Summary

相关的mRNA分离与酵母线粒体研究本地化翻译的机制

Published: March 14, 2014
doi:

Summary

编码线粒体蛋白质多的mRNA与线粒体外膜有关。我们描述了亚细胞分离过程,旨在酵母线粒体与它相关的基因和核糖体的隔离。这个协议可以被应用到不同的条件下生长的细胞,以揭示mRNA定位的机制,并靠近线粒体本地化的翻译。

Abstract

大多数线粒体蛋白质编码的细胞核和需要被导入到细胞器。而蛋白质在接近线粒体合成的,可能会出现导入。支持这种可能性是从最近的研究,在其中有许多mRNA的编码线粒体蛋白质被证明是定位于线粒体附近而得。连同早前与外膜核糖体协会的示威活动,这些结果表明本地化的翻译过程。这种本地化的翻译可能会提高进口效率,提供了独特的调控位点,并尽量减少异位表达的情况下。多种方法已被用于表征介导的本地化翻译的因素和因素。在这些标准是亚细胞分级差速离心。这个协议在单个程序的mRNA,核糖​​体和蛋白质的分离的优点。然后这些可以表征通过各种分子和双辉化工方法。此外,转录组学和蛋白质组学的方法可以应用到所得到的材料,从而使基因组范围的见解。酵母的利用率作为模式生物对这些研究具有速度快,成本和简单性的优点。此外,先进的基因工具和可用的缺失株便于核实候选人的因素。

Introduction

真核细胞被组织在具有特定功能的不同的隔间。为了实现它的功能,每个隔间中包含了一套独特的蛋白质,是其活性所必需的。通过这些蛋白质接近他们的隔间一种可能的机制是通过本地化翻译1,2。在这个过程中,蛋白质是由核糖体和mRNA的是位于那里合成了其目的地。其中本地化翻译的可能优点是增加蛋白质定位的效率,减少需要的蛋白质分子伴侣,并使特定地点的调节机制。另外,局部的mRNA和核糖体可以是机器翻译的一个僻静的水库在细胞应激,当一般翻译被抑制的案件。

线粒体在最近几年成为研究的本地化翻译中心模型。大多数线粒体蛋白质编码在细胞核中,翻译在胞质溶胶中,并导入到细胞器。各行的证据表明,许多这些蛋白质是通过一个本地翻译过程中产生的。最初,电子显微镜和生物化学分馏研究发现线粒体3-5相关核糖体。这些研究的地方,然后通过特定的mRNA,被发现要导入只在共翻译方式6,7的工作证实在体内 。与线粒体的mRNA关联的全基因组的研究显示,mRNAs的一个显著馏分被定位于线粒体附近8-10。一些这些mRNA的进一步特征在于在体内荧光的方法,如鱼或MTAG 9,11。该协会的一个直接的解释是,这些mRNA作为本地化翻译的模板。

由这些mRNA接近线粒体的机制是未知的。非编码区域(最significantly 3的'非编码区)被证明是参与mRNA联想到线粒体12。这些领域有可能成为一个结合位点的RNA结合蛋白介导的运输。研究表明酵母,蛋白质的PUM系列(Puf3)的成员支持与线粒体8,13 mRNA的关联。对于Puf3,这是基于对其他家庭成员函数的一个似是而非的作用,是抑制翻译而表达的是途中 14。因此,可能的mRNA在非翻译状态被输送,由与非编码区相互作用的RNA结合蛋白。此外,庞大的身躯的工作表明,当蛋白质被合成的交通工具发生。特别是,翻译抑制剂被证明影响mRNA的结社8,13。此外,翻译等功能的AUG,线粒体定位序列(MTS),或ORF地区被证明,以协助定位8,11,15。热休克蛋白70家族的蛋白质通道aperone和蛋白质受体在线粒体外膜也显示,支持mRNA的关联,进一步暗示编码蛋 ​​白的功能是mRNA定位16重要。这是一个模型,其中核糖体蛋白新兴用作靶向的mRNA-核糖体-蛋白质复合物的线粒体17识别元件是一致的。

附近线粒体本地化翻译,研究了各种方法,包括电子显微镜(可视化核糖体)3,9,绿色的RNA(检测特定mRNA的)11,和生化分馏(检测RNA和核糖体)10,18。而前者的方法检测定位在体内 ,并且可以允许传输动力学的可视化,后者允许检测在单次实验中多个不同的mRNA。此外,用于生化分离的编码或非编码的域不需要是人tered,因此其具体的作用进行评估。生化分馏已成功使用多年,对许多不同的细胞区室的隔离。它的校长和局限性已经非常成熟,并且可以很容易地修改为不同目的的现有协议。必要的仪器在许多实验室的标准,因此它通常是选择的第一个方法用于研究细胞内的定位。我们描述,这对于mRNA的分离优化,而核糖体与线粒体相关的协议。因此,该协议是最佳的学习参与线粒体附近本地化翻译的因素。

Protocol

1。线粒体提纯权衡细胞沉淀。大约0.6克是用100ml的细胞获得。 增长100-150毫升酵母细胞的OD 600 = 1-1.5 30 °C于一个非发酵生长介质中,例如半乳糖基生长培养基中,以富集线粒体。 离心细胞在3000×g离心5分钟,在室温下,弃上清。 用双蒸水,离心再次洗涤沉淀。弃上清。 每0.5 G细胞的悬浮颗粒1毫升缓冲液的DTT。它治疗的细胞与一种…

Representative Results

该协议允许从胞浆成分含有线粒体组分的分离。以测试其成功的最好方法是从不同的隔离措施进行分析,北部和西部的分析( 图1)的样品。三个参数的隔离质量均来自这些分析。首先,无论在样品中的RNA或蛋白是完整的 – 这些将被检测为不同的频带中进行分析。降级事件将导致额外的,更短的波段或污点的外观。其次,从每一步从输入( 即总)的信号进行比较的信号提供了?…

Discussion

在成像技术的进步已经产生了高解析度的工具来研究mRNA的定位。今天,人们可以在毫秒时间尺度23-26测量甚至单个mRNA分子的移动。然而,传统的生化方法,如上面所描述的,也都是有用的资讯和是优选的情况。生化隔离允许的mRNA和蛋白质的大型剧目的净化,因此是最好的全基因组的研究。在单个隔离,可以得到足够的mRNA水平,以允许数以千计的基因的表征,无论是由DNA微阵列或RNA-SEQ <su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢博士。埃雷兹埃利亚胡,丹尼尔·梅拉梅德,Ophry松树和多伦拉帕波特建立这个协议的过程中帮助和意见。这项工作是由ISF(批准号1193至1109年)的资助。

Materials

Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose Do not autoclave Galactose
Growth medium For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M TrisHCl pH9.4
30 mM TrisHCl pH7.6
Dithiothreitol (DTT)
 10 mM DTT Buffer 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2μm filter
Zymolyase Buffer  1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this  buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use
 Zymolyase 20T  20,000 U/gr
Recovery medium Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/mL Heparin
1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8M Guanidinium-HCl
 100% and 70% Ethanol (EtOH)
 3 M Sodium Acetate pH5.2
 10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
 Glycerol
β-mercaptoethanol
Bromophenolblue
 4xLSB 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle

References

  1. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  2. Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
  3. Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
  4. Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
  5. Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
  6. Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
  7. Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
  8. Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
  9. Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
  10. Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
  11. Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
  12. Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
  13. Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
  14. Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
  15. Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
  16. Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
  17. Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
  18. Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
  19. Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
  20. Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
  21. Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
  22. Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
  23. Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
  24. Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
  25. Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
  26. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
  27. Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
  28. Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
  29. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
  30. Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
  31. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
  32. Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. . Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).
  33. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).

Play Video

Cite This Article
Lesnik, C., Arava, Y. Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation. J. Vis. Exp. (85), e51265, doi:10.3791/51265 (2014).

View Video