Introduction
Recente ontwikkelingen in de farmaceutische industrie hebben geleid tot een toegenomen belangstelling voor het gebruik van cellulaire microarrays in de drug discovery proces voor drug discovery en cytotoxicological analyse 1,2,3. De ontwikkeling van in vitro high-throughput testen en screening methoden met behulp van microarrays cel zou de snelle en kosteneffectieve ontwikkeling van kandidaat-geneesmiddelen, alsook van tevoren het fundamenteel begrip van de cel 1,4 vergemakkelijken. De traditionele benadering van screening met cellen maakt gebruik van conventionele goed plaat platforms; maar deze benadering is beperkt vanwege de hoge kosten, beperkte verwerkingscapaciteit en beperkt vermogen om kwantitatieve informatie over celfunctie 1,5. Vanwege deze beperkingen, is het onderzoek in cellulaire microarray technologie ontluikende voor moleculair biologische karakterisering, tissue engineering, en drug screening 1,6. De voordelen van cellulaire microarrays omvatten kleinere steekproef gebruik, minimale effecten vancellulaire fenotype heterogeniteit maskeren informatie, en vooral de mogelijkheid om te testen automatiseren voor meer high-throughput toepassingen 1,7,8.
De farmaceutische industrie maakt gebruik momenteel high-throughput-cel-gebaseerde Screeningtesten met 2D cel monolaagculturen voor drug discovery in microtiterputje platen 9. Multiplexing cellen in putjes van microtiterplaten biedt het potentieel voor hogere doorvoer met unieke experimenten opties. Verder zijn de huidige technologieën voor cellulaire microarrays laat de cellen drogen die drastisch kunnen wijzigen fenotype van de cellen van in vivo 10,11. Om deze problemen te overwinnen, werd de MFCA ontworpen en wordt getoond in Figuur 1. Het ontwerp van de MFCA 3D fluïdica kan de printkop punt in figuur 1 worden neergelaten in een bad en samengeperst tegen een oppervlak om een afdichting te vormen. De zachte siliconen tip van de printkop zich gedraagt als eenpakking en vormt een omkeerbare afdichting. De MFCA technologie is uniek geschikt om met ondergedompelde oppervlakken, die nodig is voor zowel celculturen en weefselplak systemen en moeilijk of onmogelijk met de meeste andere benaderingen. Pinnen of inkt-jet printen zal niet werken, en 2D microfluïdische apparaten zijn niet geschikt voor afzetting of interfacing met grote arrays van discrete plekken. Verder, door miniaturisering en lokaliseren van het experiment - de cellulaire microarray - de MFCA overwint de belangrijkste problemen geassocieerd met high-throughput cel-gebaseerde screeningtesten.
De CFM maakt gebruik van 3D-kanaal netwerken te fietsen klein volume vloeistof monsters na microscopisch spot locaties op een oppervlak 12,13. Door druk met stroom worden biomoleculen, cellen en andere reagentia gehandhaafd in een vloeibare omgeving gedurende het printproces, waardoor de drukken van gevoelige biomoleculen en cellen zonder blootstelling aan lucht, waarbij de huidige cel druktechnieken belemmert. Het is ook mogelijk om afdrukken uit ruw materiaal zoals hybridoma supernatanten of mits er een opname mechanisme op de array oppervlak. Het doel van dit manuscript is in detail de ondergedompelde drukken van twee celtypen op een oppervlak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celcultuur Voorbereiding
- Slaan NIH/3T3 cel voorraden in vloeibare stikstof tot aan gebruik.
- Bereid complete media voor NIH/3T3-cellen met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 10 mM HEPES buffer, 50 eenheden / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine.
- Ontdooi cellen gedurende 2-3 minuten in een schuddend waterbad bij 37 ° C.
- Resuspendeer cellen in 5 ml compleet medium en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 3 minuten.
- De cel bovenstaande vloeistof zonder de celpellet.
- Resuspendeer de cellen in 5 ml medium en cellen tellen met een hemocytometer.
- Verwijder 10 pi van de celsuspensie en plaats in een 0,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 10 ul van trypan blauw aan de celsuspensie en roer met de punt van de pipet.
- Pipetteer 10 ul van de gekleurde cellen in een hemocytometer kamer.
- Tellen cellen hemocytometer 10xvergroting.
- Tel de levende cellen (kleine, witte ballen) voor 4 van de 9 grote pleinen. Tellen alleen de levende cellen die niet donkerblauw van de trypaanblauw vlek lijken.
- Bereken het gemiddelde aantal cellen per vierkante, waardoor het aantal cellen x 10 4 cellen / ml in de oorspronkelijke celsuspensie.
- Zaad cellen bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen / ml met een totaal van 5 ml per T25 fles.
- Kweekcellen tussen 70% en 80% confluentie voor het begin experimenten. Vernieuwen media om de 2-3 dagen of naar vereist.
2. Printing Voorbereiding van de oppervlakte
- Markeer een rechthoek met markering op de bodem van een tissue-cultuur behandeld polystyreen (TCTPS) 12 wells plaat van de grootte van de printkop (7 mm x 19 mm).
- Pipetteer 50 ul foetaal runderserum in de rechthoekige stippellijn verspreiden over het gehele gebied van de punt.
- Laat de petrischaalin een steriele bioveiligheid kap O / N om het serum plek volledig drogen. Deze platen worden bereid maximaal 2 dagen vóór gebruik.
3. Ondergedompeld Printing
- Spoel de printkop uit met gedestilleerd water.
- Vul een 60 mm petrischaal met gedestilleerd water en dock de printkop op het oppervlak.
- Flow gedestilleerd water door elk van de leidingen gedurende 2 min bij 150 gl / min met behulp van een pneumatische pomp.
- Gooi het water uit de petrischaal en vul het met schoon water.
- Verplaats de printkop op en neer in het water 3 keer.
- Dock de printkop centrum over de serum-gecoate plek in de pre-bereid 12 well plaat.
- Prime de printkop met voorverwarmd complete media, 300 ul per kanaal.
- Print gesuspendeerde cellen bij een concentratie van 50.000 cellen / ml op het oppervlak en 60 pl / min, 100 ul per kanaal.
- Plaats de printkop, links gedokt tegen deoppervlak en het verdeelstuk in een celkweek incubator ingesteld op 5% CO2 en 37 ° C gedurende 2 uur.
- Na de 2 uur incubatie, verwijder de printkop en leg het deksel op de cultuur schotel. Het tijdstip waarop de printkop verwijderd wordt beschouwd als de 0 uur tijdstip.
4. Standaard Cell Culture
- Voeg 1 ml voorverwarmde media om een van de serum-spotted TCTPS 12-well plaat bereid in stap 2.
- Neem 1 ml van de resterende celsuspensie uit stap 2 en pipet in een enkel putje van een 12-wells plaat TCTPS. Dit zal een kweek die 50.000 cellen in de schaal te produceren.
- Plaats de celkweek plaat in een incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Na de 2 uur incubatie beginnen timing; voor samenhang tussen gedrukte en zaaien monster, die wordt beschouwd als de 0 uur tijdstip.
5. Cultuur Visualisatie
- Na 0, 2, 24 en 48 uur nemen cellen van elk van de twee methoden described boven en afbeelding met behulp van een standaard omgekeerde microscoop.
- Vlekken op de cellen met propidiumjodide, een fluorescerende vlek die alleen wordt opgenomen in de kern van dode cellen.
- Voorzichtig Spoel de cellen 3 maal met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (PBS + +) om vuil te verwijderen.
- Voeg 1 ml voorverwarmde PBS + + aan elke kweekvat.
- Voeg 1 ul propidiumjodide stockoplossing (1 mg / ml) aan elk kweekvat.
- Incubeer de cellen gekleurd met propidium jodide bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Beeld de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop bij 10x en 40x vergroting.
- Vlekken op de cellen met propidiumjodide, een fluorescerende vlek die alleen wordt opgenomen in de kern van dode cellen.
- Gooi de cellen in een geschikte biohazard container.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fibroblastcellijn NIH/3T3-cellen werden afgedrukt of gezaaid op een verzonken oppervlak. De cellen werden gekweekt tot een dichtheid van 5 x 10 4 cellen per ml. Cellen werden gezaaid met behulp van traditionele celcultuur technieken. Cellen werden afgedrukt met een groot-formaat, twaalf-flow cell printkop waar de kanalen zijn groter (~ 500 micrometer) dan de CFM gebruikt voor eiwitten en andere biomoleculen. De cellen werden afgedrukt of geënt op een oppervlak serum gecoat. Het drukproces wordt getoond in figuur 1.
Na het printen en het zaaien werden de cellen gevisualiseerd dichtheid en morfologie beoordelen op relevante tijdstippen (0, 2, 24 en 48 uur). De celdichtheid en morfologie van de cellen op deze tijdstippen werd gemeten met 10X en 40X vergroting microscopisch. De beelden tonen dat de cellen bezitten bijna identiek fenotype op elk tijdstip en op elke vergroting Figuur 2. Op basis van deze gegevens, het effect vandrukkerij werd bepaald minimaal.
De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met behulp van een PI vlek. Zoals getoond in figuur 3, de cellevensvatbaarheid van de afgedrukte cel was niet significant verschillend van de gezaaide cellen voor elk tijdstip. Het belangrijkste verschil tussen de twee methoden voor het bevestigen van de cellen aan het oppervlak de dichtheid van de cellen afgedrukt. Celdichtheid neemt af bij de 2 uur tijdstip met meer dan 50% in beide ontpit en geprinte zonnecellen. Nader onderzoek is geboden om de oorzaak van deze daling te bepalen; echter algemeen gedrukt dichtheid verhoudingen in vergelijking met zaadjes blijft aanzienlijk hoger. De gedrukte celdichtheid in de stroomcel ongeveer tienmaal zo dicht op elk tijdstip de geënte cellen overwegen cellen werden gedrukt bij dezelfde dichtheid als zaaien, maar in een kleiner gebied (0,6 cm 2 gebied voor een stroomcel, 3,8 cm 2 voor een putje van een 24-wells plaat). Op het laatste tijdstip de cellen op dezelfde dichtheid which is waarschijnlijk te wijten aan cel beweeglijkheid en hulpbronnen beperkingen.
Figuur 1. (A) Foto van de CFM. (B) Schematische voorstelling van een stroom cel. (C) SEM beeld van de printkop tonen individuele flowcells. (D) Schematische voorstelling van ondergedompeld afdrukken waar printkop dokken om weefselkweek compatibel oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Afbeeldingen vergeleken morfologie van gezaaide cellen versus gedrukt. In (A) 3T3-cellenwerden microfluidically gedrukt op BSA en beoordeeld op 0, 2, 24 en 48 uur. In (B) werden 3T3-cellen in plaats van gezaaid afgedrukt. De cel morfologie is vergelijkbaar of zelfs identiek. klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Vergelijking van celdichtheid en de levensvatbaarheid van cellen drukken en zaaien van cellen op verschillende tijdstippen zoals 0, 2, 24 en 48 uur. In (A) de celdichtheid in cellen per mm2 beoordeeld. In (B) de levensvatbaarheid van de cellen bepaald. Klik hier om een grotere versie van deze FIGU bekijkenre.
Figuur 4. 10x vergroting beeld van vier stroom cellen van de cel microarray continue stroom microspotter waarin NIH/3T3-cellen door zijn gestroomd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 3D microfluïdische printtechnologie hier beschreven is uniek in staat microfluidically drukken arrays van cellen in een vloeistof goed gevuld, dat wil zeggen een verzonken oppervlak. Door drukken op oppervlakken onder water kunnen microarrays cellen worden geproduceerd die de fysiologisch relevante cellulaire fenotype van cellen en het vermogen om cellen multiplexen in de bodem van een put Figuur 4 behouden. De resultaten van deze studie tonen aan dat microfluidically druktechnieken cellen resulteert in celaanhechting met vergelijkbare cel morfologie en levensvatbaarheid; echter, kan de gedrukte cellen dichter worden bevestigd in een gedefinieerde locatie resulteert in kortere algemene studie tijden. Kortere studie kunnen resulteren in aanzienlijke kostenbesparingen voor high-throughput drug screening 14.
Microfluidics is eerder gebruikt voor cellulaire microarrays en high-throughput screening van geneesmiddelen. Tientallen studies hebben beschreven hoe de stroom gebaseerde testende statische flow problemen te elimineren; Helaas, deze studies gebruikt 2D microfluidics (niet te verwarren met 2D en 3D weefselculturen), waarin de dichtheid, multiplexing en microscoop integratie sterk parallelle analyses 15 beperkt - 19. Digitale microfluidics en druppel-gebaseerde microfluidica zijn voorgesteld voor dit soort toepassingen en kan in zeer parallelle, gemultiplexte configuraties 15,17,18, maar ze zijn beperkt tot enkele of kleine celgroepen en alle verliezen 3-D multi- celtype weefselstructuur tijdens de voorbehandeling. Hoge doorvoer flowcytometrie is gebruikt voor snelle screening cel; echter flowcytometrie vereist cellen blijven in suspensie, die niet ideaal voor het screenen hechtende cellijnen die in vivo worden vastgebonden aan extracellulaire matrix 20. Co-culturen ook last hebben van gebrek aan ware weefsel vertegenwoordiging 19. Daarentegen 3D MFCA technologie maakt de volautomatischepositie van biomoleculen en levering van reagentia naar cel vlekken of intact weefsel plakjes in een opeengepakte array. Het voorgestelde systeem zou niet alleen in staat zijn om arrays te genereren, maar zou wel op een "vloeiende" omgeving die het mogelijk maakt voor studies van schuifspanningen, levering van verschillende verbindingen, en groeiomstandigheden van deze arrays en zal leiden tot meer voorspellende in vitro drug screening instrumenten. Verschillende toepassingen kunnen worden beoogd waarbij innovatie oneindig doorgaan. Een dergelijk instrument maakt nieuwe cellulaire drug discovery en cytotoxicological assays in een veelheid van kritische onderzoeksgebieden zoals kanker, diabetes, ontstekingen, infecties en cardiovasculaire ziekte.
Terwijl de MFCA verdient de voorkeur om cellen te leveren aan een ondergedompelde oppervlak, de uitdaging blijft de cel hechten aan het oppervlak, vooral voor niet-hechtende cellijnen. Toekomstige richtingen voor deze technologie zal zich richten op methoden voor mobiele bevestiging voorhet oppervlak. Technieken voor cel patroon op kunstmatige oppervlakken momenteel bestaan en omvatten: inkjet printing, microextrusion of filament plotten, DNA-hybridisatie, en laser vooruit overdracht 21. Van deze technieken is de hechting van cellen met DNA-hybridisatie techniek bezit verscheidene unieke en belangrijke functies. Ten eerste, de wijze van celhechting niet afhankelijk receptoren bezit van individuele cellen, zodat zowel hechtende en niet hechtende cellen kunnen worden gevormd met deze methode 22. Vervolgens kan het DNA cellulaire patroon werkwijze voor het genereren van complexe cellulaire arrays bestaande uit vele soorten cellen door het gebruik van meerdere oppervlak gebonden DNA-sequenties 23. Toekomstige toepassingen of aanwijzingen zal zich richten op het gebruik van DNA-hybridisatie-technologie voor celhechting 19,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn werknemer en aandeelhouders van Wasatch Microfluidics dat reagentia en / of instrumenten die in dit manuscript produceert.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Chris Morrow erkennen voor technische ondersteuning. De financiering werd verstrekt door NIH SBIR (R43) verlenen 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous flow microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | Base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | Cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | Cell media additive |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | Cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | Stain cell sfor counting |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | Cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | Rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | Used to remove cells from surface |
References
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. , Springer. (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
