Introduction
Os recentes avanços na indústria farmacêutica têm levado a um interesse crescente no uso de microarranjos de celulares no processo de descoberta de medicamentos para a triagem de drogas e cytotoxicological 1,2,3 análise. O desenvolvimento de ensaios in vitro de alto rendimento e métodos de rastreio utilizando microarrays de células facilitaria o desenvolvimento rápido e de baixo custo de candidatos da droga, bem como avanço a compreensão fundamental da célula 1,4. A abordagem tradicional de triagem com células usa plataformas bem-placa convencionais; No entanto, esta abordagem é limitada devido ao custo elevado, o rendimento limitado, e uma capacidade limitada para fornecer informação quantitativa sobre a função das células de 1,5. Devido a essas limitações, a pesquisa em tecnologias de microarray celular é crescente para a caracterização molecular biológica, engenharia de tecidos, e droga triagem 1,6. As vantagens de microarrays celulares incluem o uso de amostra menor, efeitos mínimos deheterogeneidade fenótipo celular mascarando informações, eo mais importante a capacidade de automatizar ensaios para mais aplicações de alto rendimento 1,7,8.
A indústria farmacêutica utiliza atualmente de alto rendimento à base de células testes de rastreio com 2D culturas em monocamada de células para triagem de drogas em locais bem microplacas 9. Células de multiplexagem em poços de placas de microtitulação oferece o potencial para um maior rendimento com opções de experimentação originais. Além disso, as actuais tecnologias de micromatrizes celulares permitem que as células para secar o que poderia alterar dramaticamente o fenótipo das células in vivo a partir de 10,11. A fim de superar estes problemas, o MFCA foi concebido e é mostrado na Figura 1. O design dos fluidos MFCA 3D permite que a ponta da cabeça de impressão da Figura 1 a ser baixada para dentro de um banho e comprimida contra a superfície de modo a formar uma vedação. A ponta de silicone macio da cabeça de impressão se comporta como umjunta e forma uma vedação reversível. A tecnologia MFCA é adequada exclusivamente para fazer a interface com superfícies submersas, que é necessário para ambas as culturas de células e sistemas fatia do tecido, e é difícil ou impossível com a maioria das outras abordagens. Pinos ou impressão a jato de tinta não vai funcionar, e dispositivos microfluídicos 2D não são adequados para a deposição ou interface com grandes conjuntos de pontos discretos. Além disso, ao miniaturizar e localizando o experimento - microarray celular - o MFCA supera os principais problemas associados com a de alto rendimento à base de células de ensaios de rastreio.
O CFM utiliza redes de canais 3D para ciclo de pequenas amostras de fluido de volume mais localizações pontuais microscópicas em uma superfície de 12,13. Ao imprimir com fluxo, biomoléculas, as células e os outros reagentes são mantidos em meio líquido durante todo o processo de impressão, permitindo a impressão de biomoléculas sensíveis e células, sem exposição ao ar, o que dificulta as técnicas de impressão de células actuais. É também possível imprimir directamente a partir de material em bruto, tais como sobrenadantes de hibridoma, ou, desde que exista um mecanismo de captura na superfície da matriz. O objetivo deste artigo é explicar em detalhes a impressão submersa de dois tipos de células em uma superfície.
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Protocol
1. Célula Preparação Cultura
- Guarde os estoques celulares NIH/3T3 em nitrogênio líquido até que esteja pronto para uso.
- Preparar meio completo para células NIH/3T3 utilizando Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, tampão HEPES 10 mM, 50 unidades / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina.
- Descongelar as células para 2-3 min num banho de água com agitação a 37 ° C.
- Ressuspender as células em 5 ml de meio completo e centrifugar a 1500 g durante 3 min.
- Retirar o sobrenadante celular, sem perturbar o sedimento celular.
- Ressuspender as células em 5 ml de meio e contar as células utilizando um hemocitómetro.
- Retirar 10 mL da suspensão de células e colocar num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
- Adicionar 10 ul de azul de tripano para a suspensão de células e agitar com a ponta da pipeta.
- Pipetar 10 ul de células coradas para uma câmara de hemocitómetro.
- Contagem de células em hemocitómetro na 10xampliação.
- Contar as células vivas (bolas pequenas, brancas) para 4 dos 9 grandes praças. Só contar as células vivas que não aparecem azul escuro da mancha Trypan Blue.
- Calcula-se a média do número de células por quadrado grande, resultando em o número de células de 4 x 10 células / ml na suspensão inicial de células.
- Células de sementeira a uma densidade de 1 x 10 5 células / ml, com um total de 5 mL em cada frasco T25.
- Células de cultura para entre 70% e 80% de confluência antes dos experimentos iniciais. Atualizar mídia a cada 2-3 dias ou quando necessário.
2. Printing Preparação da Superfície
- Mark um rectângulo com marcador na parte inferior de uma tratados com cultura de tecidos de poliestireno (TCTPS) placa de 12 poços do tamanho da cabeça de impressão (7 mm × 19 mm).
- Pipetar 50 mL de soro fetal bovino para a área retangular e espalhe-o sobre toda a região com a ponta.
- Deixe a placa de Petrinum estéril biossegurança capuz O / N para permitir que o ponto de soro para secar completamente. Estas placas devem ser preparado não mais do que dois dias antes da utilização.
3. Impressão Submerso
- Lavar a cabeça de impressão com água destilada.
- Encha uma 60 milímetros placa de Petri com água destilada e encaixar a cabeça de impressão para a superfície.
- Fluxo de água destilada através de cada uma das linhas de 2 min a 150 mL / min usando uma bomba pneumática.
- Descarte a água da placa de Petri e encha-o com água limpa.
- Mova a cabeça de impressão para cima e para baixo na água três vezes.
- Encaixe o centro da cabeça de impressão sobre o local revestido de soro na pré-preparados placa de 12 poços.
- Primeiro a cabeça de impressão com a mídia completas pré-aquecido, a 300 mL por canal.
- Imprimir células suspensas a uma concentração de 50.000 células / mL sobre a superfície e 60 mL / min, 100 ul por canal.
- Coloque a cabeça de impressão, deixou ancorado contra osuperfície, e o colector, num incubador de cultura de células definido para 5% de CO 2 e 37 ° C durante 2 horas.
- Após a incubação de 2 horas, remover a cabeça de impressão e colocar a tampa no prato de cultura. O momento em que a cabeça de impressão removido é considerado o ponto de tempo 0 h.
4. Cultura de Células Padrão
- Adicionar 1 ml de meio pré-aquecido a uma das TCTPS de 12 poços da placa de soro-manchado, preparado no passo 2.
- Tomar 1 ml da suspensão de células remanescente a partir do passo 2 e da pipeta num único poço de um de 12 poços TCTPS placa. Isto vai produzir uma cultura contendo 50.000 células no recipiente.
- Colocar a placa de cultura de células dentro de uma incubadora a 37 ° C durante 2 horas.
- Após a incubação de 2 horas iniciar a temporização,; para a consistência entre as amostras impressas e semeadura, este é considerado o ponto de tempo 0 h.
5. Visualization Cultura
- Depois de 0, 2, 24, e 48 horas as células tomada de cada um dos dois métodos described acima e imagem usando um microscópio invertido padrão.
- Corar as células com iodeto de propídio, um corante vermelho fluorescente que apenas é incorporado no núcleo de células mortas.
- Lave as células 3 vezes com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio (PBS + +) para remover todos os detritos.
- Adicionar 1 ml de pré-aquecido PBS + + para cada recipiente de cultura.
- Adicionar 1 ml de solução de estoque de iodeto de propídio (1 mg / ml) a cada recipiente de cultura.
- Incubar as células coradas com iodeto de propídio a 37 ° C durante 10 min.
- Imagem as células usando um microscópio invertido em 10x e 40x.
- Corar as células com iodeto de propídio, um corante vermelho fluorescente que apenas é incorporado no núcleo de células mortas.
- Descarte as pilhas em um recipiente apropriado de risco biológico.
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Representative Results
As células NIH/3T3 de linha de células de fibroblastos foram semeados em impressos ou uma superfície submersa. As células foram cultivadas a uma densidade de 5 X 10 4 culas por ml. As células foram semeadas utilizando técnicas de cultura de células tradicional. As células foram impressas utilizando uma grande formato, doze fluxo cabeçote célula, onde os canais são maiores (~ 500 mm) do que a utilizada para CFM proteínas e outras biomoléculas. As células foram semeadas ou impresso sobre uma superfície revestida de soro. O processo de impressão está representada na Figura 1.
Após a impressão e a sementeira, as células foram visualizadas para avaliar a densidade e morfologia em pontos relevantes de tempo (0, 2, 24, e 48 h). A densidade de células e morfologia das células em todos esses momentos foi avaliada através de 10X e 40X ampliações microscopicamente. As imagens mostram que as células possuem fenótipos quase idênticas em cada ponto de tempo e cada ampliação Figura 2. Com base nestes valores, o efeito deimpressão estava determinado a ser mínima.
A viabilidade celular foi avaliada através de uma mancha PI. Como mostrado na Figura 3, a viabilidade celular para a célula impresso não foi significativamente diferente das células semeadas para cada ponto de tempo. A principal diferença entre os dois métodos de fixar as células à superfície é a densidade das células impressos. Densidade celular diminui no ponto 2 hr tempo por mais de 50% em ambas as células sem sementes e impressos. Mais estudos são necessários para determinar a causa desta diminuição; contudo, razões de densidade global impresso quando comparado com sementes é ainda significativamente mais elevada. A densidade celular impresso na célula de fluxo foi de aproximadamente dez vezes mais densa, em cada ponto de tempo em que as células semeadas células considerando foram impressas com a mesma densidade que a semeadura, mas em menor área (0,6 cm2 de área para uma célula de fluxo, 3,8 cm 2 para um poço de uma placa de 24 poços). No ponto de tempo final, as células são na mesma densidade which é provavelmente devido a motilidade celular e recursos limitações de consumo.
Figura 1. (A) Imagem do CFM. (B) Esquema de uma célula de fluxo. (C) SEM Imagem da cabeça de impressão, mostrando células de fluxo individuais. (D) Esquema de impressão submerso onde docas da cabeça de impressão para a superfície compatível cultura de tecidos. favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens comparando a morfologia de células semeadas contra impressos. Em (A), células 3T3microfluidically foram impressas em BSA e avaliada a 0, 2, 24, e 48 horas. Em (B), células 3T3 foram semeados em vez de impresso. A morfologia das células é semelhante, se não idêntico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação da densidade celular e da viabilidade das células entre a impressão e sementeira de células em vários pontos de tempo, incluindo 0, 2, 24, e 48 h. Em (A), foi avaliada a densidade celular em células por mm 2. Em (B) a viabilidade das células foi determinada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figure.
Figura 4. 10x imagem ampliação de quatro células de fluxo do microarray de células microspotter fluxo contínuo em que as células NIH/3T3 foram fluía. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A tecnologia de impressão 3D microfluídicos aqui descrito é o único capaz de matrizes de impressão microfluidically de células em um líquido bem cheio, ou seja, uma superfície submersa. Ao imprimir sobre as superfícies submersas, microarrays de célula pode ser produzida que manter o fenótipo celular fisiologicamente relevante das células, bem como a capacidade para multiplexar as células no fundo de um único poço Figura 4. Os resultados deste estudo mostram que microfluidically impressão resultados em células a fixação das células com a morfologia das células comparáveis e viabilidade; No entanto, as células podem ser impressos mais densamente ligado num local definido, resultando em tempos de estudo globais mais curtos. Tempos de estudo mais curtos podem resultar em significativa redução de custos para a alta taxa de transferência de drogas rastreio 14.
Microfluídica tem sido usado anteriormente para microarrays celulares e triagem de drogas de alto rendimento. Dezenas de estudos têm detalhou como fluxo de ensaios baseadoseliminar os problemas de fluxo estáticas; Infelizmente, esses estudos utilizam a microfluídica 2D (para não ser confundido com culturas de tecidos em 2D e 3D), o que limita a densidade, multiplexação e integração microscópio para análises altamente paralelos 15-19. Microfluídica digitais e microfluídica baseada em gotículas têm sido propostos para estes tipos de aplicações e pode operar em ambientes altamente paralelos, configurações multiplexados 15,17,18, mas eles estão limitados a grupos de células individuais ou pequenos e perder tudo em 3-D, multi- estrutura do tecido tipo celular durante a preparação da amostra. Alta capacidade de citometria de fluxo tem sido utilizada para triagem celular rápida; no entanto, a citometria de fluxo requer células que permanecem em suspensão, o que não é ideal para o rastreio de linhas de células aderentes, que, in vivo, são amarrados a matriz extracelular 20. Co-culturas também sofrem de falta de representação tecido verdadeiro 19. Em contraste, a tecnologia permite MFCA 3D de totalmente automatizadoposição de biomoléculas e entrega de reagente a manchas celulares ou fatias de tecido intacto em uma matriz densamente. O sistema proposto não só seria capaz de gerar matrizes, mas iria fazê-lo em um ambiente de "fluxo", que permite o estudo de tensões de cisalhamento, a entrega de compostos diferentes, e as condições de crescimento sobre estas matrizes e vai levar a droga mais preditivos in vitro ferramentas de triagem. A variedade de aplicações pode ser vislumbrada permitindo inovação para continuar indefinidamente. Essa ferramenta permite novela descoberta de drogas celular e ensaios cytotoxicological em uma infinidade de campos críticos de pesquisa, tais como câncer, diabetes, inflamação, infecções e doença cardiovascular.
Enquanto o MFCA é o método preferido para entregar células para uma superfície submersa, permanece o desafio para prender a pilha para a superfície, em especial para linhas de células não-aderentes. Direções futuras para esta tecnologia incidirá sobre os métodos de fixação das células paraa superfície. Técnicas para padronização de células em superfícies artificiais atualmente existem e incluem: impressão jato de tinta, microextrusion ou filamento de plotagem, hibridização de DNA, eo laser de transferência para a frente 21. Destas técnicas, a ligação de células que utilizam a tecnologia de hibridação de ADN possui várias características únicas e importantes. Em primeiro lugar, o método de ligação de células não depende de receptores possuídas por células individuais para ambas as células aderentes e não aderentes são capazes de ser modelada usando este método 22. Em seguida, o método de padronização ADN celular permite a geração de matrizes celulares complexas compreendendo vários tipos de células, através da utilização de várias sequências de ADN ligadas à superfície 23. As aplicações futuras ou direções incidirá sobre o uso de tecnologia de hibridização de DNA para a fixação das células 19,24
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Disclosures
Os autores são funcionários e acionistas de Wasatch microfluídica que produz reagentes e / ou instrumentos utilizados neste manuscrito.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Chris Morrow para assistência técnica. O financiamento foi fornecido pelo NIH SBIR (R43) conceder 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous flow microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | Base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | Cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | Cell media additive |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | Cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | Stain cell sfor counting |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | Cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | Rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | Used to remove cells from surface |
References
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