Expresión, aislamiento y purificación de soluble e insoluble Biotinylated Proteínas del Tejido Nervioso para regeneración

Summary

El desarrollo de las proteínas de fusión biotinylatable tiene muchas aplicaciones potenciales en diversos campos de la investigación. La ingeniería de proteínas recombinantes es un procedimiento recta hacia adelante que es rentable, proporcionando altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado.

Abstract

La ingeniería de proteínas recombinantes ha utilizado la Escherichia coli (E. coli) sistemas de expresión para casi 4 décadas, y en la actualidad E. coli es todavía el organismo huésped más utilizado. La flexibilidad del sistema permite la adición de restos tales como una etiqueta de biotina (para las interacciones de estreptavidina) y proteínas funcionales más grandes, como la proteína verde fluorescente o la proteína rojo cereza. Además, la integración de los aminoácidos no naturales tales como quelantes de iones metálicos, grupos funcionales reactivos de forma única, sondas espectroscópicas, y moléculas que imparten las modificaciones post-traduccionales ha permitido una mejor manipulación de propiedades de la proteína y funcionalidades. Como resultado de esta técnica crea proteínas de fusión adaptables que ofrecen una utilidad significativa para los distintos ámbitos de investigación. Más específicamente, la secuencia de la proteína biotinylatable se ha incorporado en muchos proteínas diana debido a la alta interacción de afinidad entre la biotina con la avidina y estreptavidina. Esta adición ha ayudado a mejorar la detección y purificación de proteínas etiquetadas, así como abrir el camino para aplicaciones secundarias como la clasificación de células. Así, las moléculas marcadas con biotina muestran una influencia creciente y generalizada en los campos bioindustriales y biomédicas. Para el propósito de nuestra investigación hemos diseñado proteínas de fusión biotinilada recombinantes que contienen el factor de crecimiento nervioso (NGF) y semaphorin3A (Sema3A) regiones funcionales. Hemos informado anteriormente de cómo estas proteínas de fusión biotinilada, junto con otras secuencias de proteínas activas, pueden ser atados a biomateriales para la ingeniería de tejidos y propósitos de regeneración. Este protocolo describe los conceptos básicos de las proteínas biotinylatable ingeniería en la escala de miligramos, utilizando un vector lac inducible T7 y E. Los huéspedes de expresión de E. coli, a partir de la transformación a escala de tratamiento y purificación.

Introduction

Proteínas cubren una amplia gama de biomoléculas que son responsables de muchas funciones biológicas, en última instancia conduce a la formación de tejido adecuado y la organización. Estas moléculas inician miles de vías de señalización que controlan la regulación y / o baja regulación de genes y otras proteínas, mantener el equilibrio en el cuerpo humano. La interrupción de una sola proteína afecta a toda esta red de señales, que puede conducir a la aparición de trastornos o enfermedades devastadoras. Ingeniería de proteínas individuales en el laboratorio ofrece una solución para combatir estos efectos adversos y ofrece una alternativa a los fármacos de moléculas pequeñas. En 1977, un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la somatostatina 14 fue uno de los primeros polipéptidos creados por ingeniería utilizando E. coli ^1. Poco después, en 1979, la insulina fue clonado en el plásmido pBR322, transformada, expresó, y purificado ^2. Desde entonces, las proteínas recombinantes han ampliado su influencia en varios campos de la research como biomateriales, la administración de fármacos, ingeniería de tejidos, productos biofarmacéuticos, la agricultura, enzimas industriales, biocombustibles, etc (para revisiones ver referencias ^3-8). Esto se debe en gran parte a la versatilidad que ofrece la técnica a través de la adición de restos químicos específicos de la aplicación o las secuencias de proteínas para propósitos incluyendo, pero no limitado a, la identificación de proteínas diana, estabilización y purificación.

A través de la tecnología del ADN recombinante, las proteínas recombinantes se pueden expresar en una variedad de sistemas de huésped eucariotas y procariotas incluyendo mamíferos, plantas, insectos, levaduras, hongos o bacterias. Cada anfitrión ofrece diferentes ventajas y por lo general el mejor sistema es determinado con base en la función de la proteína, el rendimiento, la estabilidad, el coste total, y la escalabilidad. Las células bacterianas a menudo carecen de los mecanismos de modificación después de la traducción que proporcionan huéspedes eucariotas (es decir, la glicosilación, disulfuro de transición, e tc.) ^5. Como resultado, los sistemas de mamíferos y de insectos generalmente resultan en una mejor compatibilidad y la expresión de proteínas eucarióticas, sin embargo estos anfitriones son típicamente más caro y consume mucho tiempo ^9. Por lo tanto, E. coli es el anfitrión favorito para nuestro sistema de expresión porque las células se expanden rápidamente en condiciones de crecimiento de bajo costo y los mecanismos de expresión genética se entienden bien ^5,9. Además, este sistema es fácil de escalar-para fines de producción y los resultados en las proteínas funcionales a pesar de la falta de modificaciones post-traduccionales ^10. La E. coli cepa K12 se elige en este protocolo para la clonación porque esta cepa ofrece excelentes rendimientos de plásmido basado en la alta eficiencia de transformación. Además, una E. coli cepa BL21 se utiliza para la expresión, porque esta cepa huésped contiene el gen de la polimerasa de ARN de T7, que proporciona expresión de la proteína controlada y la estabilidad ^11.

tienda de campaña "> Después de la selección de acogida, además se debe tener cuidado en la selección del vector de expresión ideal para facilitar la expresión de la proteína seleccionada y controlada. síntesis de proteínas recombinantes comienza con una secuencia de ADN diana que se clona bajo la dirección de las señales de traducción de la transcripción del bacteriófago T7 y, y expresión es inducida en las células huésped que contienen copias cromosómicas del gen de ARN polimerasa de T7 ^12. Estos vectores, derivados de pBR322 plásmido vector (para una revisión véase la referencia ^13), están estrechamente controlada por el promotor de T7 desarrollado inicialmente por Studier y colegas ¹⁴ y proporcionar adicional control a través de la inclusión del operador lac y represor lac (LAC1) ^15,16. Para la ingeniería de proteínas recombinantes, este sistema de expresión ofrece la posibilidad de adaptar una secuencia específica de aminoácidos de una proteína deseada mediante la inserción de diferentes secuencias de ADN diana o para crear proteínas de fusión compuesto por dominio combinados de proteínas individuales. Además, algunas series de vectores incluyen modificaciones de etiquetas peptídicas que ser colocados en el extremo N o C. Para nuestros fines de diseño, se añadió una histidina (His) de etiquetas a la secuencia diana de ADN para la purificación y una secuencia de biotinylatable 15 aminoácidos se incluyó para biotinilación ^17,18. En este protocolo un plásmido que contiene un gen de resistencia a ampicilina, fue elegido para llevar las secuencias de proteínas de fusión biotinylatable. Expresión se controla en este vector a través del promotor lac de T7 y es fácilmente indujo con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG).

Expresiones de ensayo (cultivos a pequeña escala) se utilizan para determinar la presencia y la solubilidad de la proteína diana, que se puede expresar en cualquiera de una forma soluble o insoluble para formular procedimientos de purificación. Una proteína soluble expresado dentro de la célula de las bacterias se someterá plegado espontánea para mantener su estructura nativa ^19. Por lo general el nativoestructura es termodinámicamente favorable. En muchos casos, la actividad metabólica del anfitrión no es propicio para la proteína diana, la colocación de la tensión en el sistema que conduce a la producción de proteína insoluble y la formación de cuerpos de inclusión compuestas de agregados de proteínas insolubles. Por lo tanto la proteína diana se desnaturaliza, haciéndolos generalmente biológicamente inactivo ^20. Ambas expresiones de prueba se escalan en marcha, y los procedimientos de aislamiento se determinan por la solubilidad de la proteína diana. Se requiere una renaturalización adicional o replegamiento paso para proteínas insolubles. Las proteínas recombinantes resultantes se pueden purificar adicionalmente usando cromatografía de exclusión de tamaño.

En la casa de producción de proteínas recombinantes ofrece ventajas de costes sobre los productos comerciales desde miligramos de proteína diana se pueden aislar por litro de cultivo principal. La mayor parte del equipo necesario está disponible en un laboratorio biológico o químico típico. La ingeniería de proteínas permite la creaciónde proteínas de fusión de encargo con funcionalidades adicionales que no siempre están disponibles comercialmente. La Figura 1 representa los principales procedimientos involucrados en la ingeniería de proteínas recombinantes. Con este sistema de expresión que hemos creado muchas proteínas biotinylatable, como el interferón gamma, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, y la proteína morfogenética ^ósea-21-23, pero nos centraremos en dos proteínas que hemos diseñado para el guiado de los axones, NGF (29 kDa ) y Sema3A (91 kDa) ¹⁰ (para una revisión véase la referencia ^24). La biotinilación es una técnica común para la identificación, la inmovilización y el aislamiento de proteínas marcadas que utilizan la interacción biotina-estreptavidina bien conocido ^25-27. Sondas biofísicos ^28,29, biosensores ³⁰ y ³¹ puntos cuánticos son algunos ejemplos de sistemas que utilizan la alta afinidad de la conjugación de biotina-estreptavidina con una K _d del orden de 10 ^-15 M ^27. La E. bio coliligasa estaño, BirA, ayuda en la unión covalente de biotina a la cadena lateral de lisina se encuentra dentro de la biotina etiquetada secuencia de ^18,32. Tethering biotina a los materiales y biomoléculas ha producido la liberación sostenida de factores de crecimiento a los teléfonos para múltiples aplicaciones de ingeniería de tejidos ^21,33-35. Por lo tanto, la ingeniería de estas proteínas biotinylatable de diseño personalizado es una herramienta poderosa que puede trascender los múltiples intereses de investigación.

Protocol

1. Proyeccion de proteína diana Uso del Centro Nacional para la Información Biotecnológica sitio web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obtener una secuencia de aminoácidos de la proteína diana, teniendo en cuenta las especies de interés y las posibles variantes de empalme. Seleccionar la secuencia de aminoácidos que corresponde a la región activa de interés de la proteína. Nota: Para Sema3A, se eligieron los aminoácidos 21-747. Una proteína de fusión fue diseñado con NGF en donde la …

Representative Results

Clonación y expresión de prueba Cuando chapado se realiza correctamente, colonias aisladas individuales deben formar para aumentar las posibilidades de que el desplume bacterias transformadas clonal de células (Figura 2A). Sin embargo, si se colocan demasiadas células, las placas se incubaron demasiado tiempo a 37 ° C o transformación es cuestionable, las colonias pueden cubrir la placa de agar o formar agregados más grandes de las células <str…

Discussion

Ingeniería de proteínas recombinantes es una técnica muy poderosa que abarca muchas disciplinas. Es rentable, sintonizable y un procedimiento relativamente simple, lo que permite la producción de altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado. Es importante tener en cuenta que el diseño y la expresión de proteínas diana no siempre es sencillo. La expresión basal y estabilidad de la proteína recombinante dependen de opciones específicas de vector, E. cepas de E. coli de células, ad…

Materials

1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Acetic acid, glacial	EMD	AX0073-9	2.5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antifoam 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel filtration standard	Bio-Rad	151-1901	6 vials
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88222	100 ml
Hydrochloric acid	EMD	HX0603-3	2.5 L
Imidazole	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli sample buffer	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface	Chem-Impex International	270	500 g
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 pack
Potassium Chloride	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Sodium phosphate diabasic	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetracycline hydrochloride	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Tryptone, pancreatic	EMD	1.07213.1000	1 kg
Yeast extract, granulated	EMD	1.03753.0500	500 g
Name of Kits/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ÄKTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraction Collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator	VWR	13271-102	Model 1156D
Heating Oven FD Series	Binder		Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Laminar Flow Hood	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column	Bio-Rad	737-2512	49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	OMEGA bio-tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes	VWR	3119-0050	50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators	Corning	431488, 431483	20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service	GenScript USA Inc.		Protein Services
Ultrasonic Processor	Cole-Parmer	18910445A	Model CV18
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560