Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
Il nanorobot DNA è un dispositivo nanometrico cava esagonale, progettato per aprire in risposta a stimoli specifici e presentare merci sequestrate all'interno. Entrambi gli stimoli e le merci possono essere personalizzati in base alle esigenze specifiche. Qui si descrive il protocollo di fabbricazione nanorobot DNA, con l'uso della tecnica origami di DNA. Il procedimento inizia miscelando brevi graffette DNA filamenti singoli, in una miscela di magazzino che viene poi inserito in un lungo, circolare, scaffold DNA a singolo filamento in presenza di un buffer di piegatura. Un cycler termico standard viene programmato per ridurre gradualmente la temperatura di reazione di miscelazione per facilitare la ricottura graffette da ponteggio, che è la forza guida dietro la piegatura della nanorobot. Una volta che la reazione di piegatura 60 hr è completa, graffette eccesso vengono eliminati utilizzando un filtro centrifugo, seguita da visualizzazione tramite elettroforesi in gel di agarosio-(AGE). Infine, successo fabbricazione del nanorobot viene verificata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM),con l'uso di uranile-formiato come colorazione negativa.
Introduction
Gli usi per gli acidi nucleici nanotecnologie sono sbalorditivi. La trattabilità della base Watson-Crick accoppiamento nonché la facilità e relativo basso costo della sintesi su larga scala di oligo misura 2 ha generato un'esplosione di applicazioni 3 e ricerca nel campo delle nanotecnologie DNA. Nanotecnologie DNA strutturale, basato sul immobile 4,5 giunzione Seeman come un elemento fondamentale fa uso di DNA come unità elementare auto-assemblaggio per la costruzione di forme arbitrarie 6-8.
Il recente sviluppo del DNA ponteggi origami 9 tecnica permette per la costruzione di complessi 2D / 3D nano-architetture 10-12 con precisione sub-nanometrica ed è un percorso efficace per la costruzione di nuovi oggetti funzionali con l'aumentare della complessità e la diversità sorprendente. Il processo di costruzione si basa su un DNA a singolo filamento lungo scaffold, di solito derivato da un genom viralee che può essere piegato attraverso l'ibridazione di centinaia di singoli brevi oligo filamento di DNA definito graffette. La risoluzione strutturale elevato ottenuto con questa tecnica è la diretta conseguenza delle dimensioni naturali del DNA a doppia elica, mentre la riproducibilità della fabbricazione è il risultato della modulazione dei brevi sequenze singolo filamento fiocco per facilitare la massima complementarità idrogeno-bonding realizzabile. Con l'uso di una temperatura di ricottura lenta rampa la creazione più bassa energia, termodinamicamente nanostruttura preferito è raggiunto in alte rese e fedeltà. La semplice applicazione di regole di progettazione di giunzione in un codice di calcolo ha permesso lo sviluppo di strumenti CAD, come caDNAno 13, che semplifica molto il compito di progettare grandi strutture complesse che contengono centinaia di incroci collegati.
Precedentemente abbiamo descritto la progettazione di un nanorobot DNA con l'ausilio dello strumento 14,15 caDNAno. Qui ci raffiguriamo la fabbricazione evisualizzazione, tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM), del nanorobot, una cavità nanodevice esagonale 3D, con dimensioni di 35 x 35 x 50 nm 3, destinato a subire un cambiamento conformazionale in risposta a determinati stimoli predeterminati e presenti carico specifico, tale come proteine o oligonucleotidi di acidi nucleici, sequestrati all'interno. Mentre 12 stazioni di carico sono disponibili all'interno del telaio cavità, il numero effettivo di carico legato differisce a carico di formato. Molecole cargo vanno da piccole molecole di DNA di enzimi, anticorpi e 5-10 nanoparticelle d'oro nm. Cargocan essere sia uniforme o eterogenea, tale che ogni nanorobot contiene una miscela di diverse molecole. Rilevamento avviene tramite due porte a doppia elica disegno di bloccaggio per rilevare proteine, acidi nucleici o altre sostanze chimiche, basato sia su aptasensor 16,17 o filamento di DNA spostamento 18 tecnologie. I recenti sviluppi in aptamer protocolli di selezione 19-21 consentono la progettazione di nanorobot risponderead una gamma sempre crescente di molecole e tipi di cellule.
Lavoro precedenza ha mostrato un nanorobot trasportano un anticorpo specifico, che in seguito al legame al suo antigene può trasmettere sia un inibitore o un segnale prolifica all'interno di specifici tipi cellulari in una popolazione cellulare mista 15. Una caratteristica interessante di questi nanodispositivi è la loro capacità di svolgere compiti ancora più complessi e controllo logico con l'introduzione di diversi sottotipi nanorobot in una singola popolazione. Recentemente abbiamo dimostrato specifici sottotipi di nanorobot che effettuano sia come regolatori positivi o negativi, che controlla una popolazione effettori contenente un carico molecola attiva 22.
Il protocollo presentato qui descritta la realizzazione, la purificazione e l'imaging di un nanorobot gated con sequenze sensori aptameri che si legano selettivamente al PDGF per facilitare l'apertura del nanorobot 15,22. Il processo di fabbricazione descritto è simile al nprocesso di fabbricazione anorobot inizialmente descritto da Douglas et al. 15 con modifiche volte a ridurre la durata complessiva dei processi, aumentando i tassi di rendimento e purificazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto la fabbricazione, la purificazione, e visualizzazione del nanorobot DNA. Dopo la fabbricazione del telaio esagonale del dispositivo, la funzione del nanorobot è programmato con la semplice introduzione di carico specifico e fili di rilevamento al robot che facilmente trovare la posizione designata causa idrogeno-bonding complementarità con siti di aggancio disponibile singolo filamento 14 , 15,22.
Il protocollo di fabbricazione descritto utilizza una rampa di r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare S. Douglas per le discussioni di grande valore e consigli, e tutti i membri del laboratorio Bachelet per utili discussioni e lavoro. Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti della Facoltà di Scienze della Vita e Istituto di Nanotecnologie e Materiali Avanzati alla Bar-Ilan University.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
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