Summary
编码线粒体蛋白质多的mRNA与线粒体外膜有关。我们描述了亚细胞分离过程，旨在酵母线粒体与它相关的基因和核糖体的隔离。这个协议可以被应用到不同的条件下生长的细胞，以揭示mRNA定位的机制，并靠近线粒体本地化的翻译。
Abstract
大多数线粒体蛋白质编码的细胞核和需要被导入到细胞器。而蛋白质在接近线粒体合成的，可能会出现导入。支持这种可能性是从最近的研究，在其中有许多mRNA的编码线粒体蛋白质被证明是定位于线粒体附近而得。连同早前与外膜核糖体协会的示威活动，这些结果表明本地化的翻译过程。这种本地化的翻译可能会提高进口效率，提供了独特的调控位点，并尽量减少异位表达的情况下。多种方法已被用于表征介导的本地化翻译的因素和因素。在这些标准是亚细胞分级差速离心。这个协议在单个程序的mRNA，核糖体和蛋白质的分离的优点。然后这些可以表征通过各种分子和双辉化工方法。此外，转录组学和蛋白质组学的方法可以应用到所得到的材料，从而使基因组范围的见解。酵母的利用率作为模式生物对这些研究具有速度快，成本和简单性的优点。此外，先进的基因工具和可用的缺失株便于核实候选人的因素。
Introduction
真核细胞被组织在具有特定功能的不同的隔间。为了实现它的功能，每个隔间中包含了一套独特的蛋白质，是其活性所必需的。通过这些蛋白质接近他们的隔间一种可能的机制是通过本地化翻译1,2。在这个过程中，蛋白质是由核糖体和mRNA的是位于那里合成了其目的地。其中本地化翻译的可能优点是增加蛋白质定位的效率，减少需要的蛋白质分子伴侣，并使特定地点的调节机制。另外，局部的mRNA和核糖体可以是机器翻译的一个僻静的水库在细胞应激，当一般翻译被抑制的案件。
线粒体在最近几年成为研究的本地化翻译中心模型。大多数线粒体蛋白质编码在细胞核中，翻译在胞质溶胶中，并导入到细胞器。各行的证据表明，许多这些蛋白质是通过一个本地翻译过程中产生的。最初，电子显微镜和生物化学分馏研究发现线粒体3-5相关核糖体。这些研究的地方，然后通过特定的mRNA，被发现要导入只在共翻译方式6,7的工作证实在体内 。与线粒体的mRNA关联的全基因组的研究显示，mRNAs的一个显著馏分被定位于线粒体附近8-10。一些这些mRNA的进一步特征在于在体内荧光的方法，如鱼或MTAG 9,11。该协会的一个直接的解释是，这些mRNA作为本地化翻译的模板。
由这些mRNA接近线粒体的机制是未知的。非编码区域（最significantly 3的'非编码区）被证明是参与mRNA联想到线粒体12。这些领域有可能成为一个结合位点的RNA结合蛋白介导的运输。研究表明酵母，蛋白质的PUM系列（Puf3）的成员支持与线粒体8,13 mRNA的关联。对于Puf3，这是基于对其他家庭成员函数的一个似是而非的作用，是抑制翻译而表达的是途中 14。因此，可能的mRNA在非翻译状态被输送，由与非编码区相互作用的RNA结合蛋白。此外，庞大的身躯的工作表明，当蛋白质被合成的交通工具发生。特别是，翻译抑制剂被证明影响mRNA的结社8,13。此外，翻译等功能的AUG，线粒体定位序列（MTS），或ORF地区被证明，以协助定位8,11,15。热休克蛋白70家族的蛋白质通道aperone和蛋白质受体在线粒体外膜也显示，支持mRNA的关联，进一步暗示编码蛋 白的功能是mRNA定位16重要。这是一个模型，其中核糖体蛋白新兴用作靶向的mRNA-核糖体-蛋白质复合物的线粒体17识别元件是一致的。
附近线粒体本地化翻译，研究了各种方法，包括电子显微镜（可视化核糖体）3，鱼9，绿色的RNA（检测特定mRNA的）11，和生化分馏（检测RNA和核糖体）10,18。而前者的方法检测定位在体内 ，并且可以允许传输动力学的可视化，后者允许检测在单次实验中多个不同的mRNA。此外，用于生化分离的编码或非编码的域不需要是人tered，因此其具体的作用进行评估。生化分馏已成功使用多年，对许多不同的细胞区室的隔离。它的校长和局限性已经非常成熟，并且可以很容易地修改为不同目的的现有协议。必要的仪器在许多实验室的标准，因此它通常是选择的第一个方法用于研究细胞内的定位。我们描述，这对于mRNA的分离优化，而核糖体与线粒体相关的协议。因此，该协议是最佳的学习参与线粒体附近本地化翻译的因素。
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Protocol
1。线粒体提纯
权衡细胞沉淀。大约0.6克是用100ml的细胞获得。
- 增长100-150毫升酵母细胞的OD 600 = 1-1.5 30 °C于一个非发酵生长介质中，例如半乳糖基生长培养基中，以富集线粒体。
- 离心细胞在3000×g离心5分钟，在室温下，弃上清。
- 用双蒸水，离心再次洗涤沉淀。弃上清。
- 每0.5 G细胞的悬浮颗粒1毫升缓冲液的DTT。它治疗的细胞与一种还原剂，以细胞壁内打破二硫键，从而提高水解是重要的。
- 于室温孵育10分钟，在30 °下缓慢摇动。与此同时，重达6毫克酶解酶每克细胞，并暂停其在的Zymolyase缓冲区。
- 离心细胞在3000×g离心5分钟一吨室温，并弃去上清液。
- 每0.15克细胞重悬沉淀于1毫升的Zymolyase缓冲。不要旋涡。
- 测量的细胞在990微升的水将10μl外径600。
- 加的Zymolyase（步骤1.5），以使细胞水解的葡萄糖聚合物的β-1，3 - 葡聚糖的联系，并产生原生质球。从该步骤中，球状体应保持在等渗溶液中，以避免溶解。
- 轻轻摇动孵育细胞15分钟，在30℃（对于酶解酶的最佳活性）。为了验证细胞壁和原生质发生水解，混合10微升的细胞与990微升的水。球状体，预计以裂解由于渗透压差，并且OD 600应至少10倍小于在步骤1.9 中确定的值。如果没有，继续孵育酶解酶的另一个15分钟。
- 离心细胞在3000×g离心5分钟，在室温下进行。仔细存款保险计划卡上清液，作为沉淀可能是不稳定的。
- 同的Zymolyase缓冲液洗涤原生质球，弃上清。
- 重悬原生质球用100毫升恢复介质。转移到球状体的锥瓶中，并孵育1小时，在30 °下振荡。此恢复步骤是必要的，因为在治疗的Zymolyase翻译被逮捕和mRNA的定位被破坏（ 图1B）。
- 添加0.1毫克/毫升CHX和转移球状体到预冷的50ml锥形管中。 CHX除了重要的是要冻结的mRNA与核糖体协会。因此，核糖体依赖的线粒体基因的关联保持不变。
- 离心原生质球在3000×g离心5分钟，在4℃，并弃去上清液。
- 用冷甘露醇缓冲液洗两次。
- 重悬原生质球用4毫升冷甘露醇缓冲液，并将其转移到15毫升容量一个Dounce匀浆配备紧身杵。轻轻挣脱原生质球15招裂解液转移至13 ml管。
- 离心裂解物在1,500×g离心6分钟，在4℃下以沉淀细胞核和完整的细胞。
- 将上清液小心转移到新管中。抛开将1ml样品（25％）为普通肝素样品（“合计”样品）。将50毫升该样品到一个新的管中，加入4倍LSB免疫印迹分析为15毫升。沉淀RNA的“总计”样品的其余部分（见协议3，RNA沉淀）。
- 离心的上清液在10,000×g离心10分钟，在4 °C至颗粒的线粒体。
- 上清液（〜3ml）中转移到一个新的管，并保持它在冰上。这是在“胞质”分数。将50毫升该样品到一个新的管中，加入4倍LSB免疫印迹分析为15毫升。沉淀的RNA从“细胞质”样品的其余部分（见普罗特OCOL 3，RNA沉淀）。
- 用3毫升缓冲液甘露醇和离心再以10000×g在4℃下洗涤沉淀10分钟
- 重悬沉淀用3毫升甘露醇缓冲。此示例包含线粒体，而被称为“线粒体”部分。将50毫升该样品到一个新的管中，加入4倍LSB免疫印迹分析为15毫升。
2。 RNA提取
- 加至8M的盐酸胍盐酸每个样品1卷和2体积的100％乙醇中。振荡后，至少2小时，在-20 °C。
- 离心样品以10,000 xg离心20分钟，在4 °C。弃上清液。要小心，因为小球可能是不稳定的。
- 用70％乙醇洗涤沉淀。
- 重悬沉淀用400毫升的不含RNA酶的水和样品转移到新的Eppendorf管中。
- 通过加入0.1体积的3M钠ACETAT再次沉淀RNAËpH值5.2和两册100％乙醇。振荡后，至少2小时，在-20 °C。
- 离心样品以20,000 xg离心20分钟，在4℃下弃上清，洗用70％乙醇。
- 空气干燥沉淀，重悬用无RNA酶的水。商店的RNA样品在-80 °C。样品可用于Northern分析19或微阵列分析18（参见方案3）。
3。准备RNA的微阵列分析
- 从步骤2.2 650毫升无RNase水重悬mRNA的表达。
- 以除去任何残留的DNA或蛋白质，添加酸性酚等体积（650毫升）：氯仿（5:1，pH值4.7）和涡流大力。以最大速度离心2分钟。
- 转移500毫升上层相（水相）的至新管。避免服用相间，因为它包含的DNA。另外要注意的服用酚，它可以抑制逆转录反应。</ LI>
- RNA样品中含有显著量肝素，这是逆转录酶的强效抑制剂。因此，对于RT-PCR或微阵列标记需要被删除。通过氯化锂沉淀去除肝素：添加氯化锂，以2M的最终浓度，并培育样品过夜，在-20 °C。
- 解冻的样品在4 ℃，离心机以20,000×g离心20分钟，在4℃下
- 小心弃去上清液，并用80％乙醇洗涤沉淀。离心机再次按照步骤3.5中所述。
- 弃去上清液，空气干燥，重悬沉淀在150毫升的不含RNA酶的水。
- 以除去任何残余的LiCl，再沉淀用0.1体积的3M醋酸钠pH值为5.3和3倍体积的100％乙醇。孵育-20 °C至少2小时。
- 离心机的最高速度为20分钟，在4 °C。用80％的乙醇和空气干燥仔细清洗透明颗粒。
- 重悬沉淀用25ml不含RNA酶的水，并保持样品在-80 °C。
- 按照步骤18,20中描述的RNA标记和杂交。
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Representative Results
该协议允许从胞浆成分含有线粒体组分的分离。以测试其成功的最好方法是从不同的隔离措施进行分析，北部和西部的分析（ 图1）的样品。三个参数的隔离质量均来自这些分析。首先，无论在样品中的RNA或蛋白是完整的 - 这些将被检测为不同的频带中进行分析。降级事件将导致额外的，更短的波段或污点的外观。其次，从每一步从输入（ 即总）的信号进行比较的信号提供了有关准备过程中损失的重要信息。严重亏损将被观察的总和信号的相对量之间的显著差异。最后，也是最重要的，线粒体和胞液组分间的分离的质量可以被确定。完整mitochondri隔离一个将导致信号仅在线粒体级分，而不是在细胞质部分（ 图1A）线粒体的转录的转录。此外，那些线粒体相关蛋白会出现由免疫印迹仅在线粒体级分，并在细胞质部分（ 图1B）胞质蛋白。
图1显示了两个附加的成果，是标准的此协议：第一，核编码的mRNA与线粒体基因的关联之间变化。人们可以看到，ACO1的mRNA，其编码的线粒体蛋白质，大多出现在线粒体级分，而mRNA的编码细胞质肌动蛋白（ACT1）是主要在胞质部分（ 图1C）。全基因组分析中许多基因8,10,21,22和依据，这种多样性中透露的变化是根据广泛的研究。二，显著金额ER相关本草的升被coisolated在线粒体级分。 mRNA的编码SEC61，这是ER-相关的，通过Northern印迹（ 图1A）检测和ER-膜蛋白CUE1通过蛋白印迹分析（ 图1B）进行检测。这可能是ER和线粒体之间的已知的物理接触的结果。而线粒体的进一步纯化是可行的，它可能会引入一些限制，这些都是在讨论讨论。
图1。 。隔离质量的质量验证中三个有代表性的程序的步骤抽取的样本进行测试：分离前（共[步1.20]，T;胞浆部分[步1.22]，C;和线粒体组分[步1.24]，M）。的样品进行Northern分析（A，C）或Western分析（B）），Northern分析以下的mRNA：COB是转录的线粒体内，因此其信号应只在线粒体的RNA。其在C级外观将表明线粒体裂解制备过程中。 ACT1是编码胞浆蛋白的表达，因而受到细胞质核糖体翻译，大多出现在C部分。 ACO1是编码被导入到线粒体蛋白质的mRNA，并且大多出现在线粒体部分。 SEC61是编码ER驻留蛋白的mRNA，其在M部分存在表明ER成分在该馏分中的存在。底部面板呈现北部膜的亚甲基蓝染色，是2个rRNA（18S和25S）被检测到。此面板显示，出现显著量的核糖体中的M分段B）Western分析的followi纳克蛋白：POR1是线粒体外膜蛋白质，因此它的信号，预计只有在M级分。信号在C部分会提示线粒体成分的分离制备过程中。 HXK1是一种胞浆蛋白和CUE1是一个ER蛋白。两个报告这些馏分与线粒体级分的共纯化。 Rpl39是一个核糖体蛋白，再次表明核糖体的两个级分的存在。面板“Rpl39没有复苏”，提出了核糖体时，协议被排除在恢复步骤（步骤1.14）。C）北方分析CCP1，编码被导入到线粒体蛋白质的mRNA的分离。整个凝胶提交证明缺乏短，降解发起的乐队。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在成像技术的进步已经产生了高解析度的工具来研究mRNA的定位。今天，人们可以在毫秒时间尺度23-26测量甚至单个mRNA分子的移动。然而，传统的生化方法，如上面所描述的，也都是有用的资讯和是优选的情况。生化隔离允许的mRNA和蛋白质的大型剧目的净化，因此是最好的全基因组的研究。在单个隔离，可以得到足够的mRNA水平，以允许数以千计的基因的表征，无论是由DNA微阵列或RNA-SEQ 18,27。与此同时，人们可以找出蛋白质和进行蛋白质组学分析的表征蛋白质组线粒体28。生化分馏可适于线粒体从其他细胞器分离，尤其是对ER 29。这可能是有利的，一些类型的细胞中是高空间重叠ER和线粒体之间的阻碍微观定位分析。生化分馏的一个重要优点是其低成本，它允许许多不同样品的分析。一个相关的优点是其简单性-生化分馏，如上面所描述的，通常不需要mRNAs的费力的荧光标记，如在体内成像研究的情况。最后，很多陷阱和文物已经确诊为这些传统的协议，因此，必要的控制是行之有效的。
所提出的协议由原来的恢复步骤（步骤1.14）后面的酶解酶治疗。因为在酶解酶治疗引起的压力导致几乎立即平移逮捕和核糖体'从mRNA的解离这一步很关键。对核糖体的解离实际触发可以任意的包括在该处理，即去除的碳源，博览会的步骤URE高g离心，与还原剂（DTT）在治疗过程中，细胞壁去除酶解酶或引进高渗透压条件;所有这些是众所周知的诱导平移逮捕。这种翻译可能被捕影响核糖体与线粒体的关系。因此，我们发现，与线粒体基因关联是低酶解酶处理后，并在恢复过程中的增加（未示出）。
该分离由该协议的线粒体组分中含有显著量的ER，从各种ER标志物的存在下明显（ 例如 图1）。一个显而易见的愿望是进一步除去ER部件和获得纯的线粒体中，使用的是利用梯度29-33几个标准协议之一。然而，这些协议有必要把线粒体核糖体的剥离，要么是由于紧张的酶解酶处理（ 图1B 即当核糖重新关联与线粒体）的恢复完成后，该ER和线粒体标志物沉降到相同的部分。这大概是因为相关的核糖体掩盖在它们的密度（数据未示出）的差异。因此，核糖体关联研究，对线粒体隔离的替代方法将需要被开发的。
对于许多研究，但是，ER部件的存在并不一定是有问题的。编码行之有效的线粒体蛋白质（ 如 mRNA的协会顺乌头酸酶，ATP2，Oxa1）很可能是在此制备的粗线粒体而不是ER组件。因此建议使用这些典型的线粒体mRNA的一个作为读数为线粒体的影响。即未得到验证，如线粒体蛋白质不应该被用来作为记者，这是特别重要的，当全基因组的mRNA的研究被执行（ 例如微阵列分析），作为错误分配的mRNA可能会引入错误。
该协议的主要技术挑战是减少mRNA的降解。当使用无RNA酶的试剂始终是建议，人们应该记住，在细胞RNA酶的巨额资金被释放到溶液中溶解。肝素是一种很有效的RNA酶抑制剂及添加在显著金额。当大体积提取准备，相对于其他RNA酶抑制剂其相对较低的成本提供了额外的优势。肝素不过，也抑制反转录酶，因此应为涉及这样的酶活性的研究中移除（ 例如，RT-PCR或DNA微阵列标记）。在此，我们提出了基于氯化锂沉淀（步骤3.4-3.10）去除的过程。这种沉淀有效去除肝素，但显然也显著金额的mRNA都将丢失。此外，还有各种旋转柱，都应该从RNA样品取出肝素，但我们与这些有限的成功。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢博士。埃雷兹埃利亚胡，丹尼尔·梅拉梅德，Ophry松树和多伦拉帕波特建立这个协议的过程中帮助和意见。这项工作是由ISF（批准号1193至1109年）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
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