Introduction
Los avances recientes en la industria farmacéutica han conducido a un mayor interés en el uso de microarrays de celulares en el proceso de descubrimiento de fármacos para la detección de drogas y análisis cytotoxicological 1,2,3. El desarrollo de los ensayos in vitro de alto rendimiento y los métodos de detección utilizando microarrays de células facilitaría el desarrollo rápido y rentable de los candidatos de la droga, así como en el avance de la comprensión fundamental de la célula de 1,4. El enfoque tradicional para el cribado con células utiliza plataformas de placa de pocillos convencionales; Sin embargo este enfoque es limitado debido al alto costo, rendimiento limitado, y la capacidad limitada para obtener información cuantitativa sobre la función celular 1,5. Debido a estas limitaciones, la investigación en las tecnologías de microarrays celular está creciendo para la caracterización molecular biológica, la ingeniería de tejidos, y la detección de drogas 1,6. Las ventajas de los microarrays de celulares incluyen el uso de la muestra más pequeña, efectos mínimos deheterogeneidad fenotipo celular enmascarar la información, y lo más importante la capacidad de automatizar los ensayos para más aplicaciones de alto rendimiento 1,7,8.
La industria farmacéutica utiliza actualmente ensayos de cribado basados en células de alto rendimiento con cultivos monocapa de células 2D para la detección de drogas en placas de pocillos de microtitulación 9. Células de multiplexación en pocillos de placas de microtitulación ofrece el potencial para un mayor rendimiento con opciones de experimentación únicas. Además, las tecnologías actuales para microarrays de celulares permiten que las células se sequen que podría alterar dramáticamente el fenotipo de las células in vivo a partir de 10,11. Con el fin de superar estos problemas, el ACFM se ha diseñado y se muestra en la Figura 1. El diseño de los fluidos MFCA 3D permite a la punta del cabezal de impresión en la Figura 1 para ser rebajado en un baño y se comprime contra una superficie para formar un sello. La punta de silicona suave de la cabeza de impresión se comporta como unjunta y forma un sello reversible. La tecnología ACFM es adecuado de forma única para interactuar con las superficies sumergidas, que se requiere para ambos cultivos celulares y sistemas de corte de tejido, y es difícil o imposible con la mayoría de otros enfoques. Alfileres o impresión por chorro de tinta no va a funcionar, y los dispositivos de microfluidos en 2D no son adecuados para la deposición o la interconexión con grandes conjuntos de puntos discretos. Además, por la miniaturización y la localización de la experimento - el microarray celular - la ACFM supera los principales problemas asociados con ensayos de cribado basados en células de alto rendimiento.
El CFM utiliza redes de canal 3D para pequeñas muestras de fluido de volumen de ciclo más de los lugares críticos microscópicos en una superficie de 12,13. Al imprimir con flujo, biomoléculas, células, y otros reactivos se mantienen en un medio líquido durante todo el proceso de impresión, lo que permite la impresión de biomoléculas y células sensibles y sin exposición al aire, lo que dificulta las técnicas de impresión celda actual. También es posible imprimir directamente de material en bruto como hibridoma o sobrenadantes cumpliendo con un mecanismo de captura sobre la superficie de la matriz. El objetivo de este manuscrito es explicar en detalle la impresión sumergida de dos tipos de células sobre una superficie.
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Protocol
1. Preparación de células Cultura
- Almacene las poblaciones de células NIH/3T3 en nitrógeno líquido hasta que esté listo para su uso.
- Preparar los medios de comunicación completa para células NIH/3T3 utilizando medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%, tampón HEPES 10 mM, 50 unidades / ml de penicilina, y 50 mg / ml de estreptomicina.
- Descongelar las células durante 2-3 minutos en un baño de agua con agitación a 37 ° C.
- Resuspender las células en 5 ml de medio completo y se centrifuga a 1500 xg durante 3 min.
- Eliminar el sobrenadante de células sin alterar el sedimento celular.
- Resuspender las células en 5 ml de los medios de comunicación y contar las células usando un hemocitómetro.
- Retire 10 l de la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
- Añadir 10 l de azul de tripano a la suspensión celular y se agita con la punta de la pipeta.
- Pipetear 10 l de las células teñidas en una cámara de hemocitómetro.
- Contar las células en un hemocitómetro a 10xmagnificación.
- Contar las células vivas (pequeñas bolas blancas) para 4 de los 9 cuadrados grandes. Sólo contar las células vivas que no aparecen de color azul oscuro de la mancha azul de tripano.
- Calcular el número medio de células por cuadrado grande, lo que resulta en el número de células x 10 4 células / ml en la suspensión original de células.
- Se siembran las células a una densidad de 1 x 10 5 células / ml con un total de 5 ml en cada matraz T25.
- Cultivar las células a entre 70% y 80% de confluencia antes de los experimentos iniciales. Actualizar medios cada 2-3 días o cuando sea necesario.
2. Preparación de la superficie de impresión
- Marcar un rectángulo con el marcador en la parte inferior de una cultura-tratada de tejido de poliestireno (TCTPS) 12 placa así el tamaño de la cabeza de impresión (7 mm x 19 mm).
- Añadir 50 l de suero fetal bovino en el área rectangular y se extendió por toda la región, con la punta.
- Deje la placa de Petrien una estéril bioseguridad capó O / N para que el lugar de suero se seque por completo. Estas placas deben estar preparados no más de 2 días antes de su uso.
3. Impresión Sumergido
- Enjuague el cabezal de impresión con agua destilada.
- Llene un 60 mm placa de Petri con agua destilada y acoplar el cabezal de impresión en la superficie.
- El flujo de agua destilada a través de cada una de las líneas durante 2 minutos a 150 l / min utilizando una bomba neumática.
- Deseche el agua de la placa de Petri y llenarlo con agua limpia.
- Mueva el cabezal de impresión hacia arriba y hacia abajo en el agua 3 veces.
- Acople el centro de la cabeza de impresión sobre el lugar de suero recubierto en la placa de pre-preparado 12.
- Cebe el cabezal de impresión con medios completos pre-calentado, 300 l por canal.
- Imprimir células suspendidas a una concentración de 50.000 células / ml sobre la superficie y 60 l / min, 100 l por canal.
- Coloque el cabezal de impresión, izquierdo atracado en contra de lasuperficie, y el colector en una incubadora de cultivo celular establece en 5% de CO 2 y 37 ° C durante 2 h.
- Después de la incubación de 2 horas, retire el cabezal de impresión y coloque la tapa en la placa de cultivo. El momento en el que el cabezal de impresión elimina se considera el punto de tiempo 0 h.
4. Cultivo Celular Estándar
- Añadir 1 ml de medio de pre-calentado a una de la placa TCTPS 12 pocillos sin suero manchado preparado en el paso 2.
- Tomar 1 ml de la suspensión celular restante de la etapa 2 y la pipeta en un solo pocillo de una TCTPS placa de 12 pocillos. Esto producirá un cultivo que contiene 50.000 células en el plato.
- Coloque la placa de cultivo de células en una incubadora a 37 ° C durante 2 h.
- Después de la incubación de 2 horas comenzar el tiempo; para mantener la coherencia entre las muestras impresas y de siembra, esto se considera el punto de tiempo 0 h.
5. Visualización Cultura
- Después de 0, 2, 24, y 48 células toman horas de cada uno de los dos métodos described arriba y la imagen usando un microscopio invertido estándar.
- Teñir las células con yoduro de propidio, una mancha fluorescente de color rojo que sólo se incorpora en el núcleo de las células muertas.
- Enjuague suavemente las células 3 veces con 1 ml de PBS con calcio y magnesio (PBS + +) para eliminar los residuos.
- Añadir 1 ml de pre-calentado PBS + + para cada recipiente de cultivo.
- Añadir 1 l de solución de yoduro de propidio de stock (1 mg / ml) a cada recipiente de cultivo.
- Se incuban las células teñidas con yoduro de propidio a 37 ° C durante 10 min.
- Imagen de las células utilizando un microscopio invertido a 10x y 40x.
- Teñir las células con yoduro de propidio, una mancha fluorescente de color rojo que sólo se incorpora en el núcleo de las células muertas.
- Deseche las células en un contenedor de residuos sanitarios apropiados.
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Representative Results
Las células NIH/3T3 línea celular de fibroblastos se imprimieron o sembradas en una superficie sumergida. Las células fueron cultivadas a una densidad de 5 X 10 4 células por ml. Se sembraron las células usando técnicas de cultivo celular tradicionales. Las células se imprimieron utilizando un gran formato, cabezal de impresión de células de doce flujo donde los canales son más grandes (~ 500 micras) que el CFM utilizado para las proteínas y otras biomoléculas. Las células se sembraron impresos o sobre una superficie recubierta de suero. El proceso de impresión se muestra en la Figura 1.
Después de la impresión y de la siembra, las células se visualizaron para evaluar la densidad y morfología en los puntos relevantes de tiempo (0, 2, 24, y 48 horas). La densidad celular y la morfología de las células en estos puntos de tiempo se evaluó a través de 10X y 40X aumentos microscópicamente. Las imágenes muestran que las células poseen fenotipos casi idénticos en cada punto de tiempo y en cada ampliación Figura 2. Sobre la base de estas cifras, el efecto deimpresión se determinó que era mínima.
La viabilidad celular se evaluó mediante una tinción PI. Como se muestra en la Figura 3, la viabilidad de la célula para la célula impreso no fue significativamente diferente de las células sembradas para cada punto de tiempo. La principal diferencia entre los dos métodos de fijación de las células a la superficie es la densidad de las células impresos. La densidad celular disminuye en el punto temporal hr 2 en más del 50% en ambas células sembradas e impresos. Nuevos estudios se requieren para determinar la causa de esta disminución; Sin embargo, los coeficientes de densidad general impresos en comparación con los cabeza de serie, sigue siendo significativamente más alto. La densidad celular impreso en la celda de flujo fue de aproximadamente diez veces más denso en cada punto de tiempo que las células sembradas células considerando se imprimen en la misma densidad que la siembra, pero en un área más pequeña (0,6 cm 2 de área para una celda de flujo, 3,8 cm 2 un pocillo de una placa de 24 pocillos). En el punto de tiempo final de las células se encuentran en la misma densidad Which es probablemente debido a la motilidad celular y las limitaciones de recursos de consumo.
Figura 1. (A) Imagen de la CFM. (B) Representación esquemática de una celda de flujo. (C) Imagen SEM de la cabeza de impresión que muestra células de flujo individuales. (D) Esquema de la impresión sumergida donde los muelles del cabezal de impresión a la superficie de cultivo de tejido compatible. Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes que comparan la morfología de la cabeza de serie frente a las células impresos. En (A) células 3T3se imprimieron microfluidically en BSA y evaluado a 0, 2, 24, y 48 h. En (B) células 3T3 se sembraron en lugar de imprimir. La morfología de las células es similar, si no idéntica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de la densidad celular y la viabilidad celular entre la impresión y la siembra de células en diversos puntos de tiempo, incluyendo 0, 2, 24, y 48 h. En (A) se evaluó la densidad celular en las células por mm 2. En (B) se determinó la viabilidad de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.
Figura 4. 10x imagen magnificación de cuatro celdas de flujo de los microarrays de células microspotter flujo continuo en el que las células NIH/3T3 hicieron fluir a través. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La tecnología de impresión 3D de microfluidos se describe aquí es el único capaz de microfluidically matrices de impresión de las células en un líquido lleno de bien, es decir, una superficie sumergida. Por la impresión sobre superficies sumergidas, de células microarrays se pueden producir que mantienen el fenotipo celular fisiológicamente relevante de las células, así como la capacidad de multiplexar las células en el fondo de un solo pozo Figura 4. Los resultados de este estudio muestran que microfluidically impresión de resultados en células fijación de las células con morfología celular comparable y viabilidad; Sin embargo, las células pueden ser impresos más densamente unidos en una ubicación definida que resulta en tiempos globales de estudio más cortos. Horas de estudio más cortos podrían resultar en ahorros significativos de costos para medicamentos de alto rendimiento de cribado 14.
Microfluídica se ha utilizado anteriormente para microarrays celulares y el cribado de fármacos de alto rendimiento. Docenas de estudios han detallado cómo los ensayos de flujo basadoeliminar los problemas de flujo estáticas; por desgracia, estos estudios se utiliza microfluidos 2D (que no debe confundirse con los cultivos de tejido en 2D y 3D), lo que limita la densidad, la multiplexación, y la integración del microscopio para el análisis altamente paralelas 15-19. Se han propuesto microfluídica digitales y microfluídica basada en gotitas para estos tipos de aplicaciones y pueden funcionar en paralelo altamente-, configuraciones multiplexados 15,17,18, pero que se limitan a grupos de células individuales o de pequeños y perder todo 3-D, de múltiples la estructura del tejido tipo de célula durante la preparación de la muestra. Alto rendimiento citometría de flujo se ha utilizado para el cribado rápido de las células; Sin embargo, la citometría de flujo requiere células a permanecer en suspensión, que no es ideal para el cribado de líneas celulares adherentes que, in vivo, están atados a la matriz extracelular 20. Co-culturas también sufren de la falta de una verdadera representación del tejido 19. En contraste, la tecnología 3D MFCA permite totalmente automatizado deposición de las biomoléculas y la entrega de reactivos para manchas de células o secciones de tejido intactas en una matriz densamente poblado. El sistema propuesto no sólo será capaz de generar las matrices, pero lo haría en un entorno de "fluir" que permite estudios de esfuerzos de corte, la entrega de los diferentes compuestos, y las condiciones de crecimiento en estas matrices y dará lugar a la droga más predictivos in vitro herramientas de detección. Una variedad de aplicaciones se puede prever que permite la innovación para continuar indefinidamente. Tal herramienta permite novedoso descubrimiento de fármacos celular y ensayos de cytotoxicological en una multitud de campos de investigación críticos, tales como el cáncer, la diabetes, la inflamación, infecciones, y enfermedades cardiovasculares.
Si bien la ACFM es el método preferido para administrar células a una superficie sumergida, el reto sigue siendo para unir la célula a la superficie, especialmente para líneas celulares no adherentes. Orientación futura de esta tecnología se centrará en métodos para la fijación de las células parala superficie. Actualmente existen técnicas para modelar celular en superficies artificiales e incluyen: la impresión de inyección de tinta, microextrusión o filamento de trazado, la hibridación de ADN, y la transferencia hacia adelante láser 21. De estas técnicas, la unión de las células que utilizan la tecnología de hibridación de ADN posee varias características únicas e importantes. En primer lugar, el método de unión de las células no depende de los receptores que poseen células individuales por lo que ambas células adherentes y no adherentes son capaces de ser modelado utilizando este método 22. Siguiente, el método de patrón celular de ADN permite la generación de matrices celulares complejas que comprenden muchos tipos de células mediante el uso de múltiples secuencias de ADN unidas a la superficie 23. Las futuras aplicaciones o direcciones se centrarán en el uso de la tecnología de hibridación de ADN para la fijación celular 19,24
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Disclosures
Los autores son los empleados y accionistas de Wasatch Microfluídica que produce reactivos y / o instrumentos utilizados en este manuscrito.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Chris Morrow para la asistencia técnica. La financiación fue proporcionada por NIH SBIR (R43) conceder 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous flow microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | Base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | Cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | Cell media additive |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | Cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | Stain cell sfor counting |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | Cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | Rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | Used to remove cells from surface |
References
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