粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

Abstract

機械的な微小環境は、それ自体が複雑な、双方向の機械受容相互作用のセットの一部として改造および修飾された腫瘍増殖挙動およびシグナル伝達の重要な調節因子として作用することが示されている。生物学的に関連する3D腫瘍モデルの開発は、腫瘍成長に対するマトリックスレオロジーの影響に関する機構研究を促進してきたが、腫瘍によって誘発される機械的環境におけるマッピングの変更の逆問題は、依然として厳しい。ここでは、縦方向にその場で 、腫瘍微小環境内の物理的変化を監視するための堅牢かつ実行可能なアプローチの一環として、膵臓癌の3Dモデルと連携して、粒子追跡マイクロレオロジー（PTM）の実装について説明します。ここに記載した方法では、蛍光標識プローブが均一に経口投与するための分散モデル細胞外マトリックスI型コラーゲンの（ECM）足場内に埋め込 ​​まインビトロ 3Dモデルを製造するシステムを統合試料全体sitionおよび時間依存性マイクロレオロジー測定。 インビトロ腫瘍はマルチウェルイメージングプレートを用いた並列状態でプレーティングし、プローブする。確立された方法で描画、トレーサプローブの動きのビデオは複雑な周波数依存粘弾性せん断弾性率G *（ω）を報告するために一般化ストークスアインシュタインの関係（GSER）を介して変換されます。この方法は画像ベースであるため、機械的特性評価も同時に3Dの腫瘍の大きさと表現の質的変化を報告するために大規模な透過光の空間のフィールドにマッピングされます。ローカライズされた侵入に誘導されるマトリックス分解だけでなく、システムのキャリブレーションに関連するサブ地域での機械的応答を対比示す代表的な結果は、検証データを提示する。一般的な実験誤差およびこれらの問題のトラブルシューティングから望ましくない結果も提示されています。このプロトコルで実装された96ウェルの3D培養メッキ形式はc治療スクリーニングアッセイまたは機械的微小環境に対する治療的または生化学的な刺激の影響に新たな洞察を得るための分子イメージングとマイクロレオロジー測定の相関onducive。

Introduction

それは、癌細胞が、非悪性の哺乳動物の上皮細胞と同様に、周囲の細胞外マトリックス（ECM）の機械的および生物物理学的特性および他の微小環境の成分^1-9に非常に敏感であることが文献において多くの証拠から明らかである。エレガントなメカニズムの研究は、悪性増殖挙動や形態形成^2,3,10,11を規制する複雑な機械受容シグナル伝達パートナーのような細胞外剛性の役割への洞察を提供してきました。この研究は、生物学的に関連する組織の構造を復元し、調整可能な力学と足場材料中で増殖させ、光学顕微鏡^12-19によって画像化することができるインビトロ腫瘍モデルにおける 3Dの開発によって、特に、促進された。しかし、今度は癌細胞がその周囲のレオロジーを改変を通して、腫瘍微小環境との間のこの対話mechanoregulatory、他方の側は、多少残る勉強するのがより困難。例えば、侵入プロセスの間、腫瘍の周囲の細胞は、順番にの機械受容増殖挙動に影響を与えるECM ^20-22の局所的な劣化を引き起こす間葉移行（EMT）に上皮を受け、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の発現を増加させることができる他の近位の腫瘍細胞。生化学的プロセスのさまざまな、癌細胞は、継続的に異なる時間に異なるプロセスに合わせて上下にその環境の局部剛性をダイヤルします。ここに記載された方法論は、3D腫瘍モデルと統合され、文化を終了せずに生化学的および表現型の変化を縦方向に相関させることができる成長中の剛性とECMの遵守の局所的な変化を報告分析ツールの必要性が動機とされている。

これに関連して実施するための適切な技術を求めて、粒子追跡マイクロレオロジー（PTM）が有力な候補として浮上。この方法は、メイソンとワイツ^23,24によって元々の先駆者、ミクロンの長さスケールでの周波数依存性複合体の粘弾性せん断弾性率G *（ω）を報告するために、複雑な流体中に埋め込 ​​まれたトレーサプローブの動きを使用しています。この一般的なアプローチは、ソフト凝縮物質、コロイド、生物物理学、高分子物理学^25-31で別の用途に適した複数のバリエーションで展開してきた。局所粘弾性の読み出しを培養調製時に組み込まれ、成長の長期間にわたって定位置に残留する生化学的に不活性トレーサープローブの非破壊ビデオイメージングにより提供されているのでPTMは、他の方法に比べて特定の利点を有している。これは必ずしも文化の終了を必要とし、複雑な3D腫瘍microenvir内のポイントの測定値ではなく、サンプルのバルク巨視的レオロジーを報告する振動剪断バルクレオメーター、とゴールドスタンダードの測定とは対照的であるふりかかる。実際、多くの研究は、細胞遊走^32、拡大回転楕円体³³によって誘発される機械的ストレス、細胞内レオロジー^34,35に関連付けられた変形を測定するために、癌または非癌細胞または周りトレーサープローブの動きの測定値を解釈するの有用性を例示している機械的応力とひずみエンジニアリング組織³⁶内、および細孔径および浸潤速度の³⁷との関係をマッピングする。例えば、原子間力顕微鏡（AFM）などのマイクロレオロジーのに適した他の技術は、実現することができるが、主に、試料表面の点をプロービングするための長手方向の測定値^38を複雑培養無菌性の問題を引き起こすことがある。

ここでは、確実に空間をマッピングするためのビデオの粒子追跡および分析方法のために埋め込まれた蛍光プローブを用いたECMへの転送に適した3D腫瘍スフェロイドの成長のための方法を網羅する総合的なプロトコルを記述文化の中で時間をかけてマイクロレオロジーの変化。現在の実装では、3次元腫瘍モデルはこのフォーマットが助長している他の伝統的なアッセイ（ 例えば 、細胞毒性）とマイクロレオロジー測定を組み込むことを視野に、マルチウェル形式で増殖させる。この方法論のこの代表的な実例では、本明細書に記載のPANC-1細胞を用いてインビトロ 3Dスフェロイド培養 、スフェロイド^39を形成することが知られている確立された膵臓癌細胞株が、すべての測定は、様々な細胞株を用いて、固形腫瘍を研究するために広範に適用可能である3D培養に適しています。この方法は、本質的に画像化ベースであるためには、理想的に細胞の増殖、移動および表現型の変化をレポートビューの大透過光のフィールドを持つ高解像度のマイクロレオロジーデータの共同登録のために適しています。このように、透過光顕微鏡と統合され、PTMの実装では、顕微鏡ステージWHの再現可能なポジショニングを前提としていICHは電動商用広視野落射蛍光生物顕微鏡に一般的に使用可能です。下の開発されたプロトコルは、いかなる合理的に装備し、自動化蛍光生物顕微鏡を用いて実施することができる。これはオフライン処理のためのデジタルビデオ顕微鏡ギガバイトのデータの取得が必要で、本質的にデータ集約型の方法である。

以下のプロトコルにおいて、プロトコル1アガロース上でオーバーレイを使用してここに記載されているが、このような懸滴^40、又は⁴¹回転培養技術などの他の様々な方法で置換することができる腫瘍スフェロイドの最初の調製に関する。プロトコル2は、代替的に、 インビトロの3D腫瘍はECM ^12,15で再懸濁された細胞ではなく、単一の予め形成された非接着性スフェロイドの封入又は包埋することによって成長させることができたもののコラーゲン足場でスフェロイドを埋め込 ​​む方法が記載されている。その後のプロトコルは、Oのための手順について説明それぞれ、ビデオ顕微鏡データを取得し、処理することにより、時間分解マイクロレオロジー測定をbtaining。データ処理は、もともとも広範囲に異なるソフトウェア·プラットフォーム用に開発されているクロッカーとグリア⁴²で説明したアルゴリズムに基づいて構築さPTMのためのオープン·ソース·ルーチンを利用して、MATLABを使用して記述されている（参照http://www.physics.emory.edu/ 〜週/ IDL /）。

Protocol

1。培養腫瘍球

1. 1％アガロース溶液を得るために、アガロース0.1gの細胞培養グレードの水10mlを混合する。
2. 96ウェルプレートにウェルにアガロース溶液40μlを小分けする前に、70℃以上（標準電子レンジでまたは加熱板を用いておよそ14秒）への熱アガロース溶液。
3. 標準的な技術を用いて細胞を採取しながら、少なくとも1時間、37℃でプレートをインキュベートする。
4. 懸濁液中の細胞の濃度を決定するために、血球計を使用する。
5. 千個/ mlに細胞懸濁液を希釈し、十分に硬化したアガロース床を含む、この希釈液100μlを加える。
6. 37℃、5％CO ₂に設定したインキュベーター内で一晩振とう機上でサンプルを置きます。
7. シェーカーからサンプルを取り出して、細胞培養培地を100μlを加える。
8. 所望の直径に到達するまでスフェロイドをインキュベートする。例えば、9日後に、SPheroidは、直径約450ミクロンとなります。この時間の間、新鮮な増殖培地をウェルに添加することができるが、これは回転楕円体の除去をもたらすので、吸引は避けるべきである。

2。ECMに埋め込まれた3D腫瘍球の準備

1. 層流フード内に必要な材料とワークステーションを準備します。
2. 25部の滅菌水に2部株価プローブ（2％固体）を添加することにより、カルボン酸で修飾された直径1μm蛍光トレーサープローブの希釈液を調製する。
3. 冷蔵庫から3.1 mg / mlのウシコラーゲンのボトルを取り出して、氷の上に置きます。
4. 空の2ミリリットルバイアルにアリコートコラーゲンの125μlの。
5. プローブを配布するために簡単にコラーゲンと渦を含むバイアルに希釈したトレーサープローブ溶液50μlを追加します。
6. 41の総容積のために（黄色に変わります）フェノールレッドを含む適切な細胞培養培地の235μl加え205ミリリットル（ハーフ総量）を除去し、新たな2ミリリットルバイアル中に配置する前に簡単に0ミリリットルと渦。バイアル1は、腫瘍スフェロイドが含まれていますし、バイアル2は、対照混合物となります。
7. 中性pH（フェノールレッドを含む培地が赤に戻らなければならない）に戻す解決策を持って来るために1をバイアルに1 M NaOHでの〜2を添加する。これは混合物は、それが氷上に保持されていない場合は、硬化を開始させることに注意してください。簡単に、すぐに氷棚に戻り、その後、混合する渦。
   注：回転楕円体は、文化の9日後に肉眼ではほとんど見えないし、アガロース床からの除去がデリケートな作業である。解剖顕微鏡の使用は、一部のユーザーのために有用であり得る。転送中に回転楕円体の完全性を維持することが最重要である。
8. 広口ピペットチップを使用して、静かによく腫瘍スフェロイドを含むからメディアを40μlを削除します。次のステップを行いながら、この40μlを保管しておいてください。
9. 回転楕円体かどうかを確認するために十分に確認してください前のステップで除去した。それがあった場合は、1をバイアルに回転楕円体を含む40μlを加える。ていない場合は、バックウェルに40μLを配置し、前の手順を繰り返します。
10. 静かに96ウェルプレートの3つの別々のウェルに60μlの部分に物を転送する前に（ボルテックスを危険にさらすしないでください、それは回転楕円体に損傷を与える場合があります）バイアル1をかき混ぜる。うまく回転楕円体が含まれているかを決定するために混合物を添加した後に顕微鏡で各ウェルを検査します。
11. コントロールとして96ウェルプレートとラベルの空のウェルにこの混合物の60μlのを等分する前にバイアル2と渦に〜2μlの1 M NaOHおよび細胞培養培地40μlを追加します。
12. 少なくとも1時間、硬化させるために37℃のインキュベーターでプレートを置きます。

3。サンプル点のグリッドを構築し、各ポイントで動画を撮影

1. 顕微鏡のステージにインキュベーターからサンプルプレートを転送します。サンプルのための10分EQUILすることができます加熱されたステージが利用できない場合、室温でibrate。
2. 必ずそれはそのままとイメージングのための準備ができているように、低パワーの対物レンズで試料を観察する。ウェル内の腫瘍の位置を決定する。
3. 取る何サンプル点を決める。一般的には、回転楕円体の周囲に同心円状に分布して各ウェル中の20のサンプル点は、十分に詳細な結果が生成されます。
4. 各目的の位置にステージを移動し、（ソフトウェアのインタフェースが使用できない場合は、手動で座標またはレコード）は、x座標とy座標を記録するために顕微鏡のインタフェースソフトウェアを使用しています。
5. ハイパワーの対物レンズ（通常は100倍）に顕微鏡を切り替え、トレーサープローブの励起波長のための適切なフィルターキューブを選択します。グリッドの最初のポイントに移動するために、ステップ3.4で作成された点のリストを使用してください。
6. 視野を見つける上に移動して、ウェルの底を見つけることでピントを合わせる（FOV）は、いくつかの焦点の合ったTracを含むERプローブ。
7. 輝度ヒストグラムを観察し、画像が飽和しないようにしながら可能な最大のダイナミックレンジを与えるために露光強度や時間を調整します。
8. フレーム当たり20〜30ミリ秒のフレームレートでビデオシーケンスを取得する（約800フレームまたは長さが16〜24秒では、各空間格子点における捕捉時間を最小化する必要性とのバランスがロバストMSD計算のための十分な統計を提供することをお勧めします）そして、適切な慣例で保存します。録音中は、顕微鏡やテーブルに触れないでください。
9. 繰り返しは、グリッド内の各サンプル点のために3.9〜3.6を繰り返します。
10. 繰り返し実験で各ウェルについて3.10に3.3を繰り返します。

4。各サンプル点でのレオロジー特性を計算するためにビデオデータの分析

1. （おそらく別のコンピュータ上の）分析フォルダに、すべてのビデオ·データをコピーします。
2. MATLABにインポートされた画像データや他の解析ソフトウェア。
   NOTEは：ここで採用したMATLABの粒子追跡ルーチンのセットに関する詳細なドキュメントは次の場所にありますhttp://people.umass.edu/kilfoil 。異なる位置に複数のファイルの処理を自動化するためのカスタム呼び出し元の関数の使用が推奨されます。
3. 適宜、プローブの中心位置を識別するための選択および拒絶パラメータ（サイズ、帯域など）を決定するために、ビデオのいくつかのフレームを分析することによってソフトウェアを較正する。これらの重要なステップのための広範囲な背景はクロッカーとグリアに記載されている。
4. 自動的にすべてのビデオフレームのための各プローブの位置を決定し、軌道にこれらの位置をリンクするためにソフトウェアを使用する。
5. など具体的な対物レンズ、任意のピクセルビニングのために適切な空間較正係数（ピクセルあたりμm）を適用してくださいという、遅れ時間の関数としての平均二乗変位（MSD）を計算するために軌跡データを使用します（通常は行わメタデータ）。
6. 特定のサンプル^24,28,43用GSERの適用可能性の限界は、また、ユーザは単にべき乗スケーリング、プラトーを比較することにより、MSDから直接ECMのプロパティを解釈したい場合を考慮し一般化されたストークス·アインシュタインの関係を用いて、G *は（計算異質性やその他のパラメータの値、指標。
7. 繰り返し実験で、各FOVのために4.6を通じて4.2を繰り返します。
8. 関心のある特定の周波数での粘弾性moduliiでステップ3.4からの位置データを共同登録してください。使用される顕微鏡の製造業者によっては、このステップは、顕微鏡メタデータまたは位置データを手動で表にすることができる読み出すカスタムルーチンによって促進することができる。
9. ECMの空間的なレオロジーマップを生成する3次元の補間関数を使用します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, CA	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, CA	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford, MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA