Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Published: January 22, 2014 doi: 10.3791/51295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Akron

Summary

Biyotinile füzyon proteinleri geliştirerek araştırma çeşitli alanlarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Yeniden birleştirici protein mühendisliği özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verim sağlayan, düşük maliyetli olan bir düz ön işlemdir.

Abstract

Yeniden birleştirici protein mühendisliği Escherichia coli (E. coli) sentezleme yaklaşık 4 yıldır sistemleri ve bugün kullanmıştır E. coli halen en yaygın olarak kullanılan konak organizmadır. Sistemin esneklik, (streptavidin etkileşimler için) bir biyotin etiketi olarak yarımlar ve yeşil fluoresan protein ya da kiraz, kırmızı proteini gibi daha büyük fonksiyonel proteinlerin eklenmesi için izin verir. Ayrıca, post-translasyonel modifikasyonlar kazandıran metal iyonu kenetleyiciler, eşsiz bir biçimde reaktif fonksiyonel grup, spektroskopik sondaları ve moleküller gibi doğal olmayan amino asitlerin protein entegrasyon özelliklerine sahiptir, daha iyi bir manipülasyon sağladı. Sonuç olarak, bu teknik, bir araştırma çeşitli alanları için anlamlı bir yarar sunan özelleştirilebilir füzyon proteinleri oluşturur. Daha özel olarak, biyotinile protein dizisi için avidin ve biotin streptavidin ile arasındaki yüksek afiniteli bir etkileşim çok hedef proteinler dahil edilmiştir. Bu ek etiketli proteinlerin tespiti ve arıtılmasını artırılması yanı sıra hücre sıralama gibi ikincil uygulamalar için önünü açarak destekli vardır. Bu nedenle, biyotin-etiketli moleküller bioindustrial ve biyomedikal alanlarda artan bir ve yaygın etkisini göstermektedir. Araştırmamız amaçla, sinir büyüme faktörünü (NGF) ve semaphorin3A (Sema3A) fonksiyonel bölgeler ihtiva eden yeniden birleştirici füzyon proteinleri biyotinile tasarladık. Bunların biyotinile füzyon proteinleri, diğer aktif protein dizileri ile birlikte, doku mühendisliği ve rejeneratif amacıyla Biyomalzemelere gergin nasıl daha önce bildirilmiştir. Bu protokol bir T7 lak uyarılabilir vektör ve E. kullanan miligram ölçeğinde mühendislik biyotinile proteinlerin temel özetliyor dönüşüm şekilde büyütülebilir-up ve arıtma için başlangıç ​​coli sentezleme ana.

Introduction

Proteinler sonuçta uygun doku oluşumu ve organizasyon açan, birçok biyolojik fonksiyon için sorumlu biyomoleküllerin geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır. Bu moleküller, insan vücudu içinde bir denge sağlamak, düzenleme-yukarı ve / veya aşağı-regülasyonu gen ve proteinlerin kontrol sinyal yollarının binlerce başlatır. Tek bir protein bozulması yıkıcı bozukluklar ya da hastalıkların başlangıcı yol açabilir sinyallerin tüm bu ağ-etkiler. Laboratuarda bireysel protein mühendislik bu olumsuz etkileri ile mücadele için tek bir çözüm sunar ve küçük moleküllü ilaçlar için bir alternatif sunuyor. 1977 yılında, 14 amino asit sekansını kodlayan bir somatostatin gen E. kullanılarak oluşturulan birinci işlenmiş polipeptitlerin biri coli 1. Kısa bir süre sonra, 1979 yılında, insülin, plasmid pBR322 klonlanmıştır dönüştürülmüş, ifade edildi ve 2 saflaştırılmıştır. O zamandan beri, rekombinant proteinleri res birden alanlara nüfuzlarını genişlettikearch vb biyomalzeme, ilaç dağıtım, doku mühendisliği, biyofarmösetiklerinin, tarım, endüstriyel enzimler, biyoyakıt gibi (yorumlar için başvuruları 3-8). Bu durum da dahil olmak üzere teknik amaçlı uygulamaya özel kimyasal kısımların ve protein dizilerinin eklenmesi ile içerir, ancak, hedef protein tanımlama, stabilizasyon ve arıtma için bunlarla sınırlı olmamak kaydıyla çok yönlülüğünü ölçüde kaynaklanmaktadır.

Rekombinant DNA teknolojisi ile, memeli rekombinant proteinleri, bitki, böcek, maya, mantar veya bakteriler dahil olmak üzere ökaryotik ve prokaryotik konak sistemleri çeşitli ifade edilebilir. Her ev sahibi farklı avantajlar sunar ve genellikle iyi sistem protein fonksiyonu, verim, stabilite, genel maliyet ve ölçeklenebilirlik göre belirlenir. Bakteriler ökaryot hücreleri genellikle ana (yani glikosilasyonu disülfit köprü, e sağlamak sonrası modifikasyon mekanizmaları eksikliği tc). 5.. Ancak, bu ana genellikle daha pahalı ve zaman alıcı 9 olan, bir sonucu olarak, memeli ve böcek sistemleri genellikle, ökaryotik proteinlerin daha iyi uyum ve tanımına neden olur. Bu nedenle, E. Hücreler ucuz büyüme koşulları hızla genişletmek ve genetik mekanizmaları ifade de 5,9 anlaşılmıştır çünkü coli ekspresyon sistemi için tercih ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, bu sistem, post-translasyonel modifikasyonlar 10 olmamasına rağmen üretim amaçları ve fonksiyonel proteinleri sonuç için büyütüleceği kolaydır. E. Bu suş yüksek dönüşüm verimleri dayalı mükemmel plazmid verim sağlar, çünkü coli K12 suşu klonlama için bu protokol seçilir. Ayrıca, bir E. Bu konakçı suşu kontrol protein ifadesini ve kararlılığını 11 içerir T7 RNA polimeraz genini içerdiği için coli suşu BL21 ifade için kullanılır.

çadır "> ana seçimden sonra, daha fazla bakım rekombinant proteinleri sentezleyen bakteryofaj T7 transkripsiyon ve çeviri sinyallerinin yönlendirmesi altında klonlanır hedef bir DNA dizisi ile başlar. seçilir ve kontrollü bir protein ekspresyonunu kolaylaştırmak için ideal bir ekspresyon vektörü seçiminde de büyük dikkat olmalıdır ve ifadesi T7 RNA polimeraz geninin kromozom kopyasını 12 arasında ihtiva eden konakçı hücrelerde endüklenir. plazmid vektörü pBR322 türetilen Bu vektörler, (inceleme için bkz 13 referans), sıkı bir şekilde, başlangıçta 14 Studier ve arkadaşları tarafından geliştirilen T7 promoter tarafından kontrol edilir ve ek sağlamaktadır lac operatörü ve lac represör (lac1) dahil edilmesi yoluyla kontrol 15,16. yeniden birleştirici protein mühendisliği için, bu ifade sistemi, farklı hedef DNA dizileri sokulmasıyla istenen bir proteinin belirli bir amino asit sekansı ya da uyarlamak için füzyon proteinlerini oluşturmak için olanağı sunar Kombine etki oluşurTek proteinlerden s. Buna ek olarak, bir dizi çizim N veya C terminaline yerleştirilmesi için peptit etiketi modifikasyonlarını içerir. Tasarım amaçları için, bir histidin (His) etiketi saflaştırma için DNA hedef dizisine ilave edildi ve bir 15 amino asit sekansı, biyotinile biyotinilasyon 17,18 için dahil edilmiştir. Bu protokol, bir ampisilin direnç genini ihtiva eden bir plasmid, bizim biyotinile füzyon protein dizileri taşımak için seçildi. Expression T7 lac promotörü, bu vektör ile kontrol edilir ve kolay bir şekilde, izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile endüklenir.

Deney ifadeler (küçük ölçekli kültürler), saflaştırma işlemleri formüle ya çözünebilir ya da çözünmez formda ifade edilebilir hedef proteinin varlığını ve çözünürlüğünü belirlemek için kullanılır. Bakteri hücre içinde ifade edilen çözünür bir protein kendi doğal yapısı 19 korumak için kendiliğinden katlama uğrayacaktır. Tipik olarak, doğalyapı termodinamik olarak tercih edilir. Birçok durumda ana metabolik aktivitesi çözünmeyen protein üretimi ve çözünmez agregaların oluşan protein inklüzyon cisimciklerinin oluşumuna yol açar sistemde stres yerleştirerek, hedef proteine ​​elverişli değildir. Bu durumda, hedef protein 20 genel olarak, biyolojik olarak aktif olmayan hale getirilerek, denatüre. Her iki test ifadeler-up ölçeklendirilir ve izolasyon prosedürleri hedef proteinin çözünürlükleri tarafından belirlenir. Ek bir renatürasyon adımı yeniden katlama ya da çözünmeyen proteinler için gereklidir. Meydana gelen rekombinant proteinler, bundan başka, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir.

Evde rekombinant protein üretim hedef proteinin miligramı Ana kültürün her bir litresi için izole edilebilir çünkü ticari ürünlere kıyasla maliyet avantajı sunmaktadır. Gerekli ekipman çoğu, tipik bir biyolojik ya da kimyasal laboratuar mevcuttur. Protein mühendisliği oluşturulması için sağlar:her zaman ticari olarak geçerli değildir ilave fonksiyonlarını özel füzyon proteinlerinin. 1 rekombinant protein mühendisliği ile ilgili olan temel prosedürleri tasvir etmektedir. Bu ekspresyon sistemi ile, örneğin, interferon-gama, trombosit türevli büyüme faktörü, kemik morfojenik proteini-21-23 gibi pek çok biyotinile protein, oluşturduk, ama biz akson rehberlik, NGF (29 kDa için tasarlanmış iki protein üzerinde durulacak ) ve Sema3A (91 kDa) 10 (inceleme için) 24 başvuru bkz. Biyotinilasyon tanımlanması, hareketsizleştirme ve iyi bilinen bir biotin-streptavidin etkileşimini kullanan 25-27 etiketli proteinlerinin izole edilmesi için yaygın bir tekniktir. Biyofizik sondalar 28,29, 30 biyosensörler, ve kuantum noktaları 31 10 -15 M 27 sipariş üzerine bir K d ile biotin-streptavidin konjugasyon yüksek afinite kullanan sistemler bazı örnekler vardır. E. coli biokalay ligazı, BirA, biyotin içinde bulunan lizin yan zincire biyotin kovalent ekinde yardımcı dizisi 18,32 etiketlendi. Malzeme ve biyomoleküllere Tethering biyotin çoklu doku mühendisliği uygulamaları 21,33-35 için hücre büyüme faktörlerinin sürekli teslim üretti. Bu nedenle, bu özel tasarımlı biyotinile proteinleri mühendislik çoklu araştırma çıkarlarını aşabiliriz güçlü bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Hedef Protein Tasarımı

  1. Biyoteknoloji Bilgi sitesi için Ulusal Merkezi'ni kullanma (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) dikkate ilgi ve herhangi bir ek yeri varyantları tür alarak hedef protein için bir amino dizisini elde. Proteinin ilgi aktif bölgesine karşılık gelen amino asit dizisini seçin.
    Not: Sema3A için, amino asitler 21-747 seçilmiştir. Bir füzyon proteini barstarın, bir amino asit, 1-90 dizisi, NGF amino asitler 122-241 'e eklendi NGF ile tasarlanmıştır.
  2. N-terminal dizileri takip eklemek için: arıtma için 6X His etiketi (HHHHHH), Tütün Etch Virüsü His etiketinin çıkarılması için (TEV) proteaz kesme bölgesi (ENLYFQG), biotin K (GLNDIFEAQKIEWHE) de protein biyotinilasyon için dizisi etiketli ve uygun protein refolding (EFPKPSTPPGSSGGAP) için oda sağlayacak boşluklar esnek menteşe.
    Not: Bu sekanslar, arzu edilen füzyon prot bağlı olarak değişebilirein.
  3. , Arzu edilen alıcı türleri ve sentezi için gen tasarım / optimizasyonu için bir şirket için tam bir amino asit sekansı gönder. Bir kit kullanılarak BamHI-Notl ile tercih edilen bir vektör içine veya ticari hizmetleri kullanılarak alt-klonlanmıştır.

2. Agar Tabaklar Yapımı

Not: Bu antibiyotiklerin, levhalar, tamponlar, tüm hisse senetleri (sıcaklık ve süre) düzgün saklanan çok önemli olduğunu ve (steril) Proteazların serbest kalır.

  1. Bir cam şişe içinde ortam, 20 g / L ve yerde 1,5 ağırlık% ve lizojeni suyu (LB) agar tartılır. Bir 500 ml şişe yaklaşık 15 plakaları hale getirir.
  2. Hacimsel, ultra saf su ekleyin, iyice karıştırın, ve otoklav.
  3. Dokunmak şişe soğuması ve uygun antibiyotik ekleyin. Şişe çok soğur ve çözelti donmak başlarsa, ancak, mikrodalga içinde tekrar ısıtılmakta, agar erken katılaşmasını önlemek.
    Not: Bizim plazmid bir ampisilin direnç gen içerire. Bu nedenle, tüm adımlar 100 ug / ml 'de ampisilin içermelidir. E. E. coli K12 suşu klonlama tetrasiklin (12.5 ug / ml) antibiyotik gerektirir. BL21 bakteri hücreleri herhangi bir ek antibiyotik gerekmez.
  4. 90 mm Petri kapları içine solüsyonu 25-30 ml dökün ve kurumasını zaman tanıyın.
  5. Uygun antibiyotik ve Parafilm ile 4 ° C, veya sıkıca kapanabilen bir torbada mağaza baş aşağı ile etiket çanak.
    Not: Tabaklar yaklaşık bir ay boyunca iyi.

3. Biotin Tagged Plazmid klonlanması

Not: Koşullar aseptik yapılır.

  1. Pelet etmek için 3 dakika boyunca 6,000 x g de plazmid vektörü Spin ve steril aşırı saf su içinde 10 ul ekle.
  2. Kimyasal olarak, yetkili E. 50 ul kaldır -80 ° C ve hemen coli hücreleri, yüksek dönüşüm etkinliği 5-10 dakika için buz üzerine yerleştirin.
  3. 0,5-1 ng/50 vektörü çözeltisi 1 ul ekle56, 50 ul E. l hücrelerin coli hücreleri ve -80 ° C 'de kalan plazmid yerleştirin
  4. 5 dakika boyunca buz üzerinde vektör içeren bakteri hücreleri yerleştirin.
  5. Isı şok geri 2 dakika boyunca buz üzerinde 42 ° C su banyosu ve yer hücrelerde 30-45 saniye boyunca hücre ve vektör karışım.
  6. Katabolik baskı (SOC) ortamı (% 2 v bakto-tripton / w,% 0.5 w / v bakto-maya ekstresi, 8.56 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 20 mM MgSO 4, 20 mM glukoz ile süper uygun suyu 250 ul ekle , ultra saf su, pH = 7.0) ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de 250 rpm'de çalkalanır.
    Not: SOC otoklava olmamalı, filtre, bir 0.22 um filtre ile sterilize edilebilir.
  7. Kuru plakalar önce hücreleri kaplama için 10-15 dk.
  8. Pipet 25, 50, ve ampisilin (100 ug / ml) ve tetrasiklin (12.5 ug / ml) ihtiva eden antibiyotikler ayrı agar plakaları üzerine hücre çözeltisinin 100 ul. Ağar plakalar üzerinde eşit çözümü dağıtmak için cam boncuk kullanın.
    9. <li> 15-18 saat boyunca 37 ° C'de plakaları baş aşağı inkübe edin.
  9. Tabakalarına küçük bireysel koloniler bakteri için kontrol ve kullanım (Şekil 2A) kadar 4 ° C de ters olarak depolar.
    1. Koloniler varsa:
      1. Tamponlar ve malzemelerin tazeliği ve sterilite kontrol edin.
      2. E 'e eklendi plazmid miktarını artırmak coli K12 suşu.
    2. Büyük koloniler mevcut olan ya da koloniler (Şekil 2B ve 2C) bir büyüme varsa, düşük ses steril bir aşılama döngü veya tabak hücreleri kullanarak yeni bir agar plaka restreak.
  10. Inoküle 5 ml dönüştürülmüş E. tek bir koloni ile ampisilin (100 ug / ml) ve tetrasiklin (12.5 ug / ml) ihtiva eden LB antibiyotikler coli hücreleri. Büyüme-up hücreler gece boyunca 250-300 rpm'de 37 ° C'de.
  11. Sonraki gün, bir gece boyunca Gro gelen hedef vektör izole etmek için bir plazmid izolasyon kiti kullanmakw-up sonraki kullanıma kadar -80 ° C 'de ve mağaza plazmid saflaştırılmıştır.
    1. İsteğe bağlı: 260 ve 280 nm 'de elde edilen absorbans ölçümleri kullanılarak plazmid saflık ve konsantrasyon kontrol edin.

4. İfade Plazmidi konakçıya transformasyonu

Not: Koşullar aseptik yapılır.

  1. Tekrar E. için 3,2-3,10 adımları aşağıdaki değişikliklerle coli BL21 hücreleri:
    Not: BL21 hücreleri, bu nedenle sadece ampisilin dönüşüm için agar plakalarına ilave edilir, herhangi bir ek antibiyotik gerekmez.
    1. 50 ul E. adım 3.12 den 0,5-2 ng/50 ul hücre olacak şekilde izole edilmiş plazmid 2-5 ul ekle E. coli ekspresyon konakçı hücreler.
    2. 60-90 saniye ısıl şok hücreler.
    3. 60 dakika yerine 30 dakika boyunca 250 rpm'de çözelti ihtiva eden SOC ortam çalkalayın.
  2. Ster ile bir Petri kabı dönüştürülmüş bakteri hücrelerinin tek bir koloni PluckIle uygulama çubuk ve yeri ampisilin uygun konsantrasyona (100 ug / ml) ile birlikte 5 ml LB et suyu ihtiva eden bir deney tüpü içinde.
  3. 250 rpm'de 37 ° C'de gece boyunca çalkalayıcıda test tüpleri yerleştirin.
  4. Ertesi sabah, gece boyunca büyümeye-up 200 ul almak ve 100 ug / ml ampisilin içeren 5 ml LB ekleyin.
  5. 750 ul kültür (steril) 250 ul% 50 gliserol ile kalan hücreleri aşağı dondurma ve -80 ° C'de tutmak
    Not: Yeni bir test ifade ve ölçek-up işlemleri donmuş hücrelerin bir kazıma elde etmek için steril bir aplikatör çubuk kullanarak ve uygun antibiyotik ile LB aşılayarak yapılabilir.
  6. Optik yoğunluk (OD) 600 nm 'lik bir emişteki 0,7-0,8 arasında ölçülmektedir kadar 37 ° C' de 250-300 rpm'de çalkalayıcı test tüpü yerleştirin.
  7. 1 mM nihai konsantrasyonunda IPTG ile hücrelerin neden.
  8. 300 rpm'de 37 ° C'de ek bir 4 saat boyunca çalkalanır. Alternatif hücreler de yapabilirsiniz250-300 rpm'de 18 ° C'de gece boyunca çalkalanır. Bu, hedef proteine ​​bağlı olarak plazmid daha yüksek bir verim üretebilir.
  9. Testi İfade Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Analizi
    1. 1.5 ml tüp içinde kültür ve yerin 500 ul alır. 5 dakika boyunca 13-15 xg'de aşağı spin. Üstteki likit dökün ve etiket "çözünür." Yükleme boyası (50 ul 2-merkaptoetanol, 950 ul Laemmli numune tampon maddesi) 200 ul vorteks ile süspanse pelet.
      Not: Çözünür bakteri granül birleştirici protein bakteri hücrelerinin sitoplazmik bölgelerinde olup olmadığını belirlemek için kullanılacaktır. Peletler, gerekli olana kadar bir boya yükleme olmadan -80 ° C'de saklanabilir. Dönüştürülmüş ya da neden olmamıştır bir kontrol bakteri kültürü çözünür hem de karşılaştırma için tedavi edilebilir.
    2. 1.5 ml tüp içinde kültür ve yerin 1.000 ul alır. 5 dakika boyunca 13-15 xg'de aşağı spin.Üstteki likit dökün ve etiket "çözünmez."
      Not: Çözülmez pelet bakteri hücrelerinin dahil vücutlarında bulunan proteinlerin serbest bırakmak için aşağıda denaturasyonu prosedür uygulanır. Peletler, gerekli olana kadar -80 ° C'de saklanabilir. Dönüştürülmüş ya da neden olmamıştır bir kontrol bakteri kültürü çözünmeyen hem de karşılaştırma için tedavi edilebilir.
      1. 200 ul BugBuster içinde çözünmeyen pelet yeniden süspanse edin ve 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
      2. 5 dakika boyunca 13-15 xg'de tekrar numune aşağı Spin ve üstte 50 ul alır ve yeni "Çözünmeyen" 1.5 ml tüp ekleyin.
      3. Sonra bu yeni örneğe yükleme boyası 50 ul ekleyin.
    3. SDS-PAGE analizi için proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca hem de çözünür ve çözünmez örnekleri kaynatın.
    4. Standart merdiven ile elektroforez jel halinde her bir numune yükleyin.
    5. Görselleştirmek amacıyla protein numuneler bir lekelenme kullanımıg reaktif ve şirketin protokolünü uygulayın.
    6. Protein, SDS-PAGE jel (Şekil on (Not 4.9.1 ve 4.9.2), bu iki şerit karşılaştırma hem de çözünür ve çözünür olmayan kontrol şeride şerit karşılaştırarak çözünür ve / veya çözünmez fraksiyonlar içinde eksprese edip etmediğini belirlemek 2). Koyu bant çözünür veya çözünmez şeritlerde proteinin molekül ağırlığı yaklaşık görünmelidir. Bu, izolasyon prosedürü Protokol 6 kullanılacak belirleyecektir.
      Not: bir grup izolasyon yöntemi rekombinant proteinin daha yüksek bir verim (Şekil 3) üretir belirlemek için Protokol 6 da kullanılan izolasyon altında gerçekleştirilebilir, ya da her iki yönde protein izole edilebilir, ya da çok bu bölgelerin her ikisinde de varsa .
    7. 4 saat ve gece boyunca indüksiyon yapıldı ise, ölçek-up işlemi için yüksek protein üretimini (Şekil 2) sahip olan tümevarım metodu belirler.
    10. 5. Ölçek-up Usul ve Ana Kültür

    1. Terrific Broth 85.7 g ve 1.8 L saf su ve 1 saat süre ile sıvı döngüsünde otoklav içinde% 50 gliserol, 28.8 ml büyüme ortamı hazırlayın.
    2. Adım 4.5 oluşturulan donmuş hücre stok kültürü bir gece boyunca başlatın.
      Not: Koşullar aseptik yapılır.
      1. Steril bir 125 ml Erlenmeyer şişesi içinde 100 ug / ml 'de 20 ml LB ve ampisilin bir son konsantrasyon ile karıştırın.
      2. Steril bir aplikatör kullanarak dönüştürülmüş E. bir hurdaya almak coli hücreleri ve şişeye damla aplikatörü. Köpük stoper ya da pamuk ile aplikatör sopa ve fiş şişeyi çıkarın ve sterilite korumak için alüminyum folyo ile kaplayın.
      3. 37 ° C'de 250 rpm'de gece boyunca çalkalayın
    3. Ana Kültür
      Not: Koşullar aseptik yapılır.
      1. Steril büyüme ortamı içinde 1.8 L kültür içine dökün ve bir gece boyunca 10 ° ampisilin eklemek0 ug / ml ve bir Pasteur pipeti kullanılarak steril köpük önleyici 204 6-8 damla.
      2. Havalandırma taş aracılığıyla kültürler içine sıkıştırılmış hava kabarcıkları, süzüldü 0,2 mm olan bir 37 ° C su banyosu içinde yer kültürler.
      3. OD 600 nm 0,7-0,8 ulaştığında, IPTG (1 mM) ile teşvik ve indüksiyon aşama 4.9 SDS-PAGE çözünür / çözünmeyen sonuçlarına bağlı olarak 18 ° C 'de 37 ° C'de ya da gece boyunca 4 saat için ya da oluşmasına izin verir.
    4. E. Toplama Hücreler coli
      1. 4 ° C'de 14,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj 1 L şişe (2 şişe / kültür) hücre kültürü aşağı Spin
      2. Süpernatantı dökün ve ince bir spatula kullanılarak, bakterilerin iki adet 50 ml tüplere pelet kepçe. Hücreler, bir kaç dakika için santrifüjleme ile tane haline tekrar edilebilir.
        Not: her bir 1.8 L kültür iki bakteri topaklar, her bir 50 ml santrifüj tüpüne bir neden olur.
      3. Protein izolasyonu kadar -80 ° saklayın peletler.
      </ Li>

    6. Rekombinant Protein izolasyonu ve saflaştırılması

    Protein aşama 4.9 SDS-PAGE Analizi göre çözünür bölgesinde yer almaktadır, o zaman "yerel yalıtım" olarak kullanılacaktır, ancak çözünmeyen proteinler "Özgün olmayan Isolation" işlemleri için gerçekleştirilir: edin.

    1. Cell Lysis
      1. Özgün olmayan
        1. Kaldır E. dönüştürdü coli topak -80 ° C dondurucu ve her bir santrifüj tüpüne 20 ml Lysis / Wash Buffer (Tablo 1) ekleyin.
        2. Vortex ve özer ve herhangi bir büyük boyutta olmadan tampon çözeltisi içine çözen kadar donmuş pelet sallayın. Gecede nutator kuluçkaya yatmaktadır. Ertesi sabah, topak artık tamponundan proteinin denatürasyon nedeniyle yapışkan bir harç madde olmalıdır.
        3. 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında 20,500 x g'de santrifüje bulamacı. Izolasyon için, yeni bir tüpe transfer süpernatan ve topak atın.
      2. Elde transforme edilmiş E. -80 ° C dondurucu coli pelet.
      3. 30 ml'lik bir son hacme ulaşmak için santrifüj tüpüne Lysis Buffer (Tablo 1) ekleyin ve karıştırın ve sıkı bir şekilde çalkalanarak dondurulmuş pelet çıkarmak. Buz üzerinde pelet yerleştirin.
      4. 1-2 dakika boyunca% 100 genliğinde% 70 etanol ile sonikatör probu yıkayın. Sonra saf su ile tekrarlayın.
      5. Sonicate bakteriler 5 dakika (10 dakika toplam geçen süre) için buz üzerinde ise pelet.
        1. Sn kapalı on/30 30 saniye darbesi ile% 30 genlikte selenleyicisi ayarlayın.
        2. Bob santrifüj tüpü ve tamamen hücre pelet kadar kırmak için Sonication aralıkta aşağı. Toplam sürenin sonunda görünür bir bakteri, bir tel, viskoz bir bulamaç kaldı pelet olmalıdır.
        3. Farklı protein izolasyonların arasındaki sonikatör probu temizleme hem de aşama 6.1.2.3 de tarif edildiği gibi% 70 etanol ve ultra saf su ile depolama için.
        30 dakika boyunca 4 ° C'de 20,500 x g'de santrifüjleyin bulamacı. Izolasyon için, yeni bir tüpe transfer süpernatan ve topak atın.
  10. Ni-NTA Afinite Kromatografisi
    1. Özgün olmayan
      1. 1 ekleyin ml Ni2 +-NTA her santrifüj tüpünün (1.8 L kültür boyunca 2 ml reçine toplam) hazırlandı reçine çözeltisi ve nutator en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
      2. Afinite sütuna şerbeti dökün ve çözüm atık behere tamamen musluk vana aracılığıyla akmasına izin.
      3. Her bir yıkama için Lizis / Yıkama Tamponu 10 ml ile 10 yıkama yapın.
        1. İlk iki yıkama, ek reçine kaldırmak ve daha sonra kolon içine dökmek için santrifüj tüpüne 10 ml. Ek yıkama kolonuna doğrudan ilave edilebilir.
        2. Her yıkamadan sonra, cam bir çubuk ile karıştırma, reçineyi karıştırın. Yıkama atık beher içine damlar, bir sonraki 10 mi ilave edilebilir.
      4. Sonra tamamen dr yıkayınyoluyla ips, valfli yakın vana, atık beher kaldırmak ve protein toplama için 50 ml santrifüj tüpü ile değiştirin.
      5. Seyreltme Tampon maddesi (Tablo 1) 15 ml eklenir ve karışmaya-up reçine, solüsyon 5 dakika boyunca oturmak için izin verir. Açık musluk vana ve toplamak yıkama. Ilave bir 15 ml 'si ile tekrar tekrar edin.
    2. Yerli
      1. Aşağıdaki parametreleri ayarlamak dışında (Adımda 6.2.1.1-6.2.1.4) Yukarıdaki Özgün olmayan Affinity Kromatografisi izleyin:
        1. Ni 2 nutator en az 1 saat boyunca 4 ° C 'de +-NTA reçine solüsyonu inkübe edin.
        2. Uygun Wash Buffer (Tablo 1) kullanarak.
      2. Elüsyon Tamponu (Tablo 1) 5 ml ve 5 dakika için reçine ile inkübe edin.
        1. Açık musluk vanası ve çözeltinin çok kadar elüsyonu toplanması yoluyla damlatılır gelmiştir.
        2. 96 oyuklu plaka temizlemek için 90 ul / oyuk Bradford reaktifı ilave edin. Her yıkama izin sonra yani 10 ulde 90 ul Bradford reaktifi içeren içine sütundan damla devrim sisi.
        3. Bradford tahlil artık protein (renk temizlemek için açık mavi, koyu mavi gider) tespit kadar bir seferde 5 ml sıyrılması Tampon eklemeye devam edin. Bu genellikle 4-5 elüsyon hacimleri alır.
  11. Diyaliz / Renatürasyon
    1. 4 ° C. Özgün olmayan (renatürasyonunu) ve yerli diyaliz tamponlar (Tablo 1) ve mağaza olun
      Not: diyaliz tampon pH'ı, hedef proteinin izoelektrik noktasının (pl) ile tespit edilir. Başparmak proteinlerin bir kural kendi pl değerlerin üstünde veya altında en az bir tam nokta tamponlu gerektiği gibi.
    2. Uygun molekül ağırlığı kesme (Sema3A için NGF ve 50,000 MWCO için 25,000 MWCO) ile diyaliz boru yerli ve yerli olmayan elüsyonları aktarın. 4 ° C'de 4 saat boyunca, ilgili diyaliz tampon maddesi içinde 1 her bir protein numunesi yerleştirin ve daha sonra söz konusu tampon 2 fazla ile değiştirin4 ° C'de gece
      Not: Protein doğru ve tekrar katlanmadan gerçekleşmesi için tampon değişimi için en az 4 saat süreyle her bir tampon içinde diyaliz edilmiş olması gerekir.
    3. Santrifüj sıkma konsantre edici kullanılarak en az 5 ml diyaliz edilmiş protein elüsyonları konsantre edin.
      Not: Proteinler daha hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) kullanılarak saflaştırılabilir ve yeniden konsantre edildi olabilir.
  12. Dondurularak önceden tartılmış bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 10-50 ml bir numuneyi kurutmak suretiyle protein konsantrasyonu (mg / ml) belirler.
    1. Isteğe bağlı c: l yol uzunluğu olan bir 280nm / εl,: = sönüm katsayısı belirlemek, ε, protein yoğunlaşma Beer-Lambert Yasasına kullanılarak 280 nm 'de bir numunenin absorbansı ölçülerek gelecek izolasyon belirlenebilir, böylece.

7. Saflaştırılmış protein Biyotinilasyon

  1. 10,000 MWCO diyaliz kaseti ag proteinleri Dialyze10 mM Tris ainst (pH = 8.0), 6 değişikliklerin toplam tampon her 4 saat değiştirilmesi.
  2. Biyotinilasyon için 2 ml mikro santrifüj tüplerine (şimdi 10 mM Tris tamponu içinde) yeniden birleştirici proteinleri aktarın.
  3. Bir biotin protein ligaz kiti kullanılarak Biotinylate proteinleri.
  4. 3 tamponu ile 10,000 MWCO diyaliz kaseti kullanılarak PBS (pH = 7.4) karşı proteinleri Dialyze 2 gün boyunca bir gün değişir.
  5. Bir miktar analiz kiti kullanılarak protein yüzde biyotinilasyonunu belirler.
  6. 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için -20 ° C'de alikot ve mağazada 6.4 ve mağaza de tarif edildiği gibi yeniden konsantrasyonunun belirlenmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klonlama ve ifade Testi

Kaplama düzgün yapıldığında, tek bir izole koloniler klonal transforme bakteriler hücreleri (Şekil 2A) koparma şansını artırmak için oluşturmalıdır. Çok sayıda hücre plakalanır, ancak plakalar 37 ° C ya da dönüşüm çok uzun inkübe edilir koloniler agar plaka kapak veya hücre daha büyük agregalar (Şekil 2B ve 2C) oluşturabilmektedir, sorgulanabilir. Test ifade sırasında NGF ve Sema3A ilk 37 ° C'de 4 saat boyunca uyarılmış ve SDS-PAGE analizi, her iki proteinin de, çözünebilir fraksiyon (Şekil 2B) 'si belirlendi. Protein ifade adil ve bu nedenle 18 ° C'de gece boyunca indüksiyon ile başka bir test ifadesi incelenen gibiydi. Sema3A (Şekil 2E) ile herhangi bir fark var iken, NGF, çözünebilir fraksiyon olarak daha iyi bir ifade ile sonuçlanmıştır.

"> İzolasyon, saflaştırılması ve Biyotinilasyonu

NGF ve Sema3A her ikisi de yukarıda tarif edilen protokol ve arıtma için FPLC kolonu boyunca koş yerel yalıtım teknikleri kullanılarak izole edilmiştir. Buna ek olarak, bu rekombinant proteinler izole edildi ve nonnatively arıtıldı. NGF deney edilmesi sırasında çözülebilir fraksiyonda olsa bile, doğal izolasyon prosedürleri hem de 37 ° C (2 L 4.57 mg / ana kültür) ve 18 ° C'de 2 L (6.11 mg / Ana kültür sonra NGF düşük bir verim üretilir; Şekil 3A, bir katı hat) indüksiyonu. Bununla birlikte, daha yüksek bir NGF renatürasyon verimi ile Özgün olmayan izolasyon yoluyla elde edilmiştir (10.72 ± 1.8 mg / Ana kültür L 2, Şekil 3A, kesikli çizgi) 18 ° C, gece boyunca indüksiyon sonrası. Diğer taraftan, yerel olmayan izolasyon 8.61 ± 3.1 mg / Ana kültür (Şekil 3 izolasyonu için yerel L 2 ile bir Sema3A üretimi (Şekil 3B, kesikli çizgi) ile sonuçlanmıştır B, düz çizgi). Sema3A 37 ° C'de indüksiyon 4 saat sonra yerli izolasyon yapılan, oysa bir sonucu olarak, NGF, 18 ° C'de gece boyunca indüksiyondan sonra Özgün olmayan koşullar altında izole edildi FPLC tepe noktası toplandı ve NGF ve Sema3A numuneler SDS-PAGE (Şekil 3) ile incelenmiştir. Sema3A için FPLC çıktı (Şekil 3B) bulunan ilave protein Tepe noktaları toplanmış ve SDS-PAGE analizi ile ve Sema3A molekül ağırlığı bölgesinde yer alan değildi. Şekil 3B'de gösterilen Sema3A zirve yaptığı gibi bu hücre bazlı deneylerde işlevsel olarak davranır değildi, çünkü bu parçacıklar en olası bozulma ürünlerdir. Proteinler, BirA enzimi kullanılarak biyotinile edilmiş ve herhangi bir reaksiyona girmemiş türleri uzaklaştırmak için diyaliz edilir. Biyotinilasyonu bir biotin ölçümü kiti ve floresan mikrotabak okuyucu ile teyit edildi.

ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg "/>
Şekil 1. Bir E'yi kullanan Protein mühendisliği E. coli sentezleme sistemi. rekombinant protein mühendisliği temel işlem E içinde klonlama ve ifade için bir plazmid tasarımı içerir coli. Dönüştürülmüş koloniler antibiyotik kullanımı ile seçilir. Küçük sınav ifadeler hedef proteinin üretimini ve çözünürlüğünü optimize etmek ve tanımlamak için kullanılır. Bu prosedür ölçekli-up büyük toplu cultivations (litre ölçek). Kromatografi yöntemleri, istenen işlenmiş proteinin izole edilmesi ve saflaştırılması için kullanılır. Bu tür değişiklikler, biyotinilasyon gibi toplu uygulanan kültürleme işlemleri sırasında ya da saflaştırma sonrasında oluşabilir.

Şekil 2,
Şekil 2. ONGF ve Sema3A test ifade ptimizing. (A) dönüştürülmüş E: 25 ul Kaplama E. coli K12 hücreleri, küçük izole edilmiş koloniler ile sonuçlandı. Tek bir koloni testi ekspresyon için seçilmelidir. BL21 dönüştürülmüş hücreler için benzer koloni dağıtım gerçekleşmelidir. (BC) Kaplama 50 ul K12 ve 100 ul hücre, sırasıyla, bakteri kolonileri aşırı nüfus sonuçlandı. Bu plakalardan koparma tek transforme hücreden türetilen bir koloni seçilmesi daha düşük bir olasılık neden olabilir. Transforme hücrelerin (D) Test ifadeler IPTG ile 37 ° C'de 4 saat kaynaklı ve SDS-PAGE NGF füzyon proteini (29 kDa) ve Sema3A füzyon proteini (91 kDa), çözünebilir fraksiyon olarak ifade edilmiştir göstermektedir edilmiştir. Bununla birlikte, geliştirilmiş ekspresyon için Sema3A değildir, 18 ° C 'de (E) Gecelik indüksiyon çözünebilir fraksiyon hala NGF ekspresyonunu gösterir.


FPLC ile NGF ve Sema3A Şekil 3.. Saflaştırılması. (A) Özgün olmayan izolasyon 18 ° C, gece boyunca indüksiyon sonrası (kesikli çizgi) yerel hem de 4 saat sonra izolasyon, 37 ° C ve gece boyunca, 18 ° C indüksiyonu ile karşılaştırıldığında daha iyi NGF verimleri ile sonuçlanmıştır (katı hat). (B) Sema3A için, 4 saat ve yerel yalıtım durum için 37 ° C 'de indüksiyon aynı yetiştirme parametrelerinde Özgün olmayan izolasyon ile karşılaştırıldığında daha iyi bir verimi elde edilmiştir. SDS-PAGE FPLC tepe koleksiyonları (A) NGF ve (B) her ikisi için de Sema3A (oklar) görülmektedir. Bir jel süzme proteini, standart tepe molekül ağırlığı dağılımı teyit etmek için çalıştırıldı ve kDa FPLC parsellerin arka endikedir.

Izolasyon Tampon Bileşenleri
Özgün olmayan Lysis / Wash 6 M GuHCl, 100 mM 2 H napo 4, 10 mM Tris baz, 10 mM imidazol, pH = 8.0
Elüsyon 6 M GuHCl, 200 mM buzlu asetik asit (17.4 M)
Diyaliz (Renatürasyon) Fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS):
21.7 mM NaH 2 PO 4, 15.3 mM Na 2 HPO 4, 149 mM NaCl
Tampon 1: PBS, 0.2 M GuHCl, 4 L ultra-saf su içinde 1.99 mM ditiyotreitol (DTT), pH = 7.4
Tampon 2: 4 L, aşırı saf su içinde PBS, pH = 7.4
Yerli Liziz 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH = 8.0
Yıkama 50 mMNaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH = 8.0
Elüsyon 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH = 8.0
Diyaliz Fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS):
21.7 mM NaH 2 PO 4, 15.3 mM Na 2 HPO 4, 149 mM NaCl
Tampon 1: PBS, 4 L ultra-saf su içinde 1,99 mM DTT, pH = 7.4
Tampon 2: 4 L, aşırı saf su içinde PBS, pH = 7.4

Tablo 1. Rekombinant Protein İzolasyonu Tamponlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant protein mühendisliği birçok disiplinin yayılan çok güçlü bir tekniktir. Bu, özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verimle üretimini sağlayan, düşük maliyetli, ayarlanabilir ve nispeten basit bir işlemdir. Bu tasarımı ve hedef proteinleri ifade her zaman kolay değildir dikkat etmek önemlidir. Bazal ve rekombinant protein ekspresyon vektörü kararlılık, E. belirli seçenekler bağlıdır coli hücre suşları, peptit etiketi eklemeler ve yetiştirme parametreleri. Bizim özel tasarım kriteri de kurulan E. kullanır coli protein mühendisliği için suşları. Buna ek olarak, plazmid vektörü, bir T7 lac promotör ve stabil yeniden birleştirici protein ekspresyonu için ampisilin direnç genini içerir.

Yüksek ölçüde saflaştırılmış alt klonlanmış plazmid elde edildikten sonra, ilk büyük prosedür başarıyla konak hücre içine, hedef protein dönüşümü ve çözünürlüğünü belirlemek içinprotein. Deney ifadeler hedef proteinin sentezini optimize etmek için en uygun zaman. Bu plazmid içeren bakteri hücreleri daha seçimini sağlamak için, küçük izole edilmiş koloni (Şekil 2A) koparmak için önemlidir. Böyle kısa süreler için agar plakaları koloniler yeniden dağıtmak çizerek ekme ya da kuluçka gibi sorun giderme stratejileri daha iyi koloni oluşumları yardımcı olabilir. Bu rekombinant protein üretimi konak suşu 36 strese neden olması sürpriz değildir. Ifadesi zayıftır, bu aşama sırasında, örneğin antibiyotik ve IPTG konsantrasyonu yanı sıra, indüksiyon süresi ve sıcaklık gibi faktörler en iyi hedef proteini (inceleme için bakınız 37-38) elde etmek için ayarlanabilir. Iyi ifade 18 ˚ C (Şekil 2E) bir gecede indüksiyon sonuçlandı Burası NGF görüldü.

Sema3A yerel koşullar için protein üretimi ile sonuçlanmıştır, ancak nonnative izolasyon hiçbir protein üretimi (Şekil 3B) gösterdi. NGF ana kültürler 18 ˚ C 37 ˚ C de gecede 4 saat boyunca uyarılan ve yerli koşullar altında izole edildi. FPLC saflaştırma 18 ˚ C (Şekil 3A), gece boyunca indüksiyondan sonra nonnatively izole edilmiştir ana kültürleri ile karşılaştırıldığında NGF daha düşük bir verim üretti. Dahil etme gövdelerinin protein oluşumu genel olarak renaturasyon bazen zor ve zaman başarılı olmadığı arzu olduğu düşünülmektedir. Bu çözünür protein dizilerinin 39-41 ilavesi de dahil olmak üzere protein çözünürlüğünü artırmak için tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, proteinleri dahil edici gövdeler olarak izole ise konformasyon biçimlerini sahip olduğu gösterilmiştir, ve bu indüksiyon düşük sıcaklıklar gibi parametreler, bu aktif 42-46 yapıları korumak için yardımcı olur. Bir proteinin, sadece çözünmeyen şeklinde ifade edilebilir zaman yeniden genellikle mümkündürdaha önce 21 rapor gibi çok az verim kaybı ile basit teknikler kullanılarak izolasyon sonra doğa proteini.

Biz başarılı mühendis ve E. kullanılarak biyotinile proteinleri üretmek için nasıl göstermiştir coli klonlama ve ana 2 It L., yaklaşık 8-10 mg / Ana kültür elde olarak ifade sistemi (Şekil 1), yeni rekombinant proteinlerin üretimi sırasında olaylar sekansı genel olarak aynı kalır dikkat etmek önemlidir, ancak, her biri özel olarak yapılan protein, özellikle arıtılmış ürünün en yüksek verimi nasıl üretileceğini belirlemek için vaka bazında bir durumda tedavi edilmelidir. Biz NGF ve Sema3A aynı yetiştirme sistemi ve nasıl kendi üretimini optimize etmek için farklı nasıl davrandığını göstermiştir. Ayrıca, şu anda başka E. kullanıyor stayin önemini gösteren diğer hedef proteinler için in vivo 47 biotinylate olabilir coli B ana suşug rekombinant protein mühendisliği ile ilgili devam eden gelişmeler ve değişiklikler hakkında bilgili.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar bu işi desteklenen finansman Akron Üniversitesi kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Chem-Impex International 127 100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol Chem-Impex International 642 250 ml
Acetic acid, glacial EMD AX0073-9 2.5 L
Agar Bioshop AGR001.500 500 g
Ampicillin sodium salt  Sigma-Aldrich A9518 25 g
Antifoam 204 Sigma-Aldrich A6426 500 g
Barstar-NGF pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 1 ml; Expression Host
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916 500 ml
BugBuster Novagen 70922-3 100 ml
Gel filtration standard Bio-Rad 151-1901 6 vials
Glycerol Bioshop GLY001.1 1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride Chem-Impex International 152 1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88222 100 ml
Hydrochloric acid EMD HX0603-3 2.5 L
Imidazole  Chem-Impex International 418 250 g
IPTG Chem-Impex International 194 100 g
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface Chem-Impex International 270 500 g
LB Broth   Sigma-Aldrich L3022 1 kg
NovaBlue Competent Cells Novagen 69825 1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Potassium Chloride Chem-Impex International 01247 1 kg
Sema3A-pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 1 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG 1 kg
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 500 g
Sodium phosphate diabasic Sigma-Aldrich S5136-500G 500 g
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 500 g
Terrific Broth Bioshop TER409.5 5 kg
Tetracycline hydrochloride Chem-Impex International 667 25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x Bio-Rad 1610732 1 L
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503 1 kg
Tryptone, pancreatic EMD 1.07213.1000 1 kg
Yeast extract, granulated EMD 1.03753.0500 500 g
 ÄKTApurifier10 GE Healthcare 28-4062-64 Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000 MAXQ 4000
BirA500 Avidity BirA500 Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette Thermo Scientific 66380 Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories 132127, 132129 MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923 GE Healthcare 11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit Invitrogen 1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C GE Healthcare 18-6083-13
Fraction Collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00 Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator  VWR 13271-102 Model 1156D
Heating Oven FD Series Binder Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg GE Healthcare 17-1069-01 Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge Beckman Coulter 393126
JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055
JLA 8.1 Rotor Beckman Coulter 969329 Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor Beckman Coulter 368690
Laminar Flow Hood Themo Scientific 1849 Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader TECAN infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8004 4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio-Rad 456-9036 Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column Bio-Rad 737-2512 49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit Omega Bio-Tek D6943-01
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 164-5052 250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes VWR 3119-0050 50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators Corning 431488, 431483  20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service GenScript USA Inc. Protein Services
Ultrasonic Processor  Cole-Parmer 18910445A Model CV18
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
  2. Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).
  3. Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).
  4. Sengupta, D., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).
  5. Kamionka, M. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).
  6. Rao, A. G. The outlook for protein engineering in crop improvement. Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).
  7. Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).
  8. Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).
  9. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), (2011).
  10. McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).
  11. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli. B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).
  12. Novagen pET System Manual. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).
  13. Balbas, P., Bolivar, F. Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli. Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).
  14. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).
  15. Dubendorff, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Tucker, J., Grisshammer, R. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).
  18. Schatz, P. J. Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli). Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  19. Anfinsen, C. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181 (4096), 223-230 (1973).
  20. Villaverde, A., Carrio, M. M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).
  21. Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).
  22. Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate. J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).
  23. Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. 3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds. PLoS One. 7 (11), (2012).
  24. McCormick, A. M., Leipzig, N. D. Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).
  25. Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).
  26. Bayer, E. A., Wilchek, M. Protein biotinylation. Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).
  27. Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science. 243 (4887), 85-88 (1989).
  28. Chen, I., Ting, A. Y. Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).
  29. Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).
  30. Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies. Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).
  31. Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane. J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).
  32. Cull, M. G., Schatz, P. J. Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags. Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).
  33. Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds. Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).
  34. Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials. Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).
  35. Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions. Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).
  36. Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).
  37. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).
  38. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  39. Marston, F. A. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).
  40. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).
  41. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  42. de Groot, N. S., Ventura, S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).
  43. Ventura, S., Villaverde, A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).
  44. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).
  45. Peternel, S., Komel, R. Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).
  46. Garcia-Fruitos, E. Inclusion bodies: a new concept. Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).
  47. Li, Y., Sousa, R. Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).

Tags

Biyomühendislik Sayı 83 protein mühendisliği rekombinant protein üretimi AviTag BirA biotinilasyon pET vektör sistemi, Katma kütleleri Ni-NTA boy dışlama kromatografisi
Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A.,… More

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A., Endrizzi, E. J., Leipzig, N. D. Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e51295, doi:10.3791/51295 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter