Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması
Summary
Biyotinile füzyon proteinleri geliştirerek araştırma çeşitli alanlarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Yeniden birleştirici protein mühendisliği özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verim sağlayan, düşük maliyetli olan bir düz ön işlemdir.
Abstract
Yeniden birleştirici protein mühendisliği Escherichia coli (E. coli) sentezleme yaklaşık 4 yıldır sistemleri ve bugün kullanmıştır E. coli halen en yaygın olarak kullanılan konak organizmadır. Sistemin esneklik, (streptavidin etkileşimler için) bir biyotin etiketi olarak yarımlar ve yeşil fluoresan protein ya da kiraz, kırmızı proteini gibi daha büyük fonksiyonel proteinlerin eklenmesi için izin verir. Ayrıca, post-translasyonel modifikasyonlar kazandıran metal iyonu kenetleyiciler, eşsiz bir biçimde reaktif fonksiyonel grup, spektroskopik sondaları ve moleküller gibi doğal olmayan amino asitlerin protein entegrasyon özelliklerine sahiptir, daha iyi bir manipülasyon sağladı. Sonuç olarak, bu teknik, bir araştırma çeşitli alanları için anlamlı bir yarar sunan özelleştirilebilir füzyon proteinleri oluşturur. Daha özel olarak, biyotinile protein dizisi için avidin ve biotin streptavidin ile arasındaki yüksek afiniteli bir etkileşim çok hedef proteinler dahil edilmiştir. Bu ek etiketli proteinlerin tespiti ve arıtılmasını artırılması yanı sıra hücre sıralama gibi ikincil uygulamalar için önünü açarak destekli vardır. Bu nedenle, biyotin-etiketli moleküller bioindustrial ve biyomedikal alanlarda artan bir ve yaygın etkisini göstermektedir. Araştırmamız amaçla, sinir büyüme faktörünü (NGF) ve semaphorin3A (Sema3A) fonksiyonel bölgeler ihtiva eden yeniden birleştirici füzyon proteinleri biyotinile tasarladık. Bunların biyotinile füzyon proteinleri, diğer aktif protein dizileri ile birlikte, doku mühendisliği ve rejeneratif amacıyla Biyomalzemelere gergin nasıl daha önce bildirilmiştir. Bu protokol bir T7 lak uyarılabilir vektör ve E. kullanan miligram ölçeğinde mühendislik biyotinile proteinlerin temel özetliyor dönüşüm şekilde büyütülebilir-up ve arıtma için başlangıç coli sentezleme ana.
Introduction
Proteinler sonuçta uygun doku oluşumu ve organizasyon açan, birçok biyolojik fonksiyon için sorumlu biyomoleküllerin geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır. Bu moleküller, insan vücudu içinde bir denge sağlamak, düzenleme-yukarı ve / veya aşağı-regülasyonu gen ve proteinlerin kontrol sinyal yollarının binlerce başlatır. Tek bir protein bozulması yıkıcı bozukluklar ya da hastalıkların başlangıcı yol açabilir sinyallerin tüm bu ağ-etkiler. Laboratuarda bireysel protein mühendislik bu olumsuz etkileri ile mücadele için tek bir çözüm sunar ve küçük moleküllü ilaçlar için bir alternatif sunuyor. 1977 yılında, 14 amino asit sekansını kodlayan bir somatostatin gen E. kullanılarak oluşturulan birinci işlenmiş polipeptitlerin biri coli 1. Kısa bir süre sonra, 1979 yılında, insülin, plasmid pBR322 klonlanmıştır dönüştürülmüş, ifade edildi ve 2 saflaştırılmıştır. O zamandan beri, rekombinant proteinleri res birden alanlara nüfuzlarını genişlettikearch vb biyomalzeme, ilaç dağıtım, doku mühendisliği, biyofarmösetiklerinin, tarım, endüstriyel enzimler, biyoyakıt gibi (yorumlar için başvuruları 3-8). Bu durum da dahil olmak üzere teknik amaçlı uygulamaya özel kimyasal kısımların ve protein dizilerinin eklenmesi ile içerir, ancak, hedef protein tanımlama, stabilizasyon ve arıtma için bunlarla sınırlı olmamak kaydıyla çok yönlülüğünü ölçüde kaynaklanmaktadır.
Rekombinant DNA teknolojisi ile, memeli rekombinant proteinleri, bitki, böcek, maya, mantar veya bakteriler dahil olmak üzere ökaryotik ve prokaryotik konak sistemleri çeşitli ifade edilebilir. Her ev sahibi farklı avantajlar sunar ve genellikle iyi sistem protein fonksiyonu, verim, stabilite, genel maliyet ve ölçeklenebilirlik göre belirlenir. Bakteriler ökaryot hücreleri genellikle ana (yani glikosilasyonu disülfit köprü, e sağlamak sonrası modifikasyon mekanizmaları eksikliği tc). 5.. Ancak, bu ana genellikle daha pahalı ve zaman alıcı 9 olan, bir sonucu olarak, memeli ve böcek sistemleri genellikle, ökaryotik proteinlerin daha iyi uyum ve tanımına neden olur. Bu nedenle, E. Hücreler ucuz büyüme koşulları hızla genişletmek ve genetik mekanizmaları ifade de 5,9 anlaşılmıştır çünkü coli ekspresyon sistemi için tercih ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, bu sistem, post-translasyonel modifikasyonlar 10 olmamasına rağmen üretim amaçları ve fonksiyonel proteinleri sonuç için büyütüleceği kolaydır. E. Bu suş yüksek dönüşüm verimleri dayalı mükemmel plazmid verim sağlar, çünkü coli K12 suşu klonlama için bu protokol seçilir. Ayrıca, bir E. Bu konakçı suşu kontrol protein ifadesini ve kararlılığını 11 içerir T7 RNA polimeraz genini içerdiği için coli suşu BL21 ifade için kullanılır.
çadır "> ana seçimden sonra, daha fazla bakım rekombinant proteinleri sentezleyen bakteryofaj T7 transkripsiyon ve çeviri sinyallerinin yönlendirmesi altında klonlanır hedef bir DNA dizisi ile başlar. seçilir ve kontrollü bir protein ekspresyonunu kolaylaştırmak için ideal bir ekspresyon vektörü seçiminde de büyük dikkat olmalıdır ve ifadesi T7 RNA polimeraz geninin kromozom kopyasını 12 arasında ihtiva eden konakçı hücrelerde endüklenir. plazmid vektörü pBR322 türetilen Bu vektörler, (inceleme için bkz 13 referans), sıkı bir şekilde, başlangıçta 14 Studier ve arkadaşları tarafından geliştirilen T7 promoter tarafından kontrol edilir ve ek sağlamaktadır lac operatörü ve lac represör (lac1) dahil edilmesi yoluyla kontrol 15,16. yeniden birleştirici protein mühendisliği için, bu ifade sistemi, farklı hedef DNA dizileri sokulmasıyla istenen bir proteinin belirli bir amino asit sekansı ya da uyarlamak için füzyon proteinlerini oluşturmak için olanağı sunar Kombine etki oluşurTek proteinlerden s. Buna ek olarak, bir dizi çizim N veya C terminaline yerleştirilmesi için peptit etiketi modifikasyonlarını içerir. Tasarım amaçları için, bir histidin (His) etiketi saflaştırma için DNA hedef dizisine ilave edildi ve bir 15 amino asit sekansı, biyotinile biyotinilasyon 17,18 için dahil edilmiştir. Bu protokol, bir ampisilin direnç genini ihtiva eden bir plasmid, bizim biyotinile füzyon protein dizileri taşımak için seçildi. Expression T7 lac promotörü, bu vektör ile kontrol edilir ve kolay bir şekilde, izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile endüklenir.Deney ifadeler (küçük ölçekli kültürler), saflaştırma işlemleri formüle ya çözünebilir ya da çözünmez formda ifade edilebilir hedef proteinin varlığını ve çözünürlüğünü belirlemek için kullanılır. Bakteri hücre içinde ifade edilen çözünür bir protein kendi doğal yapısı 19 korumak için kendiliğinden katlama uğrayacaktır. Tipik olarak, doğalyapı termodinamik olarak tercih edilir. Birçok durumda ana metabolik aktivitesi çözünmeyen protein üretimi ve çözünmez agregaların oluşan protein inklüzyon cisimciklerinin oluşumuna yol açar sistemde stres yerleştirerek, hedef proteine elverişli değildir. Bu durumda, hedef protein 20 genel olarak, biyolojik olarak aktif olmayan hale getirilerek, denatüre. Her iki test ifadeler-up ölçeklendirilir ve izolasyon prosedürleri hedef proteinin çözünürlükleri tarafından belirlenir. Ek bir renatürasyon adımı yeniden katlama ya da çözünmeyen proteinler için gereklidir. Meydana gelen rekombinant proteinler, bundan başka, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir.
Evde rekombinant protein üretim hedef proteinin miligramı Ana kültürün her bir litresi için izole edilebilir çünkü ticari ürünlere kıyasla maliyet avantajı sunmaktadır. Gerekli ekipman çoğu, tipik bir biyolojik ya da kimyasal laboratuar mevcuttur. Protein mühendisliği oluşturulması için sağlar:her zaman ticari olarak geçerli değildir ilave fonksiyonlarını özel füzyon proteinlerinin. 1 rekombinant protein mühendisliği ile ilgili olan temel prosedürleri tasvir etmektedir. Bu ekspresyon sistemi ile, örneğin, interferon-gama, trombosit türevli büyüme faktörü, kemik morfojenik proteini-21-23 gibi pek çok biyotinile protein, oluşturduk, ama biz akson rehberlik, NGF (29 kDa için tasarlanmış iki protein üzerinde durulacak ) ve Sema3A (91 kDa) 10 (inceleme için) 24 başvuru bkz. Biyotinilasyon tanımlanması, hareketsizleştirme ve iyi bilinen bir biotin-streptavidin etkileşimini kullanan 25-27 etiketli proteinlerinin izole edilmesi için yaygın bir tekniktir. Biyofizik sondalar 28,29, 30 biyosensörler, ve kuantum noktaları 31 10 -15 M 27 sipariş üzerine bir K d ile biotin-streptavidin konjugasyon yüksek afinite kullanan sistemler bazı örnekler vardır. E. coli biokalay ligazı, BirA, biyotin içinde bulunan lizin yan zincire biyotin kovalent ekinde yardımcı dizisi 18,32 etiketlendi. Malzeme ve biyomoleküllere Tethering biyotin çoklu doku mühendisliği uygulamaları 21,33-35 için hücre büyüme faktörlerinin sürekli teslim üretti. Bu nedenle, bu özel tasarımlı biyotinile proteinleri mühendislik çoklu araştırma çıkarlarını aşabiliriz güçlü bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinant protein mühendisliği birçok disiplinin yayılan çok güçlü bir tekniktir. Bu, özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verimle üretimini sağlayan, düşük maliyetli, ayarlanabilir ve nispeten basit bir işlemdir. Bu tasarımı ve hedef proteinleri ifade her zaman kolay değildir dikkat etmek önemlidir. Bazal ve rekombinant protein ekspresyon vektörü kararlılık, E. belirli seçenekler bağlıdır coli hücre suşları, peptit etiketi eklemeler ve yetiştirme parametreler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu işi desteklenen finansman Akron Üniversitesi kabul etmek istiyorum.
Materials
| 1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| Acetic acid, glacial | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
| Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| Gel filtration standard | Bio-Rad | 151-1901 | 6 vials |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| His-Pur Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
| Imidazole | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
| NovaBlue Competent Cells | Novagen | 69825 | 1 ml; Cloning Host |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Potassium Chloride | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| Sodium phosphate diabasic | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
| Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
| Tetracycline hydrochloride | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
| Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Tryptone, pancreatic | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
| Yeast extract, granulated | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
| Name of Kits/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ÄKTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Includes kits and accessories |
| Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution |
| Dialysis Casette | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 and 50,000 |
| Flow Diversion Valve FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 Tube Racks, Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| Fraction Collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Includes kits and accessories |
| Heated/Refrigerated Circulator | VWR | 13271-102 | Model 1156D |
| Heating Oven FD Series | Binder | Model FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter | 969329 | Includes 1 L polyporpylene bottles |
| JS 5.3 Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Laminar Flow Hood | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
| Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical electrophoresis system |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels | Bio-Rad | 456-9036 | Any kDa, 15-well comb |
| Ni-NTA Column | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml volume ECONO-Column |
| Plasmid Miniprep Kit | OMEGA bio-tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubes for JA 25.50 rotor |
| Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da |
| Subcloning Service | GenScript USA Inc. | Protein Services | |
| Ultrasonic Processor | Cole-Parmer | 18910445A | Model CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 |
References
- Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
- Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).
- Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).
- Sengupta, D., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).
- Kamionka, M. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).
- Rao, A. G. The outlook for protein engineering in crop improvement. Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).
- Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).
- Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).
- Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), (2011).
- McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).
- Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli. B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).
- Merck KGaA, . . Novagen pET System Manual. , 1-63 (2011).
- Balbas, P., Bolivar, F. Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli. Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).
- Dubendorff, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Tucker, J., Grisshammer, R. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).
- Schatz, P. J. Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli). Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- Anfinsen, C. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181 (4096), 223-230 (1973).
- Villaverde, A., Carrio, M. M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).
- Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).
- Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate. J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).
- Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. 3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds. PLoS One. 7 (11), (2012).
- McCormick, A. M., Leipzig, N. D. Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).
- Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).
- Bayer, E. A., Wilchek, M. Protein biotinylation. Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).
- Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science. 243 (4887), 85-88 (1989).
- Chen, I., Ting, A. Y. Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).
- Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies. Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).
- Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane. J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).
- Cull, M. G., Schatz, P. J. Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags. Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).
- Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds. Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).
- Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials. Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).
- Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions. Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).
- Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).
- Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Marston, F. A. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).
- de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
- de Groot, N. S., Ventura, S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).
- Ventura, S., Villaverde, A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).
- Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).
- Peternel, S., Komel, R. Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).
- Garcia-Fruitos, E. Inclusion bodies: a new concept. Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).
- Li, Y., Sousa, R. Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).
