Introduction
Nylige fremskridt inden for den farmaceutiske industri har ført til en øget interesse for at bruge cellulære microarrays i drug discovery processen for narkotika screening og cytotoxicological analyse 1,2,3. Udviklingen af in vitro-high-throughput assays og screeningsmetoder bruger celle microarrays vil lette en hurtig og omkostningseffektiv udvikling af lægemiddelkandidater samt forhånd grundlæggende forståelse af cellen 1,4. Den traditionelle tilgang til screening med celler anvender konventionelle vel-plade platforme; men denne fremgangsmåde er begrænset på grund af de høje omkostninger, begrænset gennemløb, og begrænset evne til kvantitativ information om celle funktion 1,5. På grund af disse begrænsninger er forskning i cellulær microarray teknologi spirende for molekylærbiologisk karakterisering, tissue engineering, og narkotika screening 1,6. Fordelene ved cellulære microarrays omfatter mindre stikprøve brug, minimale effekter afcellefænotypen heterogenitet maskering information, og vigtigst evnen til at automatisere analyser til mere high-throughput applikationer 1,7,8.
Den farmaceutiske industri i øjeblikket udnytter high-throughput cellebaserede screeningsbestemmelser med 2D celle monolagskulturer til drug screening i mikrotiterbrønd plader 9. Multiplexing celler i brønde af mikrotiterplader rummer muligheder for højere gennemløb med unikke eksperimenter muligheder. Endvidere er de nuværende teknologier til cellulære microarrays lade cellerne tørre som kan dramatisk ændre fænotypen af celler fra in vivo 10,11. For at overvinde disse problemer blev MFCA manipuleret og er vist i fig. 1. Udformningen af MFCA 3D fluidik muliggør skrivehovedet spids i figur 1 til at blive sænket ned i et bad og komprimeres mod en overflade for at danne en forsegling. Den bløde silikone spidsen af skrivehovedet opfører sig som enpakning og danner en reversibel forsegling. Den MFCA teknologi er unikt egnet til at interface med neddykkede overflader, som er nødvendig for både cellekulturer og væv slice systemer, og det er vanskeligt eller umuligt med de fleste andre metoder. Stifter eller inkjet-print vil ikke fungere, og 2D mikrofluidenheder er ikke egnet til deponering eller sammenknytning med store arrays af diskrete pletter. Yderligere, ved miniaturisering og lokalisere eksperimentet - det cellulære microarray - den MFCA overvinder de store problemer i forbindelse med high-throughput cellebaserede screeningsassays.
CFM bruger 3D-kanal netværk til at cykle små volumen væskeprøver end mikroskopiske spot steder på en overflade 12,13. Ved at udskrive med flow, biomolekyler, celler og andre reagenser opbevares i et flydende miljø i hele trykprocessen, muliggør udskrivning af følsomme biomolekyler og celler uden eksponering for luft, hvilket hindrer de aktuelle celle trykteknikker. Det er også muligt at udskrive direkte fra rå materiale såsom hybridom eller supernatanter forudsat der er en fange mekanisme på array'et overflade. Formålet med dette manuskript er at forklare i detaljer den neddykkede trykning af to celletyper på en overflade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur Fremstilling
- Opbevar NIH/3T3- celle lagre i flydende nitrogen indtil den er klar til brug.
- Forbered komplette medier til NIH/3T3-celler ved hjælp af Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 10 mM HEPES-buffer, 50 enheder / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin.
- Optø celler til 2-3 minutter i et rystevandbad ved 37 ° C.
- Resuspender cellerne i 5 ml komplette medier og centrifugeres ved 1500 xg i 3 min.
- Fjern cellesupernatanten uden at forstyrre cellepelleten.
- Resuspender cellerne i 5 ml medier og tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Fjern 10 pi af cellesuspensionen og anbringes i et 0,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 10 ul af trypanblåt til cellesuspensionen og omrøres med spidsen af pipetten.
- Afpipetteres 10 ul af de farvede celler i et hæmocytometer kammer.
- Tæl celler i hæmocytometer 10xforstørrelse.
- Tæl levende celler (små, hvide bolde) for 4 af de 9 store kvadrater. Tæller kun de levende celler, der ikke fremgår mørkeblå fra trypanblåt pletten.
- Beregn det gennemsnitlige antal celler pr store firkantede, hvilket resulterer i antallet af celler x 10 4 celler / ml i den oprindelige cellesuspension.
- Seed celler ved en densitet på 1 x10 5 celler / ml med i alt 5 ml i hver T25 kolbe.
- Kultur celler til mellem 70% og 80% konfluens, før du begynder eksperimenter. Opdater medie hver 2-3 dage eller efter behov.
2.. Udskrivning Forbehandling
- Markér et rektangel med markør på bunden af en vævs-kultur behandlet polystyren (TCTPS) 12 godt plade størrelsen af printhovedet (7 mm x 19 mm).
- Tilsæt 50 ul af føtalt bovint serum i det rektangulære område og sprede det over hele regionen med spidsen.
- Lad petriskåleni en steril biosikkerhed hætte O / N til at tillade serum stedet for at tørre helt. Disse plader skal være forberedt ikke mere end 2 dage før brug.
3.. Oversvømmet udskrivning
- Skyl printhovedet ud med destilleret vand.
- Fyld en 60 mm petriskål med destilleret vand og forankre printhovedet på overfladen.
- Flow destilleret vand gennem hver af linjerne i 2 minutter ved 150 ul / min ved hjælp af en pneumatisk pumpe.
- Kassér vandet fra petriskålen og fyld den med rent vand.
- Flyt printhovedet op og ned i vandet 3 gange.
- Dock printhovedet midten af den serum-belagt stedet i forberedte 12 brønde.
- Prime printhovedet med forvarmet komplette medier, 300 pi per kanal.
- Print suspenderes celler i en koncentration på 50.000 celler / ml på overfladen og 60 ul / min, 100 pi per kanal.
- Placer printhovedet, venstre kuperet modoverfladen, og manifolden i en cellekultur inkubator indstillet til 5% CO2 og 37 ° C i 2 timer.
- Efter 2 timers inkubation fjernes printhovedet og læg låget på kultur fad. Det tidspunkt, hvor skrivehovedet fjernet anses 0 hr tidspunkt.
4.. Standard Cell Culture
- Der tilsættes 1 ml forvarmet medier til en af serum-spotted TCTPS plade med 12 brønde fremstillet i trin 2.
- Tag 1 ml af den resterende cellemasse suspension fra trin 2 og pipette i en enkelt brønd i en 12-brønds TCTPS plade. Dette vil frembringe en kultur indeholdende 50.000 celler i skålen.
- Placer celledyrkningspladen i en inkubator ved 37 ° C i 2 timer.
- Efter 2 timers inkubation begynder tidsplanen; sammenhæng mellem trykte og seeding prøver, anses dette 0 hr tidspunkt.
5.. Culture Visualisering
- Efter 0, 2, 24 og 48 timers take celler fra hver af de to metoder described ovenfor, og billedet ved hjælp af et standard omvendt mikroskop.
- Farv cellerne ved hjælp af propidiumiodid, et rødt fluorescerende plet, der kun er inkorporeret i kernen af døde celler.
- Forsigtigt skylles cellerne 3 gange med 1 ml phosphatbufret saltvand med calcium og magnesium (PBS + +) for at fjerne eventuelle rester.
- Der tilsættes 1 ml forvarmet PBS + + til hver kultur fartøj.
- Tilsæt 1 pi propidiumiodid stamopløsning (1 mg / ml) til hver kultur fartøj.
- Inkubér cellerne farvet med propidiumiodid ved 37 ° C i 10 min.
- Billede cellerne ved hjælp af et inverteret mikroskop på 10x og 40x forstørrelse.
- Farv cellerne ved hjælp af propidiumiodid, et rødt fluorescerende plet, der kun er inkorporeret i kernen af døde celler.
- Kassér cellerne i en egnet beholder til smittefarligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fibroblast cellelinie NIH/3T3-celler blev trykt eller podet på en nedsænket overflade. Cellerne blev dyrket til en densitet på 5 x 10 4 celler pr ml. Celler blev podet ved hjælp af traditionelle cellekulturteknikker. Celler blev trykt ved hjælp af et stort format, tolv strømningscelle printhovedet hvor kanalerne er større (~ 500 um) end CFM anvendes til proteiner og andre biomolekyler. Cellerne blev trykt eller podet på et serum overflade. Trykningen er vist i figur 1.
Efter trykning og podning blev cellerne visualiseret at vurdere tæthed og morfologi ved relevante tidspunkter (0, 2, 24 og 48 timer). Celledensiteten og morfologi af cellerne på disse tidspunkter blev vurderet ved anvendelse af 10X og 40X forstørrelse mikroskopisk. Billederne viser, at cellerne besidder næsten identiske fænotyper på hvert tidspunkt og på hver forstørrelse Figur 2.. Baseret på disse tal, effekten afudskrivningen blev bestemt til at være minimal.
Cellelevedygtigheden blev vurderet ved anvendelse af en PI-farvning. Som vist i figur 3, cellelevedygtigheden den udskrevne celle var ikke signifikant anderledes end de podede celler for hvert tidspunkt. Den største forskel mellem de to metoder til fastgørelse af cellerne til overfladen er massefylden af cellerne udskrives. Celledensitet mindskes på 2 hr tidspunkt med over 50% i begge udsåede og trykte celler. Yderligere undersøgelse er påkrævet for at fastslå årsagen til dette fald; Dog samlet trykt massefylde nøgletal i forhold til seeded stadig væsentligt højere. Den trykte celledensitet i flow-cellen var cirka ti gange så tæt på hvert tidspunkt som de udsåede celler overvejer celler blev trykt på samme densitet som podning, men i et mindre område (0,6 cm2 område for en strømningscelle, 3,8 cm 2 for en brønd i en 24-brønds plade). Ved den afsluttende tidspunkt cellerne er i den samme tæthed which skyldes sandsynligvis celle motilitet og ressourcemæssige begrænsninger forbrug.
Figur 1.. (A) Billede af CFM. (B) Skematisk af et flow celle. (C) SEM Billede af printhovedet viser individuelle flowcells (D) Skematisk af neddykket trykning, hvor printhovedets dokker til vævskultur kompatibel overflade.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Billeder sammenligner morfologi podet versus trykte celler. I (A) 3T3-cellerblev microfluidically printet på BSA og vurderet ved 0, 2, 24 og 48 timer. I (B) 3T3-celler blev podet i stedet for udskrives. Cellemorfologien er lignende, hvis ikke identiske. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 3. Sammenligning af celletæthed og levedygtighed mellem celle trykning og cellepodning på forskellige tidspunkter, herunder 0, 2, 24 og 48 timer. I (A) blev celletætheden i celler pr mm 2 vurderes. I (B) levedygtigheden af cellerne blev bestemt. Klik her for at se en større version af dette figure.
Figur 4.. 10x forstørrelse billede af fire flow-celler i cellen microarray kontinuerligt flow microspotter hvor NIH/3T3-celler blev flød gennem. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D mikrofluid printteknologi beskrevet her er unikt i stand til microfluidically trykning arrays af celler i en væske fyldt godt, dvs en nedsænket overflade. Ved trykning på neddykkede overflader, kan celle microarrays produceres der opretholder det fysiologisk relevante cellulære fænotype af celler såvel som evnen til at multiplekse cellerne i bunden af en enkelt brønd fig. 4. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at microfluidically udskrivning celler resulterer i cellefæstnelse med sammenlignelig cellemorfologi og levedygtighed; imidlertid kan de trykte celler tættere fastgjort i en defineret placering resulterer i kortere samlede undersøgelse gange. Kortere studietid kunne resultere i væsentlige besparelser for high throughput narkotika screening 14.
Microfluidics har tidligere været anvendt til cellulære microarrays og high-throughput lægemiddel-screening. Snesevis af undersøgelser har beskrevet hvordan flow assayseliminere de statiske flow spørgsmål; Desværre er disse undersøgelser bruger 2D microfluidics (ikke at forveksle med 2D-og 3D vævskulturer), hvilket begrænser tæthed, multiplexing og mikroskop integration til meget parallelle analyser 15-19. Digitale mikrofluidik og dråbe-baserede MicroFluidics er blevet foreslået til disse typer af applikationer og kan operere i højt parallel, multiplex konfigurationer 15,17,18, men de er begrænset til en enkelt eller små cellegrupper og miste alle 3-D, multi- celletype vævsstrukturen under forberedelsen. High throughput flowcytometri er blevet udnyttet til hurtig celle screening; imidlertid flowcytometri kræver celler til at forblive i suspension, hvilket ikke er ideelt til screening adhærente cellelinier, in vivo, er tøjret til ekstracellulær matrix 20. Co-kulturer også lider af mangel på ægte væv repræsentation 19. I modsætning hertil 3D MFCA teknologi gør det muligt fuldt automatiseret destilling af biomolekyler og levering af reagens celle pletter eller intakte vævssnit i en tætpakket opstilling. Den foreslåede ordning vil ikke blot være i stand til at generere arrays, men ville gøre det i en "flyder" miljø, der giver mulighed for studier af forskydningsspændinger, levering af forskellige forbindelser og vækstbetingelser på disse arrays og vil føre til mere forudsigende in vitro drug screening værktøjer. En række applikationer kan forestillede tillader innovation for at fortsætte i det uendelige. Et sådant værktøj gør det muligt roman cellulære lægemiddelforskning og cytotoxicological analyser i et væld af kritiske forskningsfelter som kræft, diabetes, inflammation, infektioner og hjertekarsygdomme.
Mens MFCA er den foretrukne metode til at levere celler til en nedsænket overflade udfordringen er at fastgøre cellen til overfladen, især for ikke-adhærerende cellelinjer. Fremtidige retninger for denne teknologi vil fokusere på metoder til cellebinding foroverfladen. Øjeblikket findes teknikker til celle mønster på kunstige overflader og omfatter: inkjet print, microextrusion eller filament plotte, DNA-hybridisering, og laser fremad transfer 21. Af disse teknikker, fastgørelse af celler ved hjælp af DNA-hybridisering teknologi besidder flere unikke og vigtigste funktioner. Først fremgangsmåden cellevedhæftning er ikke afhængig af receptorer besat af individuelle celler, så begge adhærerende og ikke-adhærerende celler er i stand til at blive mønstret ved hjælp af denne metode 22. Dernæst DNA cellulære mønster fremgangsmåde giver mulighed for generering af komplekse cellulære arrays omfatter mange celletyper gennem brug af flere overfladebundne DNA-sekvenser 23. Fremtidige applikationer eller retninger vil fokusere på at bruge DNA-hybridisering teknologi til cellevedhæftning 19,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er ansat og aktionærer i Wasatch Microfluidics der producerer reagenser og / eller instrumenter, der anvendes i dette manuskript.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Chris Morrow for teknisk assistance. Finansieringen blev leveret af NIH SBIR (R43) giver 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous flow microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | Base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | Cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | Cell media additive |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | Cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | Stain cell sfor counting |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | Cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | Rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | Used to remove cells from surface |
References
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. , Springer. (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
