml de sulfo-NHS-SS-biotina a rodajas y se incuba rodajas de hielo, 45 min.
- Lavar rebanadas tres veces rápidamente con ACSF enfriado en hielo, a continuación se incuba durante 10 min en hielo ACSF frío en hielo.
- Lávese las rebanadas tres veces con tampón de hielo de enfriamiento rebanada fría e incubar con 0,75 ml de tampón de enfriamiento corte dos veces, 25 min, en el hielo para calmar libre sulfo-NHS-SS-biotina.
4. Preparar lisados tisulares
- Lavar rebanadas tres veces en hielo frío ACSF y transferir cada sector a un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego.
- Pellet suavemente rebanada centrifugando 200 xg, 1 min y cuidadosamente aspirado restante ACSF.
- Añadir 400 l de hielo frío RIPA / PI y romper el tejido de la pipeta hacia arriba y hacia abajo una vez a través de un pip P200ette.
- Transferencia disociado rebanada / RIPA a un tubo fresco y se incuba 30 min, 4 ° C, rotación, para completar la lisis.
- Se precipitan los desechos celulares por centrifugación, 18.000 xg, 15 min, 4 º C.
- Determinar las concentraciones de proteína lisado utilizando el ensayo de proteína BCA, con albúmina de suero bovino (BSA) como estándar.
5. Aislar Biotinylated Proteínas
- Optimizar bolas relación proteína / total.
Nota: Los niveles de expresión de proteínas individuales pueden variar ampliamente entre las diferentes regiones del cerebro. A menos que la totalidad de la proteína biotinilada en una cantidad dada de lisado de tejido es capturado, no es posible detectar con precisión los cambios potenciales en la expresión de superficie. Por lo tanto, es imperativo determinar empíricamente la relación óptima de proteínas del grano / total de una región de la proteína / particular del cerebro antes de embarcarse en un nuevo estudio biotinylation rebanada.- Incubar 25 mu l de estreptavidina perlas de agarosa con el aumento de cantidads de lisado tisular (rango aproximado de 25-200 mg), y luego proceder como se describe a continuación para la unión, las etapas de lavado y elución.
- Cuantificar las bandas inmunorreactivas resultantes y elegir una relación grano / lisado en el rango lineal de la unión que va a permitir la cuantificación exacta de aumento o disminución de la expresión de proteínas de superficie.
- Preparar perlas de estreptavidina-agarosa
- Determinar el volumen de perla total es necesario para todas las muestras. Preparar un volumen de grano suficiente para esa cantidad más uno extra (es decir, 4 muestras de 25 l / muestra = 100 l beads + uno = 125 mu l adicionales cuentas.
- Vortex Estreptovidina grano de valores y pipeta de volumen fuera deseaban. Si se utiliza una pipeta P200, cortar el extremo de la punta para evitar daños obstrucción o perla.
- Lávese las perlas 3 veces en 0,5-1,0 ml RIPA / PI para eliminar conservantes, vórtex después de cada adición RIPA y recogiendo los granos entre lavados por centrifugación 18.000 xg, 1 min, al temperamento habitaciónratura.
- Aspirar fuera de amortiguación entre lavados utilizando una pipeta Pasteur de vidrio unido a un matraz de vacío. Una punta de P200 de plástico unida al extremo de la pipeta Pasteur de vidrio proporciona un control más preciso cuando la aspiración. No es necesario quitar absolutamente toda la memoria intermedia para los dos primeros lavados, ya que corre el riesgo de perlas de aspiración en la pipeta. Después del lavado final, quitar tanto el exceso de tampón como sea posible y sin aspiración de las perlas.
- Añadir RIPA / PI para llevar cuentas de nuevo a su volumen original, la pipeta hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender. Evitar la agitación con vórtex en este punto, como perlas se adhieren a la pared del tubo.
- Perlas de alícuotas en tubos de microcentrífuga con un P200 con la punta cortada. Pipetear hacia arriba y abajo varias veces entre el muestreo para asegurar los granos permanecen suspendidas uniformemente y dividido entre los tubos.
- Proteínas con biotina se unen a estreptavidina cuentas
- Distribuir los lisados celulares a los tubos que contienen las perlas de agarosa. Para los experimentos whe re múltiples muestras están siendo comparados, asegúrese de utilizar la misma cantidad de proteína de cada muestra para las comparaciones precisas.
- Añadir RIPA / PI adicional para llevar a muestras de un volumen mínimo de 200 l. Esto asegura que las muestras se mezclan adecuadamente durante la incubación y también unifica las concentraciones de proteínas a través de muestras.
- Coloque los tubos en un rotador de tubo y mezcle durante la noche a 4 ° C.
- En tubos separados, dispensar un equivalente del volumen de lisado total utilizado para cada muestra. Alternativamente, si los volúmenes de muestra son elevados, una fracción del volumen total de lisado se puede reservar en lugar, para acomodar los volúmenes de carga máxima sobre geles de SDS-PAGE. Estos serán utilizados para normalizar la expresión de la superficie a la cantidad total de proteína.
- Añadir ya sea un volumen igual de 2x o quinto volumen de 6x tampón de muestra de SDS-PAGE y, o bien se incuba a 4 ° C, en paralelo con muestras de perlas, o almacenar a -20 ° C hasta que se analizaron las muestras.
- Pellet perlas por centrifugación 18.000 x g, 2 min, a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y lavar perlas tres veces con 0,75 ml RIPA. Para reducir al mínimo la pérdida de grano, dejar un pequeño volumen jefe del tampón anterior cuentas entre lavados. Después del lavado final, eliminar la mayor cantidad de RIPA como sea posible, sin alterar el sedimento de perlas.
- Eluir proteínas biotiniladas a partir de perlas de estreptavidina mediante la reducción del enlace disulfuro. Añadir 25 l de 2x tampón de muestra reductor, así vórtice SDS-PAGE y girar muestras 30 min, temperatura ambiente.
Nota: Muchas proteínas de membrana tienen una alta tendencia a agregarse cuando se hierve en tampón de muestra de SDS-PAGE, perjudicando gravemente su movilidad electroforética. Si este es el caso para la proteína que se investiga, evitar calentamiento de las muestras y, en cambio, eluir lentamente a temperatura ambiente. Si la ebullición es absolutamente necesario (por ejemplo, si otra proteína evaluada en paralelo requiere de ebullición), sampltampón E puede ser complementada con 2 M de urea (concentración final) para reducir al mínimo la agregación. Aunque es eficaz en la reducción de la agregación en algunos casos, la urea a menudo compromete apariciones de la banda. - Analizar las muestras por inmunoblot.
- Descongelar total de muestras de lisado y girar en paralelo con muestras de perlas, 30 min, temperatura ambiente.
- Proteínas separadas en geles de SDS-PAGE.
- Identificar la proteína (s) de interés por inmunotransferencia.
- Asegúrese de que las bandas se detectan en el intervalo lineal de detección para la cuantificación adecuada.
- Para asegurar que el reactivo de biotinilación no ha tenido acceso a las proteínas intracelulares a través de las células dañadas / comprometidos. Esto se logra mejor por inmunotransferencia en paralelo para una proteína intracelular específica del tipo de célula que se está investigado.
- Cuantificar banda densidades y calcular la densidad relativa superficie de la proteína como un porcentaje del nivel total de expresión de la proteína.
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Representative Results
El transportador de dopamina neuronal se internaliza en respuesta a la activación de PKC en líneas celulares de 16-20. A pesar de muchos informes que demuestran las pérdidas de superficie DAT inducidas por la PKC en una variedad de líneas celulares y sistemas de expresión, ha sido un reto para confirmar este hallazgo en las neuronas dopaminérgicas cultivadas 21-23. Se utilizó rodajas de cuerpo estriado de ratón para probar directamente si DAT internaliza en respuesta a la activación de PKC en las neuronas dopaminérgicas adultos. Después de la preparación rebanada, rebanadas fueron hemiseccionaron lo largo de la línea media y rodajas de planos idénticos fueron tratados ± 1 M forbol miristato-13 acetato (PMA) durante 30 min, 37 ° C. Los cortes se enfría rápidamente y proteínas de la superficie se biotinilaron y aislaron como se describe en el Protocolo. Las inmunotransferencias se sondaron para DAT, y también para la tirosina hidroxilasa (TH), en paralelo, para medir si el reactivo de biotinilación ganó cualquier acceso intracelular en las neuronas dopaminérgicas. Como se ve enFigura 1 (superior), se detectó la expresión de superficie sólida DAT en el cuerpo estriado del ratón bajo condiciones basales (tratados con vehículo), con 81,4 ± 5,8% del total de DAT en la superficie celular. La activación de PKC con PMA 1 M, 30 min, 37 ° C se redujo significativamente la expresión de superficie de DAT a 60,8 ± 5,2% DAT total, que corresponde a la pérdida de ~ 30% de DAT de la membrana plasmática. En contraste, sólo el 1,6 ± 0,4% del total TH se biotiniló (Figura 1, parte inferior), coherente con su localización intracelular y la confirmación de que el reactivo de biotinilación fue excluido del interior de la célula de las neuronas dopaminérgicas.
Figura 1. La activación de PKC aguda disminuye niveles de la superficie del transportador de dopamina en las neuronas del cuerpo estriado adultos. Ratón estriatal Slice Biotinailación. Rodajas de cuerpo estriado de ratón agudas se prepararon como se describe en el Protocolo y se trataron ± PMA 1 M, 30 min, 37 ° C. Proteínas de superficie se acoplaron covalentemente a la biotina y se aislaron por cromatografía de estreptavidina por lotes. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia con rata anti-DAT y ratón anticuerpos anti-TH. Las bandas inmunorreactivas fueron capturadas con una cámara CCD estación de imagen VersaDoc y densidades de las bandas nonsaturating se cuantificarán mediante un software Cantidad. Top: inmunoblot Representante mostrar biotinilado y el total de DAT y TH siguiendo los tratamientos indicados. Abajo: Datos medios. Señal de la proteína biotinilada expresa como proteína total% ± SEM * Significativamente diferente del control, la prueba de la t de Student, p <0.03, n = 6.
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Discussion
A pesar del conocimiento de muchos años que el tráfico endocítica críticamente impactos de señalización sináptica en el cerebro, que ha resultado ser un desafío para medir cuantitativamente los cambios en la expresión de superficie de la proteína en las neuronas adultas. En este trabajo, se presenta un enfoque fiable para etiquetar proteína de la superficie ex vivo en rodajas de cerebro agudas. Preparaciones de cortes de cerebro tienen una larga historia de utilidad para los registros electrofisiológicos, ya que mantienen conexiones sinápticas y la viabilidad celular hasta horas después de su preparación. Además, las estrategias de corte en lonchas se pueden optimizar para preservar conexiones sinápticas específicas entre diversas regiones del cerebro de interés.
Gran parte del trabajo antes de investigar el tráfico neuronal proteína en los preparados derivados del cerebro ha dependido principalmente de sinaptosomas y las neuronas de cultivo primario. El método de enfoque biotinylation rebanada aguda cuenta con varias ventajas con respecto a cualquiera de these: sinaptosomas se eliminan físicamente del axón y pueden no incluir los factores moleculares necesario recapitular fielmente el tráfico de proteínas neuronales intactos. Además, las preparaciones de sinaptosomas están a menudo contaminados con fragmentos de membrana que pueden sesgar los resultados experimentales. Cultivos neuronales primarios se derivan típicamente de neuronas inmaduras de desarrollo que quizás no se han diferenciado adecuadamente en sus fenotipos neuronales maduras que expresan mecanismos de tráfico de células específicas. En contraste, las rebanadas agudas presentan alto grado de viabilidad celular y se derivan de los animales adultos. Por otra parte, el tráfico de superficie puede ser comparado siguiente in vivo manipulaciones moleculares, tales como la entrega de genes / caída, optogenético neuronal estimulación / inhibición, o después de los tratamientos farmacológicos in vivo o adaptaciones de comportamiento en.
Aunque hay muchas ventajas a la ex vivo spiojos enfoque, hay varias limitaciones. Aguda (culturalizado) rodajas de cerebro tienen viabilidad limitada y por lo tanto no son adecuados para tratamientos crónicos de drogas. Por otra parte, se observó que no permanecen viables durante experimentos de cambio de temperatura, donde los cortes se enfrían y calientan de nuevo rápidamente. Además, las rebanadas son más viable cuando se preparan a partir de ratones P21-P35, limitando potencialmente la cantidad de tiempo que los tratamientos in vivo puede llevarse a cabo antes de realizar los experimentos. De hecho, el uso de una solución de sacarosa alta corte, nos encontramos con que el tráfico de DAT se observa menos reproducible en cortes preparados a partir de los ratones P35-P42 (Gabriel y Melikian, datos no publicados). Sin embargo, se observa claramente mejorada viabilidad rebanada en animales de mayor edad mediante la preparación rebanada modificado según lo descrito por Zhao et al. 24 Este enfoque es una excelente alternativa donde los parámetros metodológicos requieren el uso de animales de más edad (es decir. Siguiente eitsu expresión mediada por virus de proteína / RNA, comportamientos constitutivos o crónica en los tratamientos farmacológicos in vivo).
Hay varios factores técnicos adicionales que pueden influir en el resultado experimental. Es imperativo determinar empíricamente la relación óptima de proteínas del grano / total necesario para capturar toda la proteína biotinilada en una determinada cantidad de proteína total lisado antes de intentar experimentos cuantitativos. Este problema es frecuentemente pasado por alto, pero puede ser el factor decisivo en la capacidad de detectar los cambios en la expresión de proteínas de superficie. Si toda la proteína biotinilada no se recupera cuantitativamente, cambios en los niveles de superficie será ya sea indetectable o medido de manera inexacta. Otra variable que podría influir en los resultados es el volumen de tampón de lisis utilizado para disociar los cortes de tejido. La masa de tejido absoluta utilizado dependerá de la región de interés está investigando, y likely requerir más o menos tampón de lisis con el fin de lograr la solubilización completa de tejido. Como tal, las concentraciones finales de proteína lisado también pueden variar a través de las regiones del cerebro. Por lo tanto, condiciones de lisis deben ser determinadas empíricamente para una determinada región del cerebro y mantienen constantes entre experimentos independientes.
En resumen, ofrecemos un protocolo detallado para medir el tráfico neuronal proteína en las neuronas adultas usando rebanadas del cerebro ex vivo agudas. La utilización de este enfoque es probable que lleve a una comprensión más profunda de los mecanismos de tráfico endocítica que subyacen la función neuronal.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros que estén en conflicto con esta obra.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones DA15169 y DA035224 en HEM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and reused |
References
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