DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
DNAのナノロボットは、特定の刺激と内部隔離存在貨物に応じて開くように設計された中空の六角形ナノメートル装置です。どちらも刺激と貨物は、特定のニーズに応じて調整することができます。ここでは、DNA折り紙の技術を使用して、DNAナノロボット製作プロトコルを記述します。そして、処理は、折り畳み緩衝液の存在下で長い、円形、一本鎖DNAの足場に添加された原料混合物中に短い一本鎖DNAのステープルを混合することにより開始します。標準的なサーモサイクラーは、徐々にナノロボットの折り後ろ案内力でステープルツー足場アニーリングを容易にするために、混合反応温度を下げるようにプログラムされています。 60時間のフォールディング反応が完了したら、過剰なステープルは、アガロースゲル電気泳動（AGE）を介して可視化に続いて遠心分離フィルターを使用して廃棄されます。最後に、ナノロボットの成功した製造は、透過型電子顕微鏡（TEM）により確認され、ネガティブ染色としてウラニルギを用いました。
Introduction
核酸のナノテクノロジーのための用途は驚異的です。ワトソン-クリック塩基対と同様に、カスタムメイドのオリゴ2の大規模合成の容易さと相対的な低コストの扱いやすさは、アプリケーション3およびDNAナノテクノロジーの分野での研究の爆発を生成しました。基本的なビルディングブロックとして不動シーマン接合4,5に基づいて、構造のDNAナノテクノロジーは、任意の形状6-8の建設のための自己組織化基本単位としてのDNAを使用しています。
足場のDNA折り紙9技術の最近の開発は、サブナノメートルの精度で複雑 な2D / 3Dナノアーキテクチャ10-12の構築を可能にし、複雑化し、驚くほどの多様性と新しい機能オブジェクトを構築するための効率的なルートです。建設プロセスが長い足場一本鎖DNAに基づくもので、通常はウイルスGENOM由来短い一本鎖DNAオリゴの何百ものハイブリダイゼーションを介して折り畳むことができるeは、ステープルと呼ばれます。製造の再現性が達成可能な最大の水素結合相補性を容易にするために、短い一本鎖の短配列を調整した結果であるが、この技術により得られた高分解能の構造は、DNA二重らせんの自然な寸法の直接的な結果です。遅い高温アニールの使用は設計最低エネルギーをランプでは、熱力学的に好適なナノ構造は、高い収率及び忠実度に到達しました。コンピュータコードにおける接合設計ルールの簡単な実装は非常に接続された接合部の数百人を含む、大規模で複雑 な構造を設計する作業を簡素化するなどcaDNAno 13などのCADツールの開発を可能にしました。
これまで我々はcaDNAnoツール14,15を用いて、DNAのナノロボットの設計を説明しました。ここでは、製造を表しており、透過型電子顕微鏡（TEM）を介して可視化、の寸法のナノロボット、3D中空六角形のナノデバイス、所定の刺激と存在する特定の貨物に応じて大規模な構造変化を起こすように設計された35×35×50 nmの3、このようなタンパク質や核酸オリゴとして、内部に隔離。 12ロードステーションは、中空シャーシ内部利用可能であるが、バインドされた貨物の実際の数は、貨物のサイズとは異なります。カーゴ分子は、小DNA分子から、酵素、抗体、および5〜10 nmの金ナノ粒子の範囲。どちらCargocan均一または不均一で、各ナノロボットは、異なる分子の混合物を含むようにします。検出はaptasensor 16,17またはDNAの鎖置換技術18のいずれかに基づいて、タンパク質、核酸または他の化学物質を感知するために2つの二重螺旋固定ゲート設計を介して達成されます。アプタマー選択プロトコール19-21における最近の開発は、応答nanorobotsの設計を可能に分子および細胞型の増え続ける範囲。
初期の研究は、その抗原に結合する混合細胞集団15内の特定の細胞型の内側に抑制または多産の信号のいずれかを中継することができる特異抗体を担持ナノロボットを示しました。これらのナノデバイスのエキサイティングな機能は、単一集団内の異なるナノロボットサブタイプの導入で、より複雑なタスクとロジック制御を実行する能力です。最近では、アクティブなカーゴ分子22を含むエフェクター集団を制御する、正または負の調節因子のいずれかとして行うnanorobotsの特定のサブタイプを明らかにしました。
ここで紹介するプロトコルは、ナノロボット15,22の開放を容易にするために、PDGFに選択的に結合するアプタマーセンサー系列でゲートナノロボットの製造、精製およびイメージングを説明します。説明した製造方法は、nと同様です最初に、収率および精製速度を増加させながら、全体的な処理時間を低減することを目的とした変化にダグラスら 15によって示さanorobot製造プロセス。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、製造、精製、およびDNAナノロボットの視覚化を記載しています。デバイスの六角形の筐体の製造に続いて、ナノロボットの機能が容易に、利用可能な一本鎖ドッキング部位14と水素結合相補性への指定位置を見つけ、ロボットに固有の貨物およびセンシングストランドの簡単な紹介とプログラムされています、15,22。
説明した製造プロトコルは、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は有用な議論や作業のための非常に貴重な議論と助言し、バチェレラボのすべてのメンバーのためのS.ダグラスに感謝したいです。この作品は、生命科学の学部とバー – 宜蘭大学のナノテクノロジー＆アドバンストマテリアル研究所からの助成金によってサポートされています。
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
References
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
