Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

الدماغ شريحة Biotinylation: و doi: 10.3791/51240 Published: April 3, 2014

Summary

الاتجار غشاء الخلايا العصبية تسيطر بشكل حيوي غشاء البلازما توافر البروتين والآثار بشكل كبير العصبي. حتى الآن، فقد كان تحدي لقياس الاتجار التقامي العصبية في الخلايا العصبية الكبار. هنا، نحن تصف أو أسلوب الكمي فعالة للغاية لقياس التغيرات السريعة في سطح بروتين تعبير فيفو السابقين في شرائح الدماغ الحادة.

Abstract

الاتجار التقامي ينظم هو الآلية المركزية تسهيل مجموعة متنوعة من الأحداث neuromodulatory، من خلال السيطرة على مستقبلات حيوي، القناة الايونية، ونقل الخلايا السطحية العرض على نطاق والوقت دقيقة. هناك تنوع واسع من الآليات التي تتحكم في الاتجار التقامي من البروتينات الفردية. وقد اعتمدت الدراسات التحقيق في الأسس الجزيئية للاتجار في المقام الأول على سطح biotinylation لقياس كميا التغيرات في غشاء البروتين التعبير سطح استجابة للمؤثرات الخارجية والتلاعب الجيني. ومع ذلك، فقد تم هذا النهج تقتصر أساسا على الخلايا المستزرعة، والتي قد لا تعكس بأمانة الآليات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في اللعب في الخلايا العصبية الكبار. وعلاوة على ذلك، قد نهج خلايا مستنبتة نقلل الاختلافات الخاصة بكل منطقة في آليات الاتجار. هنا، نحن تصف النهج الذي يمتد biotinylation سطح الخلية إلى إعداد شريحة حاد في الدماغ. نحنإثبات أن هذا الأسلوب يوفر نهجا عالية الدقة لقياس التغيرات السريعة في مستويات سطح بروتين الغشاء في الخلايا العصبية الكبار. هذا النهج من المرجح أن يكون أداة واسعة في مجال الاتجار التقامي العصبية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الاتجار التقامي هو آلية الخلوية في كل مكان أن غرامة الإيقاعات العرض غشاء البلازما من مجموعة متنوعة من البروتينات الغشاء لا يتجزأ. الإلتقام يسلم المواد الغذائية الحيوية إلى الخلايا الوسط 1 وتبلد مستقبلات الإشارات ردا على تنشيط مستقبلات 2. يمكن إعادة تدوير التقامي العودة إلى غشاء البلازما بالإضافة إلى تعزيز الإشارات الخلوية من خلال زيادة مستويات البروتين التعبير على سطح الخلية 3. علاوة على ذلك، وتورط الاضطرابات الاتجار الغشاء في العديد من الأمراض والحالات المرضية 4،5، مشددا على ضرورة التحقيق في الآليات الجزيئية التي تتحكم البروتين الاتجار التقامي. بينما العديد من البروتينات الاستفادة من آليات استيعاب الكلاسيكية التي تعتمد على بالكلاذرين، أدلة متزايدة على مدى السنوات القليلة الماضية يدل على أن آليات بالكلاذرين مستقلة متعددة التقامي تحكم المحتملة التقامي من مجموعة متزايدة منالبروتينات 6،7. وبالتالي، نمت الحاجة إلى آليات التحقيق التقامي تسهيل الاتجار في النظم الفسيولوجية ذات الصلة إلى حد كبير.

في الدماغ، والاتجار التقامي من المستقبلات، وقنوات ايون والنقل العصبي له دور أساسي في إنشاء اللدونة متشابك 8-11 وردا على تعاطي المخدرات 12-15، مما يؤثر في النهاية استثارة الخلايا العصبية واستجابات متشابك. حتى الآن معظم الدراسات الاتجار العصبية تعتمد على إما أنظمة تعبير مغايرة أو الخلايا العصبية الأولية مثقف، لا هذا ولا ذاك والتي قد تعكس بشكل موثوق آليات في اللعب في الخلايا العصبية الكبار. هنا، ونحن التقرير النهج الذي يستخدم سطح biotinylation لقياس كميا مستويات البروتين السطح في شرائح الدماغ الحادة المستمدة من القوارض الكبار. باستخدام هذا النهج، فإننا نقدم البيانات التي تثبت أن نقل الدوبامين الجسم المخطط الماوس internalizes بسرعة في إعادةsponse بأن phorbol بوساطة استر بروتين كيناز C (PKC) التنشيط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم تنفيذ جميع التعامل مع الحيوانات وحصاد الأنسجة وفقا للمبادئ التوجيهية للجامعة ماساتشوستس كلية الطب جنة استخدام المؤسسية رعاية الحيوان (IACUC)، وبعد الموافقة على بروتوكول # A1506 (Melikian، PI).

الحلول المطلوبة

السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) - جعل الطازجة يوميا

125 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 1.2 ملي ناه 2 ص 1.2 ملم MgCl 2.4 مم CaCl 26 مم 3 NaHCO، و 11 ملي الجلوكوز

ملاحظة: إعداد ACSF كحل الأسهم 10X، باستثناء NaHCO 3 و الجلوكوز. جعل الحلول 1X العمل يوميا من المخزون 10X، المكمل مع الطازجة NaHCO 3 و الجلوكوز.

تستكمل السكروز ACSF (SACSF) - جعل الطازجة يوميا

250 ملي يمثوارتفع، 2.5 ملي بوكل، 1.2 ملي ناه 2 ص 1.2 ملم MgCl 2.4 مم CaCl 26 مم 3 NaHCO، و 11 ملي الجلوكوز

ملاحظة: إعداد SACSF كحل الأسهم 10X، باستثناء NaHCO 3 و الجلوكوز. جعل الحلول 1X العمل يوميا من المخزون 10X، المكمل مع الطازجة NaHCO 3 و الجلوكوز.

سلفو-N-hydroxysuccinyl-SS-البيوتين (سلفو-NHS-SS-البيوتين، الشركة الكيميائية بيرس)

وينبغي أن تكون الحلول الأسهم 200 ملغ / مل في DMSO ومقاومة لعدة دورات تجميد / الذوبان. يتم تخزين aliquots في -20 درجة مئوية. وتحلل استر succinyl بسرعة في محلول مائي، لذلك ينبغي إعداد حلول العمل على الفور قبل التقدم بطلب إلى شرائح.

شريحة تطفئوا الحل

ACSF تستكمل مع 100 ملي جليكاين

RIPA تحلل العازلهص

10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.0 ملي EDTA، 1٪ تريتون-X-100، 0.1٪ SDS، 1٪ نا deoxycholate

RIPA مع مثبطات البروتياز (RIPA / PI) - جعل الطازجة يوميا

تستكمل RIPA مع 1 ميكرومتر leupeptin، 1 ميكرومتر pepstatin، 1 ميكرومتر أبروتينين، و1 ملم phenylmethyl السلفونيل الفلورايد.

1. إعداد شرائح الدماغ

  1. جعل 1X الطازجة SACSF و 1X ACSF
  2. هدئ SACSF على الجليد في كوب صغير. وسوف تستخدم هذه لعقد مخ الفأر المقطوع حديثا.
  3. تشبع ACSF وSACSF مع الأوكسجين من قبل محتدما مع 95٪ / 5٪ O 2 / CO 20 دقيقة على الجليد.
  4. وينبغي أن تستخدم P30-38 الفئران للبقاء الأنسجة الأمثل. التضحية الحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم وقطع الرأس، وبسرعة إزالة العقول في prechilled، SACSF الاوكسيجين.
  5. باستخدام مشراح تهتز، وجعل 300 ميكرون أقسام الدماغ في المنطقة ذات الاهتمام.
  6. إذا رغبت في ذلك، وشرائح يمكن تشريح مزيد من قبل الاستعادة لإثراء لمناطق الدماغ معينة أو الحق منفصلة وتركت نصفي الكرة الأرضية لاستخدام الرقابة وشرائح التجريبية، على التوالي.
  7. باستخدام ماصة باستير النار مصقول، ونقل شرائح إلى شبكة القاع، غرف تعيين في 24 لوحات جيدة.
  8. تسمح شرائح لاسترداد لمدة 40 دقيقة، 31 درجة مئوية في ACSF الاوكسيجين، مع المستمر، محتدما لطيف.

2. علاج المخدرات (إذا كان ذلك مناسبا) وشريحة Biotinylation

  1. بعد الانتعاش، وغسل 3X شرائح في prewarmed (37 درجة مئوية)، الاوكسيجين ACSF محتدما باستمرار مع 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2.
  2. إضافة مركبات اختبار واحتضان مع الأوكسجين المستمر.
    1. للراحة، إضافة حجم ال 1/10 من 10X المخدرات المركزة، وتخلط بواسطة قلب بلطف.
    2. يهز بلطف لوحات في حمام مائي عند درجة الحرارة المطلوبة.
  3. بعد العلاج من تعاطي المخدرات، بسرعةشرائح البرد عن طريق غسل 3X في ACSF الباردة الجليد.

3. البروتينات السطحية Biotinylate

  1. إعداد 1.0 ملغ / مل سلفو-NHS-SS-البيوتين في ACSF الباردة الجليد مباشرة قبل وضع العلامات.
  2. إضافة 0.75 مل سلفو-NHS-SS-البيوتين إلى شرائح واحتضان شرائح على الجليد، 45 دقيقة.
  3. تغسل شرائح ثلاث مرات بسرعة مع الثلج الباردة ACSF، ثم احتضان لمدة 10 دقيقة في ACSF الباردة الجليد على الجليد.
  4. تغسل شرائح ثلاث مرات مع الثلج الباردة العازلة شريحة إخماد واحتضان مع 0.75 مل شريحة عازلة إخماد مرتين، 25 دقيقة، على الجليد لإرواء الحرة سلفو-NHS-SS-البيوتين.

4. إعداد الأنسجة لست]

  1. تغسل شرائح ثلاث مرات في ACSF الباردة الجليد ونقل كل شريحة إلى أنبوب microcentrifuge باستخدام باستور ماصة مصقول النار.
  2. بيليه بلطف شريحة بواسطة الطرد المركزي 200 x ج، 1 دقيقة وبعناية المتبقية نضح ACSF.
  3. إضافة 400 ميكرولتر الجليد الباردة RIPA / PI وتفتيت الأنسجة بواسطة pipetting صعودا وهبوطا مرة واحدة من خلال نقطة P200ETTE.
  4. نقل فصلها شريحة / RIPA إلى أنبوب جديد واحتضان 30 دقيقة، 4 درجات مئوية، بالتناوب، لاستكمال تحلل.
  5. بيليه الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي، 18،000 x ج، 15 دقيقة، 4 درجات مئوية.
  6. تحديد تركيزات البروتين المحللة باستخدام فحص البروتين BCA، مع ألبومين المصل البقري (BSA) كمعيار.

5. عزل البروتينات البيروكسيديز

  1. تحسين الخرزة / إجمالي نسبة البروتين.
    ملاحظة: يمكن لمستويات البروتين التعبير الفردية تختلف على نطاق واسع في جميع أنحاء مناطق الدماغ المختلفة. ما لم يتم القبض على كل من البروتين البيروكسيديز في كمية معينة من الأنسجة المحللة، فإنه ليس من الممكن الكشف بدقة أي تغييرات محتملة في التعبير السطح. وبالتالي، لا بد من تحديد تجريبيا الأمثل حبة / إجمالي نسبة البروتين عن معين البروتين المنطقة / الدماغ قبل الإقدام على دراسة شريحة biotinylation جديدة.
    1. احتضان 25 ميكرولتر streptavidin الخرز الاغاروز مع كمية متزايدةق من الأنسجة المحللة (المدى التقريبي 25-200 ميكروغرام)، ومن ثم المضي قدما كما هو موضح أدناه للربط، وغسل وشطف الخطوات.
    2. تحديد نطاقات مناعيا الناتجة عنها، واختيار نسبة حبة / المحللة في مجموعة خطية ملزمة من شأنها أن تسمح الكمي دقيقة إما زيادة أو نقصان البروتين التعبير السطح.
  2. إعداد الخرز Streptavidin-الاغاروز
    1. تحديد إجمالي حجم حبة اللازمة لجميع العينات. إعداد حجم حبة كافية لهذا المبلغ زائد إضافي (أي 4 عينات واحد على 25 ميكرولتر / عينة = 100 حبات ميكرولتر + واحد = 125 حبات اضافية ميكرولتر.
    2. دوامة Streptavidin الأسهم حبة وماصة للخروج المطلوب الحجم. إذا باستخدام ماصة P200، وقطع نهاية طرف لمنع انسداد أو حبة الضرر.
    3. تغسل حبات 3 مرات في 0.5-1.0 مل RIPA / PI لإزالة المواد الحافظة، وبعد كل إضافة vortexing لRIPA وجمع حبات بين يغسل بواسطة الطرد المركزي 18،000 x ج، 1 دقيقة، في غرفة نخففature.
    4. نضح قبالة عازلة بين يغسل باستخدام ماصة باستير الزجاج تعلق على قارورة فراغ. A P200 غيض من البلاستيك تعلق على نهاية ماصة باستير الزجاج يوفر تحكم أكثر دقة عند الشفط. فإنه ليس من الضروري لإزالة تماما عن المخزن المؤقت ليغسل الأولين، لأنه يخاطر الخرز الشفط إلى ماصة. بعد غسل النهائي، وإزالة أكبر قدر ممكن عازلة الزائدة دون الشفط الخرز.
    5. إضافة RIPA / PI لتقديم حبات مرة أخرى إلى حجمها الأصلي، pipetting صعودا وهبوطا ل resuspend. تجنب vortexing لفي هذه المرحلة، والخرز سوف تتمسك جدار الأنبوب.
    6. قطع الخرز قسامة في أنابيب microcentrifuge باستخدام P200 مع طرف خارج. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات بين العينات لضمان بقاء حبات علقت بالتساوي وفرقت بين الأنابيب.
  3. البروتينات البيروكسيديز ربط لstreptavidin الخرز
    1. توزيع لست] الخلية إلى الأنابيب التي تحتوي على حبات الاغاروز. للتجارب عرج إعادة عينات متعددة يجري مقارنة، للتأكد من استخدام نفس كمية البروتين لكل عينة لإجراء مقارنات دقيقة.
    2. إضافة إضافية RIPA / PI لجلب لعينات إلى الحد الأدنى من 200 ميكرولتر حجم. هذا يؤكد أن العينات سوف مزيج كاف أثناء الحضانة، وكذلك يوحد تركيزات البروتين في عينات.
    3. وضع الأنابيب في محور دوار أنبوب وتخلط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. في أنابيب منفصلة، ​​موزعة ما يعادل حجم المحللة الكلية المستخدمة لكل عينة. بدلا من ذلك، إذا كان حجم العينة مرتفعة، جزء من اجمالي حجم المحللة يمكن حجز بدلا من ذلك، لاستيعاب كميات الحمولة القصوى على المواد الهلامية SDS-PAGE. وسوف تستخدم هذه لتطبيع التعبير السطح لمجموع كمية البروتين.
    5. إضافة إما حجم مساو من 2X أو 1/5 حجم 6X SDS-PAGE العازلة عينة وإما احتضان عند 4 درجات مئوية، بالتوازي مع عينات حبة، أو تخزينها في -20 درجة مئوية حتى يتم تحليل العينات.
ove_title "> 6. أزل وتحليل عينات

  1. بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي 18،000 x ج، 2 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.
  2. طاف نضح ويغسل حبات ثلاث مرات مع 0.75 مل RIPA. لتقليل الخسائر حبة، وترك حجم رأس صغير من العازلة أعلاه الخرز بين يغسل. بعد غسل النهائي، وإزالة أكبر قدر ممكن RIPA، دون الإخلال بيليه حبة.
  3. أزل البروتينات البيروكسيديز من الخرز streptavidin عن طريق الحد من الربط ثاني كبريتيد. إضافة 25 ميكرولتر 2X SDS-PAGE الحد من عينة العازلة، دوامة جيدا وتدوير عينات 30 دقيقة، درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: كثير من البروتينات الغشاء لديهم ميل عالية لتجميع عند المغلي SDS-PAGE عينة العازلة، عرقلة حركتهم كثيرا الكهربي. إذا كان هذا هو الحال بالنسبة للبروتين يجري التحقيق، وتجنب عينات التدفئة و، بدلا من ذلك، أزل ببطء في درجة حرارة الغرفة. إذا المغلي أمر ضروري للغاية (على سبيل المثال إذا بروتين آخر تقييم بالتوازي يتطلب الغليان)، samplويمكن استكمال عازلة ه مع 2 M اليوريا (تركيز النهائي) لتقليل التجميع. في حين فعالة في الحد من التجميع في بعض الحالات، وغالبا ما يهدد اليوريا مظاهر الفرقة.
  4. تحليل العينات بواسطة طخة مناعية.
  5. ذوبان الجليد مجموع العينات المحللة وتدوير بالتوازي مع عينات حبة، 30 دقيقة، درجة حرارة الغرفة.
  6. البروتينات منفصلة على المواد الهلامية SDS-PAGE.
  7. تحديد بروتين (ق) من الفائدة بمقدار immunoblotting.
    1. تكون على يقين من أن يتم الكشف عن العصابات في مجموعة خطية من الكشف عن الكمي السليم.
    2. لضمان أن كاشف biotinylation لم تمكنت من الوصول إلى داخل الخلايا البروتينات عبر الخلايا التالفة / خطر. هو أفضل إنجاز ذلك عن طريق immunoblotting بشكل متواز لبروتين داخل الخلايا محددة إلى نوع من الخلايا التي يجري التحقيق فيها.
    3. قياس كثافة الفرقة وحساب نسبة البروتين الكثافة السطحية كنسبة مئوية من إجمالي مستوى البروتين التعبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

والمنضوية نقل الدوبامين العصبية في استجابة لتفعيل PKC في خطوط الخلايا 16-20. على الرغم من العديد من التقارير التي تبين الخسائر سطح DAT بي كي سي التي يسببها في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا والنظم التعبير، فقد كان تحدي لتأكيد هذه النتيجة في الخلايا العصبية الدوبامين مثقف 21-23. استخدمنا شرائح الجسم المخطط الماوس لاختبار ما إذا كانت مباشرة DAT internalizes استجابة لتفعيل PKC في الخلايا العصبية الدوبامين الكبار. إعداد شريحة التالية، تم hemisected شرائح على طول خط الوسط وشرائح من طائرات مماثلة وعولج ± 1 ميكرومتر phorbol ميريستات-13 خلات (سلطة النقد الفلسطينية) لمدة 30 دقيقة، 37 درجة مئوية. كانت شرائح المبردة بسرعة والمعقدة البيروكسيديز والبروتينات السطحية ومعزولة كما هو موضح في البروتوكول. كما تم بحث Immunoblots لDAT، وأيضا لهيدروكسيلاز التيروزين (TH)، في موازاة ذلك، لقياس ما إذا كان كاشف biotinylation اكتسبت أي وصول الخلايا في الخلايا العصبية الدوبامين. كما رأينا فيالشكل 1 (الأعلى)، اكتشفنا قوية DAT التعبير سطح الماوس في المخطط تحت الظروف القاعدية (المعالجة السيارة)، مع 81.4 ± 5.8٪ من إجمالي DAT على سطح الخلية. تفعيل PKC مع 1 ميكرومتر سلطة النقد الفلسطينية، 30 دقيقة، 37 ° C انخفضت بشكل ملحوظ DAT التعبير السطح إلى 60.8 ± 5.2٪ مجموع DAT، والتي تتطابق إلى ~ خسارة 30٪ من DAT من غشاء البلازما. في المقابل، كان المعقدة البيروكسيديز ± 1.6٪ فقط من إجمالي 0.4 TH (الشكل 1، أسفل)، بما يتفق مع التعريب في داخل الخلايا ومؤكدا أن كاشف biotinylation استبعد من الداخل خلية من الخلايا العصبية الدوبامين.

الشكل 1
الشكل 1. تفعيل PKC الحادة يقلل مستويات الدوبامين في الخلايا العصبية نقل سطح الجسم المخطط الكبار. ماوس الجسم المخطط شريحة البيوتينylation. تم إعداد شرائح مخططي الحاد الماوس كما هو موضح في البروتوكول ويعاملون ± 1 ميكرومتر سلطة النقد الفلسطينية، 30 دقيقة، 37 درجة مئوية. وإلى جانب البروتينات السطحية تساهميا لالبيوتين وكانت معزولة من قبل streptavidin دفعة اللوني. خضع عينات SDS-PAGE وimmunoblotting مع الفئران مكافحة DAT والفأر الأجسام المضادة للTH. تم القبض على عصابات مناعيا مع كاميرا CCD محطة VersaDoc التصوير وكثافة من عصابات nonsaturating وكميا باستخدام الكمية احد البرامج. أعلى: طخة مناعية الممثل عرض البيروكسيديز ومجموع DAT وTH التالية العلاجات المشار إليها. القاع: متوسط ​​البيانات. أعرب البيروكسيديز إشارة البروتين كما البروتين الكلي٪ ± SEM * تختلف اختلافا كبيرا عن السيطرة، ر اختبار الطالب، ف <0.03، ن = 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

على الرغم من المعرفة منذ وقت طويل أن الاتجار التقامي خطيرة الآثار إشارات متشابك في الدماغ، وقد ثبت صعوبة في قياس كميا التغيرات في تعبير البروتين في الخلايا العصبية سطح الكبار. في هذا العمل، ونحن التقرير نهجا يمكن الاعتماد عليها لتسمية بروتين السطح فيفو السابقين في شرائح الدماغ الحادة. الاستعدادات شريحة الدماغ لديهم تاريخ طويل من فائدة لالتسجيلات الكهربية، كما الحفاظ على اتصالات متشابك وبقاء الخلية تصل إلى ساعة بعد إعدادها. علاوة على ذلك، استراتيجيات تشريح يمكن أن يكون الأمثل للحفاظ على اتصالات متشابك محددة بين مناطق الدماغ المختلفة من الفائدة.

الكثير من العمل قبل التحقيق الاتجار العصبية البروتين في الاستعدادات المستمدة من الدماغ قد يتوقف في المقام الأول على synaptosomes والخلايا العصبية مثقف الابتدائي. الأسلوب الحاد نهج biotinylation شريحة تفتخر العديد من المزايا سواء من الجنوب شرقي: يتم إزالة synaptosomes جسديا من محور عصبي وربما لا تحتوي على العوامل الجزيئية اللازمة لألخص بأمانة سليمة الاتجار العصبية البروتين. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما الملوثة الاستعدادات synaptosomal مع شظايا الغشاء الذي قد تحرف النتائج التجريبية. وعادة ما تكون مستمدة من الثقافات العصبية الأولية من الخلايا العصبية غير ناضجة تنمويا التي قد لا تكون متباينة بشكل مناسب في الظواهر العصبية الناضجة التي تعبر عن آليات الاتجار خلية محددة. في المقابل، شرائح الحادة يحمل درجة عالية من بقاء الخلية، والمستمدة من الحيوانات البالغة. علاوة على ذلك، يمكن مقارنة الاتجار سطح التالية في الجسم الحي التلاعب الجزيئية، مثل الجينات التسليم / ضربة قاضية، optogenetic العصبية التحفيز / كبت، أو التالية في العلاج بالعقاقير الجسم الحي أو التكيف السلوكي.

على الرغم من أن هناك العديد من المزايا إلى فيفو السابقين قالمقاربة، وهناك العديد من القيود أيضا. الحاد (noncultured) شرائح الدماغ لديهم صلاحية محدودة، وبالتالي فهي لا تصلح لعلاج المخدرات المزمن. وعلاوة على ذلك، لاحظنا أنها لا تزال قابلة للحياة خلال تجارب التحول في درجة الحرارة، حيث يتم برود بسرعة شرائح وrewarmed. علاوة على ذلك، شرائح هي الأكثر قدرة على البقاء عندما أعدت من الفئران P21-P35، ويحتمل أن تحد من مقدار الوقت الذي في الجسم الحي العلاجات يمكن القيام بها قبل إجراء التجارب. في الواقع، وذلك باستخدام محلول السكروز القطع العالية، نجد أن الاتجار DAT لوحظ أقل بتكاثر في إعداد شرائح من الفئران P35-P42 (جبريل وMelikian، بيانات غير منشورة). ومع ذلك، نلاحظ تحسنا ملحوظا الجدوى شريحة في الحيوانات الأكبر سنا باستخدام إعداد شريحة تعديل كما وصفها تشاو وآخرون 24 وهذا النهج هو بديل ممتاز حيث تتطلب المعايير المنهجية باستخدام الحيوانات الأكبر سنا (أي. تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقالية التاليةلها الفيروسي بوساطة التعبير البروتين / RNA، وإنشاء السلوكيات، أو مزمنة في الجسم الحي العلاجات المخدرات).

هناك العديد من العوامل التقنية الإضافية التي قد تؤثر على نتائج تجريبية. لا بد من تحديد تجريبيا الأمثل حبة / إجمالي نسبة البروتين اللازمة للقبض على كل من البروتين البيروكسيديز في كمية معينة من البروتين الكلي المحللة قبل محاولة التجارب الكمي. هذه المسألة كثيرا ما يغفل، ولكن يمكن أن يكون عاملا حاسما في القدرة على اكتشاف التغيرات في تعبير البروتين السطح. إذا لم يتم استرداد كل من البروتين البيروكسيديز كميا، والتغيرات في مستويات سطح تكون إما غير قابلة للكشف أو قياس غير دقيق. متغير آخر يمكن أن تؤثر نتائج هو حجم تحلل العازلة المستخدمة لفصل شرائح الأنسجة. سوف كتلة الأنسجة المطلقة المستخدمة تعتمد على المنطقة من اهتمام يجري التحقيق فيها، وسوف likelذ تتطلب أكثر أو أقل العازلة تحلل من أجل تحقيق كامل الانحلالية الأنسجة. على هذا النحو، قد تركيزات البروتين المحللة النهائية تختلف أيضا عبر مناطق الدماغ. لذلك، ينبغي أن تحدد الظروف تحلل تجريبيا لمنطقة الدماغ معين، وتبقى ثابتة بين تجارب مستقلة.

باختصار، نحن نقدم بروتوكول مفصلة لقياس البروتين في الخلايا العصبية الاتجار الخلايا العصبية الكبار باستخدام شرائح الدماغ فيفو السابقين الحادة. استخدام هذا النهج من شأنه أن يؤدي إلى فهم آليات الاتجار التقامي التي تكمن وراء وظيفة الخلايا العصبية أكثر تعمقا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتعارض مع هذا العمل.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DA15169 وDA035224 إلى HEM

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sulfo NHS-SS-biotin Pierce 21331
Streptavidin agarose Pierce 20347
IgG-free, Protease-free bovine serum albumin Sigma A3059
Vibrating microtome sectioner various
Shaking water bath various
Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) Millipore PI8P 012 50 These can be washed by hand and reused

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
  2. Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
  3. Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
  4. Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
  5. Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. 127-141 (2012).
  6. Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
  7. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
  8. Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
  9. Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
  10. Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
  11. Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
  12. Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
  13. Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
  14. Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
  15. Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
  16. Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
  17. Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
  18. Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
  19. Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
  20. Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
  21. Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
  22. Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
  23. Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons. J. Vis. Exp. (86), e51240, doi:10.3791/51240 (2014).More

Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons. J. Vis. Exp. (86), e51240, doi:10.3791/51240 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter