Summary

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Published: January 22, 2014
doi:

Summary

Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Abstract

Rekombinantes Protein Engineering hat Escherichia coli verwendet (E. coli) Expressionssystemen fast 4 Dekaden, und heute E. coli ist immer noch das am häufigsten verwendete Wirtsorganismus. Die Flexibilität des Systems erlaubt die Zugabe von Einheiten, wie eine Biotin-Tag (für Streptavidin Wechselwirkungen) und größere funktionelle Proteine ​​wie das grün fluoreszierende Protein oder kirschrot Protein. Auch hat die Integration von unnatürlichen Aminosäuren wie Metallionenchelatoren, eindeutig reaktiven funktionellen Gruppen, spektroskopische Sonden und Moleküle verleihen posttranslationale Modifikationen bessere Manipulation von Proteineigenschaften und Funktionen aktivieren. Als Ergebnis dieser Technik schafft anpassbare Fusionsproteine, die erheblichen Nutzen für verschiedene Forschungsfelder zu bieten. Genauer gesagt, hat die biotinylatable Proteinsequenz in viele Zielproteine ​​wegen der hohen Affinität zwischen Biotin Wechselwirkung mit Avidin und Streptavidin übernommen. Dieser Zusatz hat die Verbesserung Detektion und Reinigung des markierten Proteine ​​als auch der Weg für sekundäre Anwendungen wie Zellsortierung unterstützt. So Biotin-markierte Moleküle zeigen einen zunehmenden und großen Einfluss in bioindustriellen und Biomedizin. Für die Zwecke unserer Forschung haben wir rekombinante biotinylierte Fusionsproteine, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und semaphorin3A (Sema3A) Funktionsbereiche entwickelt. Wir haben früher, wie diese biotinylierte Fusionsproteine ​​zusammen mit anderen aktiven Proteinsequenzen können Biomaterialien für das Tissue Engineering und regenerative Zwecke gebunden werden berichtet. Dieses Protokoll beschreibt die Grundlagen der Ingenieur biotinylatable Proteine ​​an der Milligramm-Maßstab unter Verwendung einer T7-lac-induzierbaren Vektor-und E. coli-Expressionswirte, ab Transformation zum Scale-up und Reinigung.

Introduction

Proteine ​​umfassen eine breite Palette von Biomolekülen, die für viele biologische Funktionen verantwortlich sind, letztlich um die richtige Gewebebildung und Organisation führt. Diese Moleküle zu initiieren Tausende von Signalwegen, die Hochregulierung und / oder Herunterregulierung von Genen und anderen Proteinen zu steuern, die Aufrechterhaltung Gleichgewicht innerhalb des menschlichen Körpers. Störung eines einzelnen Proteins beeinflusst diese gesamte Bahn von Signalen, die zu Beginn der verheerenden Störungen oder Krankheiten führen kann. Engineering einzelnen Proteine ​​im Labor bietet eine Lösung zur Bekämpfung dieser Nebenwirkungen und bietet eine Alternative zu niedermolekularen Wirkstoffen. 1977, ein Gen, das 14 Aminosäuren Somatostatin-Sequenz, einer der ersten Werk Polypeptide unter Verwendung von E. geschaffen coli ein. Bald nach 1979 wurde Insulin in pBR322 kloniert, transformiert, ausgedrückt und gereinigt 2. Seitdem haben rekombinanten Proteinen, ihren Einfluss, um mehrere Felder der Rechts erweitertSuche wie Biomaterialien, Wirkstofftransport, Gewebetechnik, Bio-Pharmazie, Landwirtschaft, industrielle Enzyme, Biokraftstoffe, etc. (siehe Referenzen für Bewertungen 3-8). Dies ist weitgehend auf die Vielseitigkeit, die das Verfahren bietet über die Zugabe von anwendungsspezifischen chemischen Einheiten oder Proteinsequenzen zu Zwecken einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zielproteinidentifizierung, Stabilisierung und Reinigung begrenzt.

Über rekombinante DNA-Technologie können rekombinante Proteine ​​in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtssystemen, einschließlich Säuger-, Pflanzen-, Insekten-, Hefe-, Pilz oder Bakterien exprimiert werden. Jeder Host bietet verschiedene Vorteile und in der Regel das beste System wird auf der Grundlage der Proteinfunktion, Ertrag, Stabilität, Gesamtkosten und Skalierbarkeit bestimmt. Bakterien-Zellen fehlen oft die post-translationale Modifikation Mechanismen, die eukaryotischen Wirten (dh Glykosylierung, Disulfidbrücken, E tc.) 5. Als Ergebnis Säuger-und Insekten-Systemen in der Regel eine bessere Kompatibilität und die Expression von eukaryontischen Proteinen führen, aber diese Rechner sind in der Regel teuer und zeitaufwendig 9. Daher E. coli ist der bevorzugte Wirt für unsere Expressionssystem, da die Zellen rasch expandieren in preiswerten Wachstumsbedingungen und die genetische Expression Mechanismen sind gut verstanden 5,9. Zusätzlich ist dieses System leicht trotz des Fehlens von posttranslationalen Modifikationen 10 Scale-up für Produktionszwecke und die Ergebnisse in funktionelle Proteine. Die E. coli K12 Stamm wird in diesem Protokoll für das Klonen gewählt, weil dieser Stamm bietet ausgezeichnete Plasmid-Ausbeuten bezogen auf hohe Transformationseffizienz. Darüber hinaus wird ein E. coli-Stamm BL21 zur Expression verwendet werden, da diese Wirtsstamm enthält die T7-RNA-Polymerase-Gen, gesteuert Protein Expression und Stabilität 11 liefert.

Zelt "> Nach Hostauswahl müssen weitere Pflege in der Wahl des geeigneten Expressionsvektor ausgewählt und gesteuert Proteinexpression zu erleichtern aufgenommen werden. Synthese von rekombinanten Proteinen beginnt mit einem Ziel-DNA-Sequenz, die unter der Leitung des Bakteriophagen T7 Transkriptions-und Translationssignale kloniert wird, und Expression in Wirtszellen, die chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gen 12 enthält, induziert. Diese Vektoren, aus dem Plasmid pBR322 (für einen Überblick siehe Referenz 13), fest mit dem T7-Promotor zunächst von Studier und Mitarbeiter entwickelten 14 gesteuert und zusätzliche Steuerung durch die Einbeziehung der lac-Operator-lac-Repressor (LAC1) 15,16. Für die rekombinante Proteintechnik bietet das Expressionssystem die Fähigkeit, eine spezifische Aminosäuresequenz eines gewünschten Proteins durch Einsetzen verschiedener DNA-Zielsequenzen anzupassen oder um Fusionsproteine ​​zu erzeugen bis kombinierter Domain gemachts von einzelnen Proteinen. Darüber hinaus können einige Vektorreihe umfassen Peptid-Tag Modifikationen am N-oder C-Terminus angeordnet werden. Unser Gestaltungszwecken wurde ein Histidin (His)-Tag an die DNA-Zielsequenz zur Reinigung aufgenommen und 15 Aminosäure biotinylatable Sequenz wurde für die Biotinylierung 17,18 enthalten. In diesem Protokoll ein Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthält, wurde ausgewählt, um unsere biotinylatable Fusionsprotein-Sequenzen tragen. Die Expression wird in diesem Vektor durch T7-lac-Promotor kontrolliert und ist leicht mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert.

Test Ausdrücke (kleine Kulturen) werden verwendet, um das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins, das entweder in einer löslichen oder unlöslichen Form zu formulieren Reinigungsverfahren ausgedrückt werden kann zu bestimmen. Ein lösliches Protein innerhalb der Bakterienzelle exprimiert wird spontane Faltung unterziehen, um seine native Struktur 19 zu halten. Typischerweise ist die MutterStruktur ist thermodynamisch günstig. In vielen Fällen ist die Stoffwechselaktivität der Rechner ist nicht förderlich für das Zielprotein, indem Druck auf das System, um die unlöslichen Proteinproduktion und die Bildung von Einschlusskörpern von unlöslichen Proteinaggregaten zusammen führt. Damit das Zielprotein denaturiert, wodurch sie im allgemeinen biologisch inaktiven 20. Beide Test Ausdrücke vergrösserte und Isolationsverfahren sind durch die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt wird. Eine weitere Renaturierung oder Rückfaltungsschritt für unlösliche Proteine ​​erforderlich. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​können weiter unter Verwendung von Grßenausschluß-Chromatographie gereinigt werden.

Im Haus bietet rekombinanten Proteinproduktion Kostenvorteile gegenüber kommerziellen Produkten seit Milligramm Zielprotein pro Liter Hauptkultur isoliert werden. Die meisten der benötigten Ausrüstung ist in einer typischen biologischen oder chemischen Labor erhältlich. Protein-Engineering ermöglicht die Erzeugungvon kundenspezifischen Fusionsproteine ​​mit zusätzlichen Funktionen, die nicht im Handel erhältlich sind immer. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Verfahren in der Technik rekombinanten Proteinen beteiligt. Mit diesem Expressionssystem haben wir viele biotinylatable Proteine, wie Interferon-gamma, Plättchenwachstumsfaktor, Knochen-morphogenetisches Protein 21-23 angelegt, aber wir werden auf zwei Proteine, die wir für Axon Führung, NGF (29 kDa ausgebildet konzentrieren ) und Sema3A (91 kDa) 10 (für eine Übersicht siehe Referenz 24). Biotinylierung ist eine übliche Technik zur Identifizierung, Isolierung und Immobilisierung der markierten Proteine ​​unter Verwendung der bekannten Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung 25-27. Biophysikalischen Sonden 28,29, Biosensoren 30 und Quantenpunkte 31 sind Beispiele von Systemen, die hohe Affinität von Biotin-Streptavidin Konjugation mit einem K d in der Größenordnung von 10 -15 M 27 nutzen. Die E. coli bioZinn-Ligase BirA, unterstützt die kovalente Bindung von Biotin an die Lysin-Seitenkette in der Biotin-markierten Sequenz gefunden 18,32. Tethering Biotin an Werkstoffen und Biomolekülen hat anhaltende Abgabe von Wachstumsfaktoren produziert, um für mehrere Tissue Engineering Anwendungen 21,33-35 Zelle. Daher Engineering diese maßgeschneiderten biotinylatable Proteinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das mehrere Forschungsinteressen überwinden kann.

Protocol

1. Die Projektierung des Zielproteins Mit dem National Center for Biotechnology Information Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhalten eine Aminosäure-Sequenz für das Zielprotein unter Berücksichtigung der Art der Zinsen und Splice-Varianten. Wählen Sie die Aminosäuresequenz, die zu der aktiven Region von Interesse des Proteins entspricht. Hinweis: Sema3A wurden Aminosäuren 21-747 entschieden. Fusionsprotein wurde mit NGF, wo die Sequenz von Barstar, Aminosäure 1-90 wurde auf NGF Am…

Representative Results

Klonierung und Expression-Test Wenn Beschichtung richtig durchgeführt wird, sollten einzelne isolierte Kolonien zu bilden, um die Chancen Zupfen klonalen transformierten Bakterien-Zellen (2A) zu erhöhen. Wenn jedoch zu viele Zellen plattiert, Platten zu lange bei 37 ° C inkubiert oder Transformation ist fraglich, Kolonien können die Agar-Platte abdecken oder bilden größere Aggregate von Zellen (Fig. 2B und 2C). W…

Discussion

Rekombinante Proteintechnik ist eine sehr mächtige Technik, die viele Disziplinen überspannt. Es ist kostengünstig, abstimmbaren und ein relativ einfaches Verfahren, das die Herstellung von hohen Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gestaltung und die Zielproteine ​​exprimieren, ist nicht immer einfach. Basale Expression und rekombinante Proteinstabilität ist von den spezifischen Möglichkeiten der Vektor, E. coli-Zellstämme, Peptid-Tag Ergänzungen und Kulti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken der University of Akron für die Finanzierung, die diese Arbeit unterstützt bestätigen.

Materials

1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5% Chem-Impex International 127 100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol Chem-Impex International 642 250 ml
Acetic acid, glacial EMD AX0073-9 2.5 L
Agar Bioshop AGR001.500 500 g
Ampicillin sodium salt  Sigma-Aldrich A9518 25 g
Antifoam 204 Sigma-Aldrich A6426 500 g
Barstar-NGF pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 1 ml; Expression Host
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916 500 ml
BugBuster Novagen 70922-3 100 ml
Gel filtration standard Bio-Rad 151-1901 6 vials
Glycerol Bioshop GLY001.1 1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride Chem-Impex International 152 1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88222 100 ml
Hydrochloric acid EMD  HX0603-3 2.5 L
Imidazole  Chem-Impex International 418 250 g
IPTG Chem-Impex International 194 100 g
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface Chem-Impex International 270 500 g
LB Broth   Sigma-Aldrich L3022 1 kg
NovaBlue Competent Cells Novagen 69825 1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Potassium Chloride Chem-Impex International 01247 1 kg
Sema3A-pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 1 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG 1 kg
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 500 g
Sodium phosphate diabasic Sigma-Aldrich S5136-500G 500 g
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 500 g
Terrific Broth Bioshop TER409.5 5 kg
Tetracycline hydrochloride Chem-Impex International 667 25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X Bio-Rad 1610732 1 L
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503 1 kg
Tryptone, pancreatic EMD 1.07213.1000 1 kg
Yeast extract, granulated EMD 1.03753.0500 500 g
Name of Kits/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
 ÄKTApurifier10 GE Healthcare 28-4062-64  Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000 MAXQ 4000
BirA500 Avidity BirA500 Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette Thermo Scientific 66380 Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories  132127, 132129 MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923 GE Healthcare 11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit Invitrogen 1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C GE Healthcare 18-6083-13
Fraction Collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00 Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator  VWR 13271-102 Model 1156D
Heating Oven FD Series Binder Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg GE Healthcare 17-1069-01 Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge Beckman Coulter 393126
JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055
JLA 8.1 Rotor Beckman Coulter 969329 Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor Beckman Coulter 368690
Laminar Flow Hood Themo Scientific 1849 Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader TECAN infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8004 4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio-Rad 456-9036 Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column Bio-Rad 737-2512 49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit OMEGA bio-tek D6943-01
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 164-5052 250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes VWR 3119-0050 50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators Corning 431488, 431483  20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service GenScript USA Inc. Protein Services
Ultrasonic Processor  Cole-Parmer 18910445A Model CV18
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560

References

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McCormick, A. M., Jarmusik, N. A., Endrizzi, E. J., Leipzig, N. D. Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e51295, doi:10.3791/51295 (2014).

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