Pliant et caractérisation d'un Robot Bio-sensible de l'ADN Origami

Summary

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Abstract

Le nanorobot d'ADN est un dispositif nanométrique hexagonale creuse, destinée à ouvrir en réponse à des stimuli spécifiques et des marchandises présente séquestrés à l'intérieur. Les deux stimuli et des marchandises peuvent être adaptés en fonction des besoins spécifiques. Ici, nous décrivons le protocole de fabrication ADN nanorobot, avec l'utilisation de la technique de l'ADN origami. La procédure lance en mélangeant courts agrafes d'ADN simple brin dans un mélange d'actions qui est ensuite ajouté à une longue, circulaire, simple brin d'ADN échafaudage en présence d'un tampon de pliage. Un cycleur thermique standard est programmé de manière à abaisser progressivement la température de réaction de mélange pour faciliter le recuit agrafes-à-échafaudage, qui est la force motrice derrière le pliage de la nanorobot. Une fois que la réaction de pliage 60 h est terminée, les agrafes en excès sont éliminées en utilisant un filtre centrifuge, suivie par la visualisation par l'intermédiaire d'une électrophorèse sur gel d'agarose (AGE). Enfin, la fabrication réussie de la nanorobot est vérifiée par microscopie électronique à transmission (TEM),avec l'utilisation d'uranyle-formate comme coloration négative.

Introduction

Les utilisations pour les acides nucléiques nanotechnologies sont étonnants. La traçabilité de l'appariement de bases de Watson-Crick ainsi que la facilité et à faible coût relatif de la synthèse à grande échelle d'oligos-mesure ² a généré une explosion des applications ³ et la recherche dans le domaine de la nanotechnologie de l'ADN. Nanotechnologie d'ADN structurale, sur la base de la jonction ^4,5 Seeman immobile comme un bloc de construction fondamental se sert de l'ADN en tant qu'unité primaire auto-assemblage pour la construction de formes arbitraires ^6-8.

Le développement récent de l'ADN origami échafaudage ⁹ technique permet la construction de 2D / 3D nano-architectures complexes ^10-12 avec une précision sub-nanométrique et est une voie efficace pour la construction de nouveaux objets fonctionnels avec l'augmentation de la complexité et de la diversité étonnante. Le processus de construction est basée sur un ADN simple brin long échafaudage, généralement dérivé d'un génome virale, qui peut être pliée par l'hybridation de centaines de courts oligonucleotides d'ADN simple brin appelé agrafes. La résolution structurel élevé obtenu par cette technique est le résultat direct des dimensions naturelles de la double hélice d'ADN, tandis que la reproductibilité de la fabrication est le résultat d'adapter les courtes séquences de base simple brin pour faciliter la liaison hydrogène complémentarité maximale réalisable. Avec l'utilisation d'un recuit lent de la température de rampe la plus faible d'énergie conçu, thermodynamiquement préféré nanostructure est atteinte avec des rendements élevés et de fidélité. La mise en œuvre facile des règles de conception de jonction dans un code informatique a permis le développement d'outils de CAO, tels que caDNAno ^13, qui simplifie extrêmement la tâche de concevoir de grandes structures complexes contenant des centaines de jonctions connectés.

Auparavant, nous avons décrit la conception d'un nanorobot d'ADN à l'aide de l'outil ^14,15 caDNAno. Ici, nous décrivons la fabrication etvisualisation, par microscopie électronique à transmission (MET), de l'nanorobot, un nanodispositif hexagonale creuse 3D, avec des dimensions de 35 x 35 x 50 nm ^3, conçu pour subir un changement conformationnel majeur en réponse à un stimuli prédéterminés et marchandises spécifiques présents, tels comme des protéines ou des oligonucléotides d'acide nucléique, piégé à l'intérieur. Bien que 12 stations de chargement sont disponibles à l'intérieur du châssis creux, le nombre réel de cargaison lié est différente de la taille de la cargaison. Molécules cargo vont de petites molécules d'ADN à des enzymes, des anticorps et des nanoparticules d'or 5-10 nm. Cargocan être soit uniforme ou hétérogène, de telle sorte que chaque nanorobot contient un mélange de molécules différentes. Détection est réalisée par deux double hélice conception de portes de verrouillage pour détecter protéines, acides nucléiques ou d'autres produits chimiques, basée soit sur ​​aptasensor ^16,17 ou ¹⁸ brin d'ADN déplacement technologies. Les développements récents dans les protocoles de sélection des aptamères ^19-21 permettent la conception de nanorobots répondreà une gamme de plus en plus des molécules et des types de cellules.

Des travaux antérieurs ont montré un nanorobot portant un anticorps spécifique, qui lors de la liaison à son antigène peut relayer soit un inhibiteur ou un signal prolifique à l'intérieur de types de cellules spécifiques dans une population de cellules mixtes ^15. Une caractéristique intéressante de ces nano est leur capacité à effectuer des tâches encore plus complexe et logique de commande avec l'introduction de différents sous-types de nanorobots dans une seule population. Récemment, nous avons démontré sous-types spécifiques de nanorobots spectacle soit comme des régulateurs positifs ou négatifs, de contrôler une population effecteur contenant une molécule cargo actif ^22.

Le protocole présenté ici décrit la fabrication, la purification et l'imagerie d'un nanorobot fermée, avec des séquences de sonde de aptamère qui se lient sélectivement au PDGF pour faciliter l'ouverture de la nanorobot ^15,22. Le procédé de fabrication décrit est similaire au nprocessus de fabrication de anorobot initialement représenté par Douglas et al. ¹⁵ avec des changements visant à réduire la durée globale du processus, tout en augmentant les taux de rendement et de purification.

Protocol

1. Préparation de Staples Piscine Mélange Ordre lyophilisé ADN nanorobots agrafes sur des plaques à 96 puits énumérés dans le tableau 1 (voir Matériaux) et de normaliser à 10 nmol. Pour une description détaillée de la conception et l'architecture du nanorobot d'ADN voir Ben-Ishay et al., 14 et Douglas et al. 15). Reconstituer chaque agrafe bien avec DNase / ultrapure exempte de RNases à une…

Representative Results

Les résultats représentatifs sont présentés sur la figure 2A. Toutes les voies contiennent 1 pg d'ADN total, mesuré par spectrophotomètre (DO260). Par rapport à la circulaire échafaudage d'ADN simple brin (Lane 2), nanorobots sont entravés dans le gel en raison de leur poids moléculaire élevé, le résultat d'agrafes hybridation à l'ADN de l'échafaudage (Lane 3. flèche rouge). La bande basse de poids moléculaire Lane 3 représente agrafes ex…

Discussion

Nous avons décrit la fabrication, la purification, et la visualisation de la nanorobot d'ADN. À la suite de la fabrication du châssis hexagonal du dispositif, la fonction de la nanorobot est programmé avec la simple introduction de marchandises spécifique et brins de détection pour le robot qui trouvent facilement leur position désignée en raison de la liaison hydrogène complémentarité avec des sites d'accueil disponible simple brin ^{14 , 15,22.}

Le protocole de f…

Materials

DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai