डीएनए origami से एक जैव संवेदनशील रोबोट की तह और विशेषता
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
डीएनए nanorobot अंदर तनहा विशिष्ट उत्तेजनाओं और वर्तमान माल के जवाब में खोलने के लिए बनाया गया एक खोखला हेक्सागोनल nanometric युक्ति है। दोनों उत्तेजनाओं और कार्गो विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। यहाँ हम डीएनए origami तकनीक के उपयोग के साथ, डीएनए nanorobot निर्माण प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रक्रिया तो एक तह बफर की उपस्थिति में एक लंबा, परिपत्र, एकल कतरा डीएनए पाड़ के लिए जोड़ा है जो एक शेयर मिश्रण में लघु एकल कतरा डीएनए स्टेपल के मिश्रण से शुरू की। एक मानक थर्मो साइक्लर धीरे-धीरे nanorobot की तह पीछे मार्गदर्शक ताकत है जो स्टेपल करने वाली पाड़ annealing, की सुविधा के लिए मिश्रण प्रतिक्रिया तापमान कम करने के लिए प्रोग्राम किया जाता है। 60 घंटा तह प्रतिक्रिया पूरा हो गया है एक बार, अतिरिक्त स्टेपल agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (उम्र) के माध्यम से दृश्य के बाद एक केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करते हुए खारिज कर रहे हैं। अंत में, nanorobot के सफल निर्माण (मंदिर) संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया जाता है,नकारात्मक दाग के रूप में uranyl-स्वरूप के उपयोग के साथ।
Introduction
न्यूक्लिक एसिड नैनो के लिए उपयोग करता है अद्भुत हैं। वाटसन-क्रिक आधार बाँधना की शिक्षणीयता के साथ ही कस्टम बनाया ओलिगोस 2 की बड़े पैमाने पर संश्लेषण की आसानी और रिश्तेदार कम लागत वाली डीएनए नैनो के क्षेत्र में एक आवेदन 3 के विस्फोट और अनुसंधान उत्पन्न किया है। एक मौलिक निर्माण खंड के रूप में स्थिर सीमैन जंक्शन 4,5 पर आधारित स्ट्रक्चरल डीएनए नैनो, मनमाने ढंग से आकार 6-8 के निर्माण के लिए एक स्वयं कोडांतरण प्राथमिक इकाई के रूप में डीएनए का इस्तेमाल करता है।
scaffolded डीएनए origami 9 तकनीक की हाल ही में विकास उप नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ जटिल 2D / 3D नैनो आर्किटेक्चर 10-12 के निर्माण के लिए अनुमति देता है और बढ़ती जटिलता और आश्चर्यजनक विविधता के साथ नए कार्यात्मक वस्तुओं के निर्माण के लिए एक कुशल मार्ग है। निर्माण प्रक्रिया में लंबा पाड़ एकल असहाय डीएनए पर आधारित है, आम तौर पर एक वायरल जीनोम से निकाली गईलघु भी कतरा डीएनए ओलिगोस के सैकड़ों के संकरण के माध्यम से तह किया जा सकता है, जो ई, स्टेपल करार दिया। निर्माण के reproducibility प्राप्त अधिकतम हाइड्रोजन संबंध पूरकता की सुविधा के लिए लघु एकल कतरा प्रधान दृश्यों सिलाई का परिणाम है, जबकि इस तकनीक के द्वारा प्राप्त उच्च संरचनात्मक संकल्प, डीएनए डबल हेलिक्स की प्राकृतिक आयामों का प्रत्यक्ष परिणाम है। एक धीमी गति से तापमान annealing के उपयोग के साथ thermodynamically वरीय nanostructure उच्च पैदावार और निष्ठा में पहुँच जाता है डिज़ाइन किया गया सबसे कम ऊर्जा, रैंप। एक कंप्यूटर कोड में जंक्शन डिजाइन के नियमों के आसान कार्यान्वयन अत्यंत जुड़ा जंक्शनों के सैकड़ों युक्त बड़े, जटिल संरचनाओं डिजाइनिंग के काम को आसान है कि इस तरह caDNAno 13 के रूप में सीएडी उपकरण के विकास, सक्षम होना चाहिए।
पहले हम caDNAno उपकरण 14,15 की सहायता से एक डीएनए nanorobot के डिजाइन का वर्णन किया। यहाँ हम निर्माण को दर्शाती है औरसंचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) के माध्यम से दृश्य, के आयामों के साथ nanorobot, एक 3 डी खोखले हेक्सागोनल nanodevice, के एक पूर्व निर्धारित उत्तेजनाओं और वर्तमान विशिष्ट माल, के जवाब में एक प्रमुख गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना करने के लिए तैयार 35 x 35 x 50 एनएम 3, इस तरह प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड ओलिगोस के रूप में, अंदर तनहा। 12 लोडिंग स्टेशनों खोखला चेसिस के अंदर उपलब्ध हैं, बाध्य माल की वास्तविक संख्या कार्गो आकार के साथ अलग है। कार्गो अणुओं छोटे डीएनए अणु से एंजाइमों, एंटीबॉडी और 5-10 एनएम सोने के नैनोकणों को लेकर। प्रत्येक nanorobot अलग अणुओं का मिश्रण होता है, जैसे कि वर्दी या विषम हो Cargocan हैं या तो। सेंसिंग aptasensor 16,17 या डीएनए किनारा विस्थापन 18 प्रौद्योगिकियों पर या तो, प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड या अन्य रसायनों भावना के लिए दो डबल पेचदार लॉकिंग फाटकों डिजाइन के माध्यम से हासिल आधारित है। Aptamer चयन प्रोटोकॉल 19-21 में हाल के घटनाक्रम जवाब nanorobots के डिजाइन सक्षमअणुओं और प्रकार की कोशिकाओं के एक बढ़ती दूरी के लिए।
इससे पहले काम अपने प्रतिजन के लिए बाध्यकारी एक निरोधात्मक या एक मिश्रित सेल की आबादी 15 में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अंदर करने के लिए एक विपुल संकेत या तो रिले कर सकते हैं पर जो एक विशिष्ट एंटीबॉडी, ले जाने के एक nanorobot दिखाया। इन nanodevices के एक रोमांचक सुविधा एक ही जनसंख्या में विभिन्न nanorobot उपप्रकार की शुरूआत के साथ और भी अधिक जटिल कार्यों और तर्क नियंत्रण प्रदर्शन करने की क्षमता है। हाल ही में हमने एक सक्रिय माल अणु 22 से युक्त एक प्रेरक जनसंख्या को नियंत्रित करने, सकारात्मक या नकारात्मक नियामकों या तो के रूप में प्रदर्शन nanorobots के विशिष्ट उपप्रकार का प्रदर्शन किया।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल nanorobot 15,22 के उद्घाटन की सुविधा के लिए PDGF के लिए चुनिंदा जो बाँध aptamer सेंसर दृश्यों के साथ gated एक nanorobot का निर्माण, शोधन और इमेजिंग का वर्णन है। वर्णित निर्माण की प्रक्रिया n करने के लिए इसी तरह की हैउपज और शुद्धि की दरों में वृद्धि करते हुए anorobot निर्माण की प्रक्रिया शुरू में, डगलस एट अल। समग्र प्रक्रिया की अवधि कम करने के उद्देश्य से बदलाव के साथ 15 से दर्शाया।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम डीएनए nanorobot का निर्माण, शुद्धि, और दृश्य का वर्णन किया। डिवाइस का हेक्सागोनल चेसिस के निर्माण के बाद, nanorobot के समारोह में आसानी से उपलब्ध होने के कारण एक-एक कतरा डॉकिंग साइटों के साथ 14 हाइड्रोजन संबंध…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों अत्यंत मूल्यवान विचार विमर्श और सलाह है, और उपयोगी विचार विमर्श और काम के लिए Bachelet प्रयोगशाला के सभी सदस्यों के लिए एस डगलस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम के बार-इलान विश्वविद्यालय में जीवन विज्ञान के संकाय और नैनो और उन्नत सामग्री के संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
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