Langsgående Måling av ekstracellulære matrix Stivhet i 3D tumormodeller Bruke Partikkel-sporing Microrheology

Summary

Partikkel-sporing microrheology kan brukes til ikke-destruktiv kvantifisere og romlig kartlegge endringer i ekstracellulære matriks-mekaniske egenskaper i 3D-tumor modeller.

Abstract

Den mekaniske mikromiljøet har vist seg å fungere som en viktig regulator av tumorvekst oppførsel og signalering, som selv er ombygd og modifisert som en del av et sett av sammensatte, to-veis mechanosensitive interaksjoner. Mens utviklingen av biologisk relevante 3D-tumormodeller har mulig mekanistiske undersøkelser av virkningen av matrisen reologi på tumorvekst, forblir det inverse problemet med kartleggings endringer i den mekaniske miljø indusert av tumorer utfordrende. Her beskriver vi gjennomføring av partikkel-sporing microrheology (PTM) i kombinasjon med 3D-modeller av kreft i bukspyttkjertelen som en del av en robust og levedyktig metode for i lengderetningen å overvåke fysiske endringer i tumormikromiljøet, in situ. Metodikken er beskrevet her integrerer et system for å forberede in vitro 3D-modeller innebygd i en modell ekstracellulære matrix (ECM) stillaset av type I kollagen med fluorescensmerkede prober jevnt fordelt for posisjon-og tidsavhengige microrheology målinger gjennom hele prøven. In vitro svulster er belagt og analysert i parallelle forhold ved hjelp av multibrønnbildeplater. Tegning på etablerte metoder, er videoer av tracer probe bevegelser forvandlet via Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) å rapportere komplekse frekvensavhengig viskoelastisk skjærmodul, G * (ω). Fordi denne tilnærmingen er bildebasert, er mekanisk karakterisering også kartlagt på store overføres lys romlige felt å samtidig rapportere kvalitative endringer i 3D tumorstørrelse og fenotype. Representative resultater som viser kontrast mekanisk reaksjon i under regioner forbundet med lokaliserte invasjon-indusert matriksdegradering samt systemkalibrering, er validerings data presenteres. Uønskede resultater fra vanlige eksperimentelle feil og feilsøking av disse spørsmålene blir også presentert. Den 96-brønn 3D kultur plating format implementert i denne protokollen er conducive til korrelasjon av microrheology målinger med terapeutiske screening-analyser eller molekylær avbildning å få ny innsikt i effekten av behandlinger eller biokjemiske stimuli på den mekaniske mikromiljøet.

Introduction

Det er klart fra en økende mengde bevis i litteraturen som kreftceller, som med ikke-maligne pattedyr epitelceller, er svært følsomme for mekaniske og biofysiske egenskaper i den omliggende ekstracellulære matriks (ECM) og andre mikromiljøet komponenter ^1-9. Elegant mekanistiske studier har gitt innsikt i rollen som ekstracellulært stivhet som en kompleks mechanosensitive signale partner som regulerer ondartet vekst atferd og morphogenesis ^2,3,10,11. Dette arbeidet har blitt tilrettelagt spesielt av utviklingen av 3D i vitro tumormodeller som gjenoppretter biologisk relevant vevsarkitektur og kan dyrkes i stillasmateriell med tunbare mekanikk og fotografert av optisk mikros ^12-19. Imidlertid, er den andre side av denne mechanoregulatory dialog mellom tumor og mikromiljø, der cancercellene i sin tur modifisere reologien av sine omgivelser, er fortsatt noevanskeligere å studere. For eksempel under invasjonsprosesser, kan celler i periferien av en tumor gjennomgå epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) og øke ekspresjonen av matriks-metalloproteaser (MMP) som forårsaker lokal nedbrytning av ECM ^20-22, som i sin tur påvirker mechanosensitive vekst oppførselen andre proksimale kreftceller. Gjennom en rekke biokjemiske prosesser, kreftceller kontinuerlig ringe den lokale stivhet av deres miljø opp og ned for å passe til ulike prosesser til forskjellige tider. Metodikken er beskrevet her er motivert av behovet for analytiske verktøy som rapporterer lokale endringer i stivhet og etterlevelse av ECM under vekst, som kan integreres med 3D tumormodeller og korrelerte lengde med biokjemiske og fenotypiske endringer uten å avslutte kultur.

På jakt etter en passende teknikk for å implementere i denne sammenheng, partikkel-sporing microrheology (PTM) fremstår som en sterk kandidat.Denne metode, utviklet opprinnelig av Mason og Weitz ^23,24, anvender bevegelsen til tracer-prober innebygd i et komplekst fluid for å rapportere den frekvensavhengige komplekse viskoelastisk skjærmodul, G * (ω) ved micron lengdeskala. Denne generelle tilnærmingen er utviklet med flere varianter som passer for ulike anvendelser i myke kondensert materie, kolloider, biofysikk og polymerfysikk ^25-31. PTM har visse fordeler i forhold til andre fremgangsmåter, da avlesninger av lokal viskoelastisitet er gitt ved ikke-destruktiv videoavbildning av biokjemisk inaktive tracer-prober som er innlemmet ved forberedelse kultur og forbli på plass over en lengre periode vekst. Dette er i motsetning til gull standard målinger med en oscillerende skjær bulk rheometer, som nødvendigvis krever avslutning av kulturen og rapporterer bulk makroskopisk reologi av prøven i stedet for punktmålinger innenfor komplekset 3D tumor microenvirtes inn. Faktisk en rekke studier har vist nytten av å tolke målingene av tracer probe bevegelser i eller rundt kreft eller ikke-cancerceller for å måle deformasjoner i forbindelse med cellemigrering ^32, mekanisk stress indusert av en ekspanderende sfæroide ^33, intracellulær reologi ^34,35, og å kartlegge mekaniske påkjenninger og belastninger i konstruerte vev ^36, og forholdet mellom pore størrelse og invasjon hastighet ^37. Andre teknikker som passer for microrheology, slik som atomic force mikroskopi (AFM) kan bli gjennomført, men først og fremst for sondering poeng på prøven overflaten og kan også utgjøre kultur sterilitet problemer som vanskeliglangsgående målinger ^38.

Her beskriver vi en omfattende protokoll som omfatter metoder for vekst av 3D tumor sfæroider egnet for overføring til ECM med innebygde fluorescerende prober for video partikkel-sporing og analysemetoder for pålitelig kartlegge romligendringer i microrheology over tid i kultur. I den foreliggende implementeringen, er 3D tumormodeller vokst i multiwell format med tanke på inkorporering av microrheology målinger med andre tradisjonelle analyser (f.eks cytotoksisitetstester) som dette formatet er som bidrar til. I denne representativ illustrasjon av denne metoden vi-kultur in vitro 3D sfæroider ved hjelp PANC-1-celler, en etablert bukspyttkjertelkreft cellelinje kjent for å danne sfæroider ^39, men alle målinger som her er beskrevet er stort sett anvendelig for å studere av faste tumorer ved hjelp av en rekke cellelinjer passende for 3D-kultur. Fordi denne metoden er iboende bildebehandling basert det er ideell for co-registrering av høyoppløselige microrheology data med store overføres lys synsfelt som rapporterer endringer i cellevekst, migrasjon og fenotype. Gjennomføringen av PTM integrert med gjennomfallende lys mikroskopi på denne måte går ut reproduserbar plassering av objektbordet which er vanligvis tilgjengelig på motoriserte kommersielle widefield epifluorescence biologiske mikroskoper. Protokollen utviklet nedenfor kan implementeres med noen rimelig utstyrt automatisert fluorescens biologisk mikroskop. Dette er en iboende data-intensive metoden, som krever kjøp av gigabyte med digitale videomikroskopi data for offline behandling.

I den følgende protokoll, protokoll 1 vedrører den innledende fremstilling av tumor sfæroider som er beskrevet her, ved hjelp av overlagring på agarose, men kan være substituerte med en rekke andre fremgangsmåter som for eksempel hengende dråpe ^40, eller roterende kultur ⁴¹ teknikker. Protokoll 2 beskriver prosessen med å bygge inn sfæroider i en kollagen stillaset men alternativt kan in vitro 3D tumorer dyrkes ved innkapsling eller innstøping av resuspenderte celler i ECM ^12,15, i stedet for enkelt-pre-formet ikke-heftende sfæroider. Påfølgende protokoller beskriver prosedyrer for obtaining tid-løst microrheology målinger ved å hente og sette videomikroskopi data, henholdsvis. Databehandling er beskrevet ved hjelp av MATLAB, noe som gjør bruk av åpen kildekode rutiner for PTM bygget på algoritmer opprinnelig beskrevet av Crocker og Grier ^42, som har også blitt grundig utviklet for ulike programvareplattformer (se http://www.physics.emory.edu/ ~ uker / IDL /).

Protocol

En. Culturing Tumor Spheroids

1. Bland 10 ml av cellekulturkvalitet vann med 0,1 g agarose for å oppnå en 1% agarose-løsning.
2. Varme agarose-løsning til over 70 ° C (omtrent 14 sekunder i et standard mikrobølgeovn, eller ved hjelp av en varmeplate) før aliquoting 40 pl av agarose-løsning inn i en brønn på en 96-brønns plate.
3. Inkuber platen ved 37 ° C i minst 1 time mens høste celler ved bruk av standardteknikker.
4. Bruk en hemacytometer å bestemme konsentrasjonen av celler i suspensjon.
5. Fortynn cellesuspensjon til 1000 celler / ml og tilsett 100 ul av denne fortynningen til brønnen inneholdende det herdede agarose sengen.
6. Plasser prøven på en riste over natten i en inkubator innstilt ved 37 ° C og 5% _CO2.
7. Fjern prøven fra risteren og tilsett 100 ul av cellekulturmedier.
8. Inkuber sfæroider til ønsket diameter oppnås. For eksempel, etter ni dager, en spheroid vil være omtrent 450 mikrometer i diameter. I løpet av denne tiden, kan friskt vekstmedier bli tilsatt til brønnene, men aspirasjon bør unngås, da dette vil resultere i fjerning av den sfæroide.

2. Forbereder 3D Tumor Spheroids Embedded i ECM

1. Utarbeide en arbeidsstasjonen med nødvendige materialer inne i en laminær hette.
2. Tilbered en fortynnet blanding av karboksylat-modifisert 1 mikrometer diameter fluorescerende tracer prober ved å tilsette 2 deler fotofølere (2% tørrstoff) og 25 deler sterilt vann.
3. Ta en flaske på 3,1 mg / ml kollagen fra kjøleskapet og plasser den på is.
4. Delmengde 125 mL av kollagen inn i en tom 2 ml hetteglass.
5. Tilsett 50 ul fortynnet tracer probe løsning på hetteglasset med kollagen og vortex kort stund for å fordele prober.
6. Til 235 ul av passende cellekulturmedier inneholdende fenolrødt (som blir gul) til et totalt volum på 410 ml og vortex kort før du tar 205 ml (halv totalt volum) og plassere den i en ny 2 ml hetteglass. Vial en vil inneholde tumor sfæroide og Vial 2 vil være en kontroll-blanding.
7. Legg ~ 2 ul av 1M NaOH for å beholder 1 for å bringe oppløsningen opp til nøytral pH (vekstmedium inneholdende fenolrødt skal returnere til rød). Legg merke til at dette vil føre til blandingen for å starte herding hvis den ikke blir holdt på is. Vortex kort for å blande, og deretter gå tilbake til is stativ umiddelbart.
   MERK: spheroid er knapt synlig for det blotte øye etter ni dager med kultur og dens fjerning fra agarose sengen er en delikat oppgave. Bruk av en disseksjon mikroskop kan være nyttig for noen brukere. Å opprettholde integriteten av den sfæroide under overføringen er av vesentlig betydning.
8. Ved hjelp av en bred munn pipette, forsiktig fjerne 40 mL av media fra brønnen som inneholder svulsten spheroid. Ta vare på denne 40 mL mens drive neste trinn.
9. Kontroller brønnen for å se om den sfæroideble fjernet i det foregående trinnet. Hvis det var, tilsett 40 mL inneholder spheroid å beholder 1. Hvis ikke, plasserer de 40 mL tilbake i brønnen og gjenta forrige trinn.
10. Forsiktig røre Vial en (ikke risikere vortexblanding, den kan skade den sfæroide) før overføring av blandingen i 60 pl porsjoner i tre separate brønner i en 96-brønns plate. Inspiser hver brønn med et mikroskop etter å ha lagt blanding for å avgjøre hvilken brønn inneholder spheroid.
11. Legg ~ 2 pl 1 M NaOH og 40 pl av cellekulturmedier til Vial 2 og vortex før aliquotting 60 pl av denne blanding til en tom brønn i 96-brønns plate og merking som en kontroll.
12. Sett platen i en 37 ° C inkubator for å herde i minst 1 time.

Tre. Konstruer Grid av prøvepunkt og ta en video på hvert punkt

1. Overfør prøveplaten fra inkubatoren til objektbordet. Tillat 10 min for prøven å equilibrate ved romtemperatur dersom et oppvarmet stadium ikke er tilgjengelig.
2. Observer prøven med lavt drevet objektiv for å sikre at det er intakt og klar for bildebehandling. Bestem tumor posisjon i brønnen.
3. Bestem hvor mange prøvepunkter for å ta. Vanligvis vil 20 samplingspunkter i hver brønn, fordelt i konsentriske ringer rundt den sfæroide produsere tilstrekkelig detaljerte resultater.
4. Flytt scenen til hver ønsket posisjon og bruke mikroskop grensesnitt programvare for å spille inn de x-og y-koordinater (eller posten koordinater manuelt hvis interfacing programvare er utilgjengelig).
5. Slå mikroskopet til en høy drevet objektiv (typisk 100X), og velg riktig filter kuben for eksitasjon bølgelengde av tracer sonder. Bruk listen med punkter som er opprettet i trinn 3.4 for å gå til første punkt i nettet.
6. Juster fokus for å finne bunnen av brønnen, og deretter flytte opp å finne et synsfelt (FOV) inneholder flere i-fokus traceh sonder.
7. Observer intensiteten histogrammet og justere eksponeringen intensitet og tid til å gi størst dynamisk område som er mulig og samtidig sikre at bildet ikke blir mettet.
8. Skaff en videosekvens med en bildefrekvens på 20-30 msek per ramme (ca. 800 rammer eller 16-24 sek i lengden er anbefalt å gi tilstrekkelig statistikk for robust MSD beregning balanseres med behovet for å minimere oppkjøpet tid på hver romlige gitterpunkt) og lagre med et passende konvensjonen. Under innspillingen ikke berører mikroskop eller bord.
9. Gjenta trinn 3.6 til 3.9 for hver prøve punkt i nettet.
10. Gjenta trinn 03.03 til 03.10 for hver brønn i forsøket.

4. Analyser Video data til å beregne reologiske egenskaper ved hvert prøvepunkt

1. Kopier alle videodata til en analyse mappe (muligens på en annen datamaskin).
2. Importer bildedata i MATLAB eller annen analyse programvare.
   NOTE: Omfattende dokumentasjon om settet med MATLAB partikkelsporingsrutiner vedtatt her er tilgjengelig på http://people.umass.edu/kilfoil . Bruken av et tilpasset kalle funksjonen for å automatisere prosessering av flere filer på ulike stillinger er anbefalt.
3. Kalibrere programvaren ved å analysere flere rammene i videoen til riktig bestemme valg og avvisning parametre (størrelse, båndpass, etc) for å identifisere probe senterposisjoner. Omfattende bakgrunn for disse avgjørende skritt er beskrevet av Crocker og Grier.
4. Bruke programvaren til å bestemme automatisk hver sonde posisjon for alle videorammer og deretter koble disse stillingene i baner.
5. Bruk bane data for å beregne middelverdien squared forskyvning (MSD) som en funksjon av lag tid, være sikker på å bruke den aktuelle romlige kalibreringsfaktoren (mikrometer per piksel) for den spesifikke objektiv, noe pixel binning, etc (typisk gjennomførti meta-data).
6. Beregn G * (ved hjelp av generalisert Stokes-Einstein forhold tatt i betraktning grensene for anvendelse av GSER for en enkelt prøve ^24,28,43. Alternativt brukere ønsker å tolke ECM eiendommer direkte fra MSD ved ganske enkelt å sammenligne strøm lov skalering, platå verdier, indekser heterogenitet eller andre parametere.
7. Gjenta trinn 4.2 gjennom 4,6 for hver FOV i forsøket.
8. Co-register posisjonsdata fra trinn 3.4 med viskoelastiske modulii på en bestemt frekvens av interesse. Avhengig av produsenten av mikroskopet brukes, kan dette trinnet bli tilrettelagt av en tilpasset rutine som leser mikroskop metadata eller posisjonsdata kan bli ordnet manuelt.
9. Bruk 3D interpolasjonsfunksjonene å generere et romlig reologi kart over ECM.

Representative Results

For å verifisere gyldigheten av G * (ω) målinger ved lokaliserte stillinger innenfor en kompleks modell svulst mikromiljøet, ble det gjennomført to innledende valideringsforsøk. Først forsøkte vi å validere våre målinger mot "gullstandarden" av bulk oscillasjon rheometry. Vi har fremstilt identiske prøver av kollagen matriks (uten celler) ved en konsentrasjon på 1,0 mg / ml kollagen. Disse prøver ble analysert med en bulk rheometer (TA Instruments AR-G2, ved bruk av 40 mm parallell plategeometri) og av PTM (med de samme parametre som i denne protokoll), og de resulterende målinger av G '(ω) og G "(ω ) ble sammenlignet (figur 2A). Utmerket avtale ble funnet mellom de to målingene. Dernest, for å etablere evne til denne protokollen for å måle punkt endringer i ECM reologi vi utarbeidet en 1,0 mg / ml kollagen matrise og innebygd sporings perler. Prøven ble deretter behandlet med ensentralisert injeksjon av 5 pl dispase (figur 2B), som raskt fordøyer kollagen. Etter inkubering i 3 timer for å gi lokaliserte kollagen fordøyelse til å forekomme, er videodata tatt ved varierende avstander fra injeksjonsstedet, og målinger av G '(ω) og G "(ω) ble gjort i hvert tilfelle. Størrelsen av G "(ω = 1 rad / sek) ble funnet å være større enn den for G '(ω = 1 rad / sek) ved injeksjonsstedet. Målinger tatt ved økende avstander fra injeksjonsstedet ble funnet å ha en økende størrelsen av G *, så vel som en økende forhold mellom G 'G "(figur 2C). Størrelsen av sterkt degradert regionen ~ 2 mm er i samsvar med en beregnet avstand fra diffusjon av et protein med hydrodynamisk radius R _H = 1 nm (molekylvekten av dispase er 32,5 kDa) via digerert kollagen med viskositet på η = 10 ^{- 3} Pa sek ved 37 ° C: . Derfor resultatene enig med forventet oppmykning av matrisen nær injeksjonsstedet, og demonstrerer vår evne til å gjøre nøyaktige, lokaliserte målinger av matrise reologi.

Representative data fra en 3D-tumormodellen fremstilt i henhold til denne protokollen er vist i figur 3.. Videodata ble innsamlet i 19 faste steder innenfor kollagen stillaset, danner en grov gitteret på tumor (figur 3A). Dette koordinatsystem data ble kombinert med beregnede verdier for G '(ω) for å skape en romlig kart over ECM stivhet (figur 3B). Denne romlig kart viser klart en sone med økt stivhet umiddelbart proksimalt til svulsten sfæroide ved dag 2, som kan bli korrelert med avleiring av kollagen IV, V laminin end andre basalmembran-komponenter avsatt av den sfæroide selv ^17,18,44,45 eller en lokal sammentrykning av ECM av det ekspanderende sfæroide.

Tumorvekst og matrise invasjon hendelser ble overvåket i fire dager. To regioner ble identifisert til å ha enten ingen tegn på invasive celler på tumor periferi, eller uttalt bevis for invaderende celler (figur 3C). PTM målinger ble tatt på regionene 1 og 2 over 4 dager. Etter dag 4 var det en signifikant forskjell i G '(rapportert på en rad / sek) mellom de to regionene (figur 3D). Frekvensavhengig målinger av G 'og G "for regionene 1 og 2 på dag 4 viser betydelig oppmykning av ECM i region 2, den invasive regionen (Figur 3E). På dag 4 region to utstillinger en væske-lignende viskoelastisk respons, tydelig av viskøs skalering av G "plottet (Figur 3E).

Representant sub-optimalResultatene fra vanlige eksperimentelle og analysefeil er vist i figur 4.. Kanskje den mest åpenbare feilkilden ligger i stabiliteten av oppsett på hvilken videomikroskopi utføres. Ved laboratoriebenken er forskjøvet, eller hvis det er noen annen ekstern kilde til vibrasjoner, kan kulebaner være kunstig påvirket, noe som resulterer i en dor i dataene. Drift fører til at MSD å øke dramatisk ved høy lag ganger (Figur 4A) som også fører til at G '(ω) og G "(ω) beregnede verdier for å øke kraftig ved lave frekvenser (Figur 4B). Drift kan reduseres gjennom bruk av en pneumatisk, luft polstret lab benk, og ved å ta vare å ikke støte oppsettet mens videoer blir registrert. I tillegg kan drift bli fjernet i løpet av etterbehandling ved hjelp av programvare rutiner. Disse rutiner er egnet for fjerning av doren som er omtrent ensartet over et visst tidsintervall. Uberegnelig drift (kanskje forårsaketved bumping scenen under datainnsamling) er mer problematisk. Derfor er det viktig å sørge for at prøven er fortsatt mekanisk isolert fra omgivelsene under datainnsamling.

En annen potensiell kilde til uklare resultater kommer fra feilaktig tolkning av prøve heterogenitet. Selv om evnen til å observere og kvantifisere romlig heterogenitet i en prøve er faktisk en av de noterte styrkene PTM ²⁶ (og noe som er tapt i tradisjonelle bulk reologi målinger), kan feil gruppering av klynger av probe baner føre til uriktige konklusjoner. Gitt at endringer i ECM stivhet rapportert av denne metodikken er iboende heterogene, som er selve materialet, i en gitt synsfelt, kan det være noen tracer sonder som ikke er elastisk begrenset av kollagenfibre og dermed gratis til stokastisk utforske større vann fylte porer (Figur 4C). Disse "løse" prober utstillings mobility lag i samsvar med en rent viskøs miljø. Siden data for alle sonder er i gjennomsnitt før viskoelastiske moduli beregnes, har noen løse prober i et gitt prøvetaking region (synsfelt) kan produsere frekvensavhengig plott av G * (ω) som varierer vilt (Figur 4D).

Uriktig programvarekalibrering kan føre til feil under video innsamling og analyse. Under videodatainnsamlingen er det viktig å observere at intensiteten histogram og justere eksponeringstiden for å gi størst mulig dynamisk område og samtidig sikre at bildet ikke blir mettet. Analysen beregner raffinerte senterposisjonene for hver tracer probe ved å integrere intensitetsverdien for hver piksel. Hvis bildet er mettet, vil denne integrasjonen blir mindre nøyaktige på grunn av en "flat top"-delen av intensitetsprofilen. I tillegg er funksjonen funn kalibrering en ekstremt viktig for å sikre nøyaktige resultater. Riktig valg av valgparametere er viktig. Denne prosessen har blitt beskrevet i stor utstrekning av Crocker og Grier ^42, Savin og Doyle ^43, og andre.

Figur 1. Skjematisk av forsøksfremgangsmåte. (A) Tumor sfæroider er dannet på agarose-senger, og deretter overført til en 3D-matrise som inneholder innebygde prober tracer. (B) videodata blir tatt ved flere punkter i prøvebrønnen, både nær og langt borte fra tumor sfæroide. (C) Den stokastiske bevegelse av sondene i hver video blir analysert for å bestemme de lokale reologiske egenskapene til grunnmassen ved hvert prøvepunkt. Denne informasjonen blir samlet i en romlig kartlegging av ECM stivhet i hele godt.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Verifisering av målinger. (A) Komponentene i G * (ω) er vist. De beregnede verdier av G '(ω) og G "(ω) ved hjelp av PTM er svært like de som ble oppnådd via en bulk-rheometer. (B) 5 pl av dispase ble innført i midten av en brønn med radius r = 8,5 mm inneholdende 1,0 mg / ml kollagen for å måle forandringer i romlige G * (ω). (C) Beregnede verdier av G '(ω) og G "(ω) på stedet av dispase injeksjon, 1,5 mm fra nettstedet, og 3 mm fra nettstedet. I tillegg ble en kontrollmåling laget i en brønn inneholdende den samme kollagen gel butca uten dispase behandling. I nærheten av behandlingsstedet G '(ω) er mindre enn G "(ω). Når gelen blir samplet lengre fra behandlingsstedet verdiene av G '(ω) blir større enn G "(ω), og omfanget av G * (ω) øker. Målinger ble tatt 2,5 time etter dispase injeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 3. Kvantifisering av endringer i ECM reologi samtidig med starten av lokal matrise invasjon. (A) Brønnen inneholdende en PANC-1 3D sfæroide blir analysert på flere steder i hele kollagen ECM rundt svulsten. (B) Koordinat data er kombinert med calculated G '(ω) for hvert sted for å produsere en romlig ECM stivhet kart. (C) Tumor vekst og invasjon oppførsel ble overvåket i 4 dager. To regioner ble identifisert som å ha enten ingen interaksjon med invaderende celler (region 1, blå stjerne) eller tung interaksjon med invadere celler som spontant forgrenede ut fra den store primær flercellet spheroid masse (region 2, rød stjerne). (D) Reologiske målinger ble tatt på regionene 1 og 2 over 4 dager. Ved den fjerde dagen, var det en signifikant forskjell i G '(rapportert på en rad / sek) mellom de to regionene. (E) frekvensavhengig målinger av G '(ω) og G "(ω) for regionene 1 og 2 på dag 4 viser betydelig mykning av ECM i region 2, nøyaktig korrelert med tilstedeværelse av invasive populasjoner. G '(ω) og G "(ω) verdier beregnet ved hjelp av en power law skikket til MSD data vises som fylt og tomt punkt resdalene. På dag 4, regionens to utstillinger en væskelignende viskoelastisk respons som er tydelig av tyktflytende skalering av G "(ω) plot og fraværet av den linjen som passer for G '(ω). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 Data. Fra sub-optimale resultater på grunn av drift og uriktig tolkning av ECM heterogenitet. (A) MSD av en tracer-probe innesperret i et komplekst materiale som følger power law skalering <Ar ² (τ)> ~ ^τ α (0 ≤ α ≤ 1). Følgelig bør MSD verdier nærme et platå på lange lag ganger. Drift i prøven kan kunstig eliminere dette problemet, leading å eskalere MSD verdier ved lange etterslep ganger. (B) Den lange oppholdstid drift i MSD vil føre til at verdiene for G '(ω) og G "(ω) til å bli vesentlig feilaktige med korte frekvenser. Drift kan elimineres eller reduseres enten ved å sikre at prøven er mekanisk isolert under datainnsamlingen eller ved hjelp av programvare rutiner for å fjerne drift under analysen. (C) Selv i et lite synsfelt, kan to forskjellige varianter av probe-baner være til stede. I dette eksemplet, er det meste av sonder innesperret i matrisen, men noen få er "løs" - deres baner er mye mindre anstrengt. (D) Forsøk på å tolke MSD data fra både begrenset og ubegrenset sonder på samme tid uten riktig tolkning av prøve heterogenitet vil forvirre målinger av viskoelastiske moduli. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I denne protokollen introduserer vi en robust og allment gjeldende strategi for lengde sporing lokale endringer i ECM stivhet i 3D tumor modeller. Vi ser for oss at denne metoden kunne bli adoptert av kreft biologer og Biophysicists interesserte i mechanosensitive atferd innblandet i matrise ombygging i løpet av tumorvekst og invasjons prosesser. Presis kvantifisering av matriksdegradering kinetikk kan være spesielt verdifull for de som studerer aktiviteten til matrise metalloproteaser, lysyl oksidase eller andre relevante biokjemiske arter i 3D tumormodeller som er direkte knyttet til matrise remodeling. Utover søknaden til 3D tumormodeller er beskrevet her, kan man videre tenke seg gjennomføringen av denne tilnærmingen i forbindelse med andre sykdommer modellsystemer der modifikasjon av matrix reologi over tid spiller viktige roller ^46,47. Nytten av denne metoden fortsetter å bli styrket gjennom programvareforbedringer som ytterligere automate prosessen og gir mulighet for økt gjennomstrømning studier. Dette vil resultere i mer detaljerte bilder av fysiske landskapet i mange prøver samtidig, for bruk i multi-brønn format.

Her vi spesifikt beskriver gjennomføring av passiv partikkel-sporings microrheology i 3D-tumormodeller, noe som er godt egnet for måling av den lineære viskoelastiske respons i området fra ~ titalls Pascal typiske for kommersielt tilgjengelige ekstracellulære matriks-komponenter (bovint kollagen, EHS-tumor-ekstrakter eller kommersielle nanofiber stillaser). Observasjonen av stokastiske, termisk drevet bevegelse, selv med høy numerisk apertur optikk for å kvantifisere liten sonde forskyvninger, er i seg selv begrenset til den lineære regime av disse relativt myke ECM miljøer, men etterforskere som ønsker å sondere mer stive materialer kan være i stand til å tilpasse denne protokollen for bruk med aktive manipulasjoner via optisk ⁴⁸ eller magnetisk overlapping ⁴⁹ av prober. Since av de optiske eller magnetiske pinsett probe et enkelt punkt i en prøve, og påvirker ikke integriteten til prøven, kan disse teknikker eventuelt inkorporeres i de ovennevnte protokoll for å oppnå langsgående målinger av flere stive prøver.

Det er viktig å observere at andre celle genereres krefter kan også bidra til tracer-probe bevegelser ved forskjellige tidsskalaer. For eksempel under cellemigrasjon forekommende i løpet av timer og dager i kultur, klynger av prober vil bli skjøvet og trukket på grunn av cellebevegelser og det er faktisk denne bevegelse som utnyttes i trekkraft mikros ^50,51. Den termisk drevne probe bevegelser som analyseres for å oppnå microrheology data finner sted i størrelsesorden sekunder, en klart adskillbare tidsskala. Mens det er også sant at de tregere dynamikk påkjenninger og belastninger forbundet med trekkrefter kan bidra til lokale endringer i reologi ^36, en styrke på denne bildebehandling-bdessuten økt tilnærming ligger i evnen til å korrelere visuelle og rheologiske endringer i prøven. For eksempel i de representative resultater i figur 3, en åpenbar matriks invasjon og cellemigrasjon arrangementet er korrelert med en endring i G 'nesten fire størrelsesordener under den tid denne migrering finner sted.

Protokollen er beskrevet her forutsetter at brukerne har tilgang til et mikroskop med en motorisert scene som gir reproduserbare posisjonering av prøven. Labs som ikke har denne instrumentering kan fortsatt gjør punktmålinger ved bruk av merker eller andre visuelle indikatorer i prøven eller i prøvebæreren til å tillate gjentatte målinger på samme punkt, men det vil sannsynligvis være vanskelig å oppnå den samme reproduserbarhet i posisjon som vist i representative langsgående målinger her. Ved anvendelsen av disse representative resultater ovenfor, anbringelse på z-aksen ble holdt tilnærmet konstant. Imidlertid protokollen belld også bli endret for å omfatte flere målinger langs z-aksen for å skape en 3D reologiske kart av prøven. Metoden kan også bli endret for å utnytte en scanning laser confocal eller en multiphoton teknikker for 3D seksjonering om skannehastigheter ville innføre en begrensning på de øvre frekvensgrenser tilgjengelige som kan eller ikke kan være problematisk for en gitt applikasjon.

I denne fremgangsmåten blir en betydelig tid begrensning pålegges av nødvendigheten av å returnere levende celler til inkubatoren. Uten en time-lapse værstasjon kabinett for å kontrollere for temperatur, fuktighet og CO ₂ nivåer, må bildet oppkjøpet tid minimeres. Selv med passende utstyr, tar datainnsamling opp store mengder av tid og digital hukommelse, som begge er utsatt for praktiske begrensninger. For eksempel med mikroskop og kamera som brukes i denne studien, vil det ta omtrent 35 timer å ta de om lag 4000 videoer nødvendig å kartlegge en enkelt brønn på en 96-Brønns plate ved hjelp av en 100X objektiv uten mellomrom mellom synsfelt. Disse faktorene pålegge begrensninger på antall datapunkter som realistisk kan samles. Detaljnivået er derfor underlagt de praktiske begrensningene pålagt av tid tilgjengelig for datainnsamling, datalagring plass og tilgjengeligheten av en miljø boliger.

Evnen til å kvantifisere endringer i ECM rheology kunne bli ytterligere integrert sammen med bildebaserte metoder for kvantifisering av terapeutisk respons i 3D tumormodeller ^17,18,52,53. Den multi-brønn 3D-modell kultursystemet som ble vedtatt i begge metodene foreslår en parallell implementering som gir sammenheng mellom cytotoksiske respons og modifikasjon av den mekaniske miljø. Dette kan legge til rette for utvikling av videre strategier som eksplisitt retter seg mot den mekaniske fenotype eller belyser effekten av eksisterende legemiddelselskap i denne kapasiteten. Slik innsikt kan være direkte relevant for enpproaches å forbedre levering av legemidler gjennom tett kollagenrikt tumor stroma. For eksempel, i sammenheng med den representativ illustrasjon av denne protokoll er presentert her med in vitro pankreatiske tumormodeller, evaluering av matriksdegradering følgende intervensjoner kan brukes i screening stromal uttømming regimer, et stadig mer viktig terapeutisk paradigme for pankreascancer ^54..

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, CA	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, CA	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford, MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA