Brain Slice Biotinylering: An<em> Ex vivo</em> Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller
Summary
Neuronal membran människohandel kontrollerar dynamiskt plasmamembranprotein tillgänglighet och kraftigt påverkan neurotransmission. Hittills har det varit en utmaning att mäta neuronal endocytic handel med vuxna nervceller. Här beskriver vi en mycket effektiv, kvantitativ metod för att mäta snabba förändringar i ytprotein uttryck ex vivo i akuta hjärnsnitt.
Abstract
Reglerad endocytic människohandel är den centrala mekanismen underlätta en mängd olika neuromodulatory händelser, genom att dynamiskt styra receptor, jonkanal och transportör cellytan presentation på en minuters tidsskala. Det finns en bred mångfald av mekanismer som styr endocytic handel med enskilda proteiner. Studier som undersöker de molekylära grunderna för människohandel har i första hand åberopas ytan biotinyleringen att kvantitativt mäta förändringar i membranprotein yta uttryck som svar på exogena stimuli och genmanipulation. Dock har denna metod varit huvudsakligen begränsad till odlade celler, som kanske troget återspeglar de fysiologiskt relevanta mekanismer som spelar in i vuxen nervceller. Dessutom kan odlade cell metoder underskattar regionspecifika skillnader i människohandel mekanismer. Här beskriver vi en strategi som sträcker sig cellytan biotinyleringen till den akuta hjärn skiva beredning. Vivisa att denna metod ger en hifi-metod för att mäta snabba förändringar i membranprotein yta nivåer hos vuxna nervceller. Denna strategi kommer sannolikt att ha en bred användbarhet inom neuronal endocytic människohandel.
Introduction
Endocytic människohandel är en allestädes närvarande cellulär mekanism som finjusterar plasmamembranet presentera en mängd olika integrerade membranproteiner. Endocytos levererar viktiga näringsämnen till den intracellulära miljön 1 och desensitizes receptor signalering som svar på receptoraktivering 2. Endocytic återvinning tillbaka till plasmamembranet kan dessutom öka cellulär signalering genom att öka proteinexpressionsnivåer på cellytan 3. Dessutom är membran människohandel störningar inblandad i många sjukdomar och patologiska förhållanden 4,5 och betonade behovet av att undersöka de molekylära mekanismer som styr protein endocytic trafficking. Medan många proteiner använder klassiska clathrin beroende internamekanismer, monterings bevis under de senaste åren visar att flera clathrin oberoende endocytiska mekanismer styr endocytic potentialen i ett ökat utbud avproteiner 6,7. Därmed har behovet av att utreda endocytiska mekanismer som underlättar handel med fysiologiska relevanta system ökat avsevärt.
I hjärnan har endocytic handel med receptorer, jonkanaler och signalsubstanstransportörer en primär roll i upprättandet av synaptisk plasticitet 8-11 och reaktion på droger av missbruk 12-15, i slutändan påverkar neuronala retbarhet och synaptiska svar. Hittills har merparten av neuronala studier människohandel är beroende antingen heterologa expressionssystem eller odlade primära nervceller, varav ingen får en tillförlitlig bild mekanismer som spelar in i vuxen nervceller. Här rapporterar vi en metod som använder ytan biotinyleringen att kvantitativt mäta ytan proteinnivåer i akut hjärnan skivor som härrör från vuxna gnagare. Med hjälp av denna metod, presenterar vi uppgifter som visar att musen striatal dopamin transportören internaliserar snabbt i rerespons till forbolester-medierad proteinkinas C (PKC)-aktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots mångåriga kunskap som endocytic handel kritiskt effekter synaptisk signalering i hjärnan, har det visat sig svårt att kvantitativt mäta förändringar i proteinytan uttryck hos vuxna nervceller. I detta arbete, rapporterar vi en tillförlitlig metod för att märka ytprotein ex vivo i akut hjärnan skivor. Brain skiva förberedelser har en lång historia av verktyg för elektrofysiologiska inspelningar, eftersom de upprätthåller synapsförbindelser och cellviabilitet upp till timmar efter beredning…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av NIH bidrag DA15169 och DA035224 till HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
