Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Longitudinal Måling af ekstracellulær matrix Stivhed i 3D tumormodeller med Partikel-tracking Microrheology

Published: June 10, 2014 doi: 10.3791/51302
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston
* These authors contributed equally

Summary

Partikel-tracking microrheology kan anvendes til ikke-destruktivt kvantificere og rumlig kortlægning af ændringer i ekstracellulær matrix mekaniske egenskaber i 3D tumormodeller.

Abstract

Den mekaniske mikromiljø har vist sig at fungere som en afgørende regulator af tumorvækst adfærd og signaler, som selv ombygget og ændret som en del af et sæt af komplekse, to-vejs mekanosensitive interaktioner. Mens udviklingen af ​​biologisk relevante 3D tumormodeller har lettet mekanistiske undersøgelser om virkningen af ​​matrix reologi på tumorvækst, det inverse problem med kortlægning ændringer i det mekaniske miljø induceret af tumorer er stadig udfordrende. Her beskriver vi implementeringen af partikel-tracking microrheology (PTM), sammenholdt med 3D-modeller af kræft i bugspytkirtlen som en del af en robust og levedygtig metode til længderetningen overvåge fysiske ændringer i tumor mikromiljø, in situ. Den her beskrevne metode integrerer et system forberede in vitro 3D-modeller indlejret i en model ekstracellulære matrix (ECM) stillads af type I kollagen med fluorescens-mærkede prober jævnt fordelt til position-og tidsafhængige microrheology målingerne i hele prøven. In vitro tumorer forgyldt og undersøgt i parallelle forhold ved hjælp multibrønds imaging plader. Tegning på etablerede metoder, er videoer af tracer probe bevægelser forvandlet via den generelle Stokes Einstein Relation (GSER) for at rapportere det komplekse frekvensafhængig viskoelastiske forskydningsmodul, G * (ω). Fordi denne tilgang er imaging-baseret, er mekanisk karakterisering også kortlagt på store transmitteret lys rumlige felter samtidig rapportere kvalitative ændringer i 3D tumor størrelse og fænotype. Repræsentative resultater, der viser kontrasterende mekanisk reaktion i delregioner forbundet med lokaliseret invasion-induceret matrixnedbrydning samt system kalibrering, er datavalidering præsenteres. Uønskede resultater fra almindelige eksperimentelle fejl og fejlfinding af disse spørgsmål er også præsenteret. 96-brønds 3D kultur plating format implementeret i denne protokol er conducive til korrelation af microrheology målinger med terapeutiske screeningassays eller molekylær billeddannelse til at få ny indsigt i virkningen af ​​behandlinger eller biokemiske stimuli på den mekaniske mikromiljø.

Introduction

Det fremgår af en voksende mængde af beviser i litteraturen, at kræftceller, som med ikke-maligne pattedyr epitelceller, er meget følsomme over for de mekaniske og biofysiske egenskaber af den omgivende ekstracellulære matrix (ECM) og andre microenvironment komponenter 1-9. Elegant mekanistiske undersøgelser har givet indsigt i den rolle ekstracellulære stivhed som et komplekst mekanosensitive signalering partner, der regulerer ondartet vækst adfærd og morfogenese 2,3,10,11. Dette arbejde er blevet lettet navnlig ved udviklingen af 3D i vitro tumormodeller som genopretter biologisk relevant væv arkitektur og kan dyrkes i stillads materialer med afstemmelige mekanik og filmede ved optisk mikroskopi 12-19. Men den anden side af denne mechanoregulatory dialog mellem tumor og mikromiljø, hvorigennem kræftceller gengæld ændre rheologien af ​​deres omgivelser, stadig nogetvanskeligere at studere. For eksempel under invasion processer celler i periferien af en tumor kan undergå epitelial til mesenkymale overgang (EMT), og forøge ekspression af matrix-metalloproteaser (MMP'er), der forårsager lokal nedbrydning af ECM 20-22, hvilket igen påvirker mekanosensitive vækst adfærd andre proximale tumorceller. Gennem en række af biokemiske processer, cancerceller løbende ringe lokal stivhed af deres miljø op og ned for at passe til forskellige processer på forskellige tidspunkter. Den her beskrevne metode er motiveret af behovet for analytiske værktøjer, der rapporterer lokale ændringer i stivhed og overholdelse af ECM under væksten, der kan integreres med 3D tumormodeller og korrelerede langs med biokemiske og fænotypiske ændringer uden at afslutte kulturen.

På jagt efter en passende teknik til at gennemføre i denne sammenhæng, partikel-sporing microrheology (PTM) fremstår som en stærk kandidat.Denne metode, pioner oprindeligt af Mason og Weitz 23,24 bruger bevægelsen af sporstof sonder indlejret i en kompleks væske at rapportere frekvensafhængige komplekse viskoelastiske forskydningsmodul, G * (ω) ved micron længdeskalaer. Denne generelle fremgangsmåde er blevet udviklet med flere variationer egnet til forskellige applikationer i bløde faststoffysik, kolloider, biofysik og polymer fysik 25-31. PTM har visse fordele i forhold til andre metoder, da udlæsninger af lokal viskoelasticitet leveres af ikke-destruktiv video billeddannelse af biokemisk inaktive tracer sonder, der er indarbejdet på tidspunktet for forberedelse kultur og forblive på plads over længere perioder vækst. Dette er i modsætning til guld standard målinger med en oscillatorisk forskydning bulk-rheometer, hvilket nødvendigvis kræver ophør af kultur og rapporter hovedparten makroskopiske rheologi prøven snarere end punktmålinger inden komplekset 3D tumor microenvirjøet. Faktisk en række undersøgelser har vist nytten af fortolkningen målinger af sporstof probe bevægelser i eller omkring cancer eller ikke-cancerceller til at måle deformationer forbundet med cellemigrering 32, mekanisk stress induceret af en ekspanderende sfæroid 33 intracellulær rheologi 34,35 og at kortlægge mekaniske belastninger i manipuleret væv 36, og forholdet mellem porestørrelse og invasion hastighed 37. Andre teknikker er egnede til microrheology, såsom atomic force mikroskopi (AFM) kan gennemføres, men primært til sondering punkter på prøvens overflade, og også kan udgøre kultur sterilitet problemer, der komplicerer langsgående målinger 38..

Her beskriver vi en omfattende protokol omfatter metoder til vækst af 3D tumor spheroids egnet til overførsel til ECM med indlejret fluorescerende prober til video partikel-sporing og analysemetoder for pålidelig kortlægning rumligeændringer i microrheology over tid i kultur. I den nuværende implementering, er 3D tumormodeller dyrket i flere brønde format med udsigt til inkorporering af microrheology målinger med andre traditionelle assays (fx cytotoksicitet), som dette format er befordrende for. I dette repræsentative illustration af denne metode vi kultur in vitro 3D sfæroider ved hjælp PANC-1-celler, en etableret bugspytkirtelkræft cellelinie kendt for at danne sfæroider 39, men alle målinger, der er beskrevet heri, er bredt anvendelige til at studere af faste tumorer ved anvendelse af en række forskellige cellelinjer egnet til 3D-kultur. Fordi denne metode er i sagens natur imaging-baserede det er velegnet til co-registrering af høj opløsning microrheology data med store transmitteret lys synsfelter, der rapporterer ændringer i cellevækst, migration og fænotype. Gennemførelsen af ​​PTM integreret med transmitteret lysmikroskopi på denne måde antager reproducerbar positionering af mikroskopbordet whICH er typisk tilgængelig på motoriserede kommerciel Widefield epifluorescens biologiske mikroskoper. Den protokol udviklet nedenfor kan implementeres med en hvilken som helst rimelighed udstyret automatiseret fluorescens biologisk mikroskop. Dette er en iboende data-intensive metode, som kræver erhvervelse af gigabytes af digitale video mikroskopi data for offline forarbejdning.

I den følgende protokol, protokol 1 vedrører den indledende behandling af tumor sfæroider, som er beskrevet her ved hjælp af overlay på agarose, men kan erstattes med en række andre metoder såsom hængende dråbe 40 eller roterende kultur 41 teknikker. Protokol nr. 2 beskriver processen med at indlejre spheroids i en collagen stillads dog alternativt kunne in vitro 3D tumorer dyrkes ved indkapsling eller indlejring af resuspenderede celler i ECM 12,15, snarere end enkelte præ-dannede ikke-klæbende sphæroider. Efterfølgende protokoller beskriver procedurer for obtaining tidsopløste microrheology målinger ved at erhverve og bearbejde video mikroskopi data, hhv. Databehandling er beskrevet ved hjælp af MATLAB, gør brug af open source-rutiner for PTM bygget på algoritmer oprindeligt beskrevet af Crocker og Grier 42, som også er blevet udførligt udviklet til forskellige software-platforme (se http://www.physics.emory.edu/ ~ uger / IDL /).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Dyrkning Tumor Spheroids

  1. Bland 10 ml cellekultur kvalitet vand med 0,1 g agarose til opnåelse af en 1% agarose-opløsning.
  2. Heat agaroseopløsning til over 70 ° C (ca. 14 sekunder i en standard mikrobølgeovn eller ved hjælp af en varmeplade), før der afmåles 40 pi agaroseopløsning i en brønd på en 96-brønds plade.
  3. Inkubér pladen ved 37 ° C i mindst 1 time, mens høst celler under anvendelse af standardteknikker.
  4. Brug et hæmacytometer til bestemmelse af koncentrationen af ​​celler i suspension.
  5. Fortyndes cellesuspension til 1000 celler / ml, og 100 ul af denne fortynding til den brønd, der indeholder det hærdede agarose seng.
  6. Anbring prøven på et rysteapparat natten over i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  7. Fjern prøve fra shaker og tilsæt 100 ul cellekulturmedier.
  8. Inkuber spheroids indtil den ønskede diameter er nået. For eksempel, efter 9 dage, en spheroid vil være ca 450 um i diameter. I løbet af denne tid, kan friske vækstmedier tilsat til brøndene, men aspiration, bør undgås, da dette vil resultere i fjernelse af sfæroidet.

2.. Forberedelse 3D Tumor Spheroids Embedded i ECM

  1. Forbered en arbejdsplads med nødvendige materialer inde i en laminar flow hætte.
  2. Forbered en fortyndet blanding af carboxylat-modificeret 1 um diameter fluorescerende tracer sonder ved tilsætning af 2 dele lager prober (2% tørstof) til 25 dele sterilt vand.
  3. Fjern en flaske på 3,1 mg / ml kollagen fra køleskabet, og placer den på is.
  4. Aliquot 125 pi af kollagen i en tom 2 ml hætteglas.
  5. Tilsæt 50 ul fortyndet sporstof sonde løsning på hætteglasset med kollagen og vortex kortvarigt at distribuere sonder.
  6. Tilføj 235 pi passende celledyrkningsmedier indeholdende phenolrødt (som bliver gul) til et samlet volumen på 410 ml og vortex kortvarigt, før du tager 205 ml (halvdelen af ​​den samlede mængde) og placere den i et nyt 2 ml hætteglas. Flaske 1 vil indeholde tumor klumpformet og Vial 2 vil være en kontrol blanding.
  7. Tilføj ~ 2 pi 1 M NaOH til Flaske 1 for at bringe opløsningen tilbage til neutral pH (dyrkningsmedier indeholdende phenolrødt bør vende tilbage til rød). Bemærk, at dette vil medføre, at blandingen til at begynde hærdning, hvis den ikke opbevares på is. Vortex kort at blande, og derefter vende tilbage til isen rack med det samme.
    BEMÆRK: klumpformet knapt er synligt for det blotte øje efter 9 dages kultur og dens fjernelse fra agarose seng er en delikat opgave. Anvendelse af et dissektionsmikroskop kan være nyttige for nogle brugere. Opretholde integriteten af ​​sfæroidet under overførsel er altafgørende.
  8. Ved hjælp af en bred mund pipette spids, forsigtigt fjerne 40 pi medier fra brønden, der indeholder tumor klumpformet. Opbevar denne 40 ul, når der udføres det næste trin.
  9. Kontroller brønden for at se, om sfæroidblev fjernet i det foregående trin. Hvis det var, tilsæt 40 ​​ul indeholder sfæroiden at Flaske 1. Hvis ikke, skal du placere 40 ul tilbage i brønden og gentage det forrige trin.
  10. Forsigtigt røre Flaske 1 (ikke risikerer vortex, det kan beskadige klumpformet) før overførsel blandingen i 60 portioner pi i tre separate brønde i en 96-brønds plade. Undersøg hver brønd med et mikroskop efter tilsætning af blandingen til afgøre, hvilken brønd indeholder sfæroiden.
  11. Læg ~ 2 ul 1 M NaOH og 40 pi cellekulturmedier til Flaske 2 og vortex før aliquotting 60 pi af denne blanding til en tom brønd i 96-brønds plade og mærkning som en kontrol.
  12. Pladen anbringes i en 37 ° C inkubator hærde i mindst 1 time.

3.. Construct gitter af prøvepunkter og tage en video på hvert punkt

  1. Overfør prøvepladen fra inkubatoren til mikroskopet fase. Tillad 10 min for at prøven kan Ligevægtstidibrate med rumtemperaturen, hvis et opvarmet scene er ikke tilgængelig.
  2. Prøven observere med lave drevne objektive linser til at sikre, at det er intakt og klar til billeddannelse. Bestem tumor position inden i brønden.
  3. Beslut, hvor mange prøvepunkter at tage. Typisk vil 20 målinger i hver godt fordelt i koncentriske ringe omkring klumpformet producere tilstrækkeligt detaljerede resultater.
  4. Flyt scenen til hver ønsket position og bruge mikroskop interface software til at registrere x-og y-koordinater (eller optage koordinater manuelt, hvis interface software er tilgængelig).
  5. Skift mikroskopet til en høj drevet objektiv (typisk 100X), og vælg den relevante filter terning for excitationsbølgelængden af ​​sporstoffet sonder. Brug listen over punkter, der er oprettet i trin 3.4 for at flytte til det første punkt i gitteret.
  6. Indstil fokus for at finde bunden af ​​brønden, og derefter flytte op for at finde et synsfelt (fov), der indeholder flere i fokus tracare prober.
  7. Overhold intensiteten histogram og juster eksponeringen intensitet og tid til at give den størst dynamikområde muligt, samtidig med at billedet ikke bliver mættet.
  8. Anskaf en videosekvens med en frame rate på 20-30 msek per frame (cirka 800 rammer eller 16-24 sek i længden anbefales at give tilstrækkelige statistikker til robust MSD beregning afvejes med behovet for at minimere erhvervelse tid ved hvert rumlige gitter point) og gem med en passende konvention. Under optagelsen, ikke røre mikroskop eller bord.
  9. Gentag trin 3,6-3,9 for hver prøve punkt i gitteret.
  10. Gentag trin 3,3-3,10 for hver brønd i eksperimentet.

4.. Analyser video data til Compute Reologiske Properties på hver prøve punkt

  1. Kopier alle video data til en analyse mappe (muligvis på en anden computer).
  2. Importer billeddata til Matlab eller anden analyse software.
    NOTE: Omfattende dokumentation vedrørende sæt MATLAB partikel sporing rutiner, der er vedtaget her er tilgængelig på http://people.umass.edu/kilfoil . Det anbefales at anvende en brugerdefineret kaldende funktion til at automatisere behandlingen af ​​flere filer på forskellige positioner.
  3. Kalibrer softwaren ved at analysere flere rammer af videoen på passende bestemme og fravalg parametre (størrelse, båndpas, etc) til at identificere sonde center positioner. Omfattende baggrund for disse afgørende trin er beskrevet af Crocker og Grier.
  4. Brug software til automatisk at bestemme hver probe position for alle videobilleder og derefter knytte disse positioner i baner.
  5. Brug bane data til at beregne den gennemsnitlige kvadrerede deplacement (MSD) som en funktion af forsinkelse tid, at være sikker på at anvende den korrekte rumlige kalibreringsfaktor (mM per pixel) for den specifikke objektiv, enhver pixelsammenfletning osv. (typisk udføresi meta-data).
  6. Beregn G * (ved hjælp af generaliserede Stokes-Einstein forhold taget i betragtning grænserne for anvendeligheden af GSER for en bestemt prøve 24,28,43. Alternativt kan brugerne ønsker at fortolke ECM egenskaber direkte fra MSD blot ved at sammenligne magt lov skalering, plateau værdier, indekser for heterogenitet eller andre parametre.
  7. Gentag trin 4,2 gennem 4,6 for hver fov i eksperimentet.
  8. Co-registrere positionsdata fra trin 3.4 med viskoelastiske modulii på en bestemt frekvens af interesse. Afhængigt af producenten af ​​anvendte mikroskop, kan dette trin lettes ved en brugerdefineret rutine som læser mikroskop metadata eller position data kan tabuleres manuelt.
  9. Anvend 3D interpolationsfunktioner at generere en rumlig rheologi kort over ECM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at verificere gyldigheden af G * (ω) målinger på lokaliserede positioner inden en kompleks model tumor mikromiljø, blev to indledende validering eksperimenter udført. Først, vi forsøgt at validere vores målinger mod "gold standard" af bulk oscillerende shear rheometry. Vi forberedt identiske prøver af collagenmatrix (uden celler) ved en koncentration på 1,0 mg / ml collagen. Disse prøver blev undersøgt med en bulk rheometer (TA Instruments AR-G2, ved hjælp af 40 mm parallel plade geometri) og ved PTM (ved hjælp af de samme parametre som i hele denne protokol), og de resulterende målinger af G '(ω) og G "(ω ) blev sammenlignet (figur 2A). Fandtes glimrende aftale mellem de to målinger. For det andet at etablere evne denne protokol til at måle punkt ændringer i ECM reologi vi udarbejdet en 1,0 mg / ml collagen matrix og indlejrede tracer perler. Prøven blev derefter behandlet med encentral injektion af 5 pi dispase (figur 2B), som hurtigt fordøjer kollagen. Efter inkubation i 3 timer for at tillade lokaliseret kollagen fordøjelse at forekomme, video blev oplysninger taget i varierende afstande fra injektionsstedet, og målinger af G '(ω) og G "(ω) blev foretaget i hvert enkelt tilfælde. Størrelsen af ​​G "(ω = 1 rad / sek) blev fundet at være større end G '(ω = 1 rad / sek) på injektionsstedet. Målinger ved stigende afstande fra injektionsstedet blev fundet at have en stigende størrelsesorden af G *, samt en stigende del af G 'og G "(Figur 2C). Størrelsen af den meget nedbrudt region ~ 2 mm er i overensstemmelse med en anslået afstand af diffusion af et protein med hydrodynamisk radius R H = 1 nm (molekylvægten af dispase 32,5 kDa) gennem spaltet kollagen med viskositet η = 10 - 3 Pa · s ved 37 ° C: . Derfor er resultaterne enige med forventede opblødning af matricen nær injektionsstedet, og demonstrere vores evne til at foretage præcise, lokaliserede målinger af matrix reologi.

Repræsentative data fra en 3D-tumormodel fremstillet ifølge denne protokol er vist i figur 3.. Videodata blev opsamlet ved 19 faste steder i collagen stillads, der danner et groft gitter omkring tumor (figur 3A). Denne koordinere data blev kombineret med beregnede værdier af G '(ω) for at skabe en fysisk kort over ECM stivhed (figur 3B). Denne rumlige kort viser klart en zone med øget stivhed umiddelbart proksimalt til tumoren sfæroid på dag 2, der kan være korreleret med aflejring af collagen IV, laminin V end andre membrankomponenter kælder deponeret af sfæroidet selv 17,18,44,45 eller lokal kompression af ECM med den ekspanderende klumpformet.

Tumorvækst og matrix invasion hændelser blev overvåget i løbet af 4 dage. To regioner blev identificeret som havende enten ingen tegn af invasive celler i tumoren periferien, eller udtalt bevis for invaderende celler (figur 3C). PTM målinger blev taget på region 1 og 2 over 4 dage. Ved dag 4, var der en signifikant forskel i G '(rapporteret ved 1 rad / sek) mellem de to regioner (figur 3D). Frekvensafhængig målinger af G 'og G "for region 1 og 2 på dag 4 viser en betydelig opblødning af ECM i region 2, den invasive region (figur 3E). På dag 4 region to udviser en væske-lignende viskoelastiske respons, tydeligt ved tyktflydende skalering af G "plot (Figur 3E).

Repræsentant optimaleResultaterne fra de fælles eksperimentelle og analyse af fejl er vist i figur 4.. Måske den mest oplagte fejlkilde ligger i stabiliteten af opsætningen på hvilken video mikroskopi udføres. Hvis laboratoriet bænken forskydes eller hvis der er en anden ekstern kilde til vibrationer, kan perle baner kunstigt påvirket, hvilket resulterer i et skred i data. Drift får MSD at stige drastisk ved høje lag gange (figur 4A), som også forårsager G '(ω) og G "(ω) beregnede værdier at stige kraftigt ved lave frekvenser (figur 4B). Drift kan reduceres ved hjælp af en pneumatisk, luft polstret lab bænken, og ved blot at tage sig til ikke støde opsætningen mens videoer er ved at blive optaget. Derudover kan afdrift fjernes under efterbehandling ved hjælp af software-rutiner. Disse rutiner er egnet til fjernelse af afdrift, som er omtrent ensartet over et kendt tidsinterval. Uregelmæssig drift (måske forårsagetved at støde scenen under datafangst) er mere problematisk. Derfor er det vigtigt at sørge for, at stikprøven forbliver mekanisk isoleret fra det omgivende miljø under dataindsamlingen.

En anden potentiel kilde til uklare resultater kommer fra forkert fortolkning af prøve heterogenitet. Selv evnen til at iagttage og kvantificere rumlig heterogenitet i en prøve er faktisk en af de konstaterede styrker af PTM 26 (og noget, der er tabt i traditionelle bulk-reologi målinger), kan forkert gruppering af klynger af sonde baner føre til forkerte konklusioner. Da ændringer i ECM stivhed rapporteret af denne metode er i sagens natur heterogene, som er selve materialet, i en given synsfelt, kan der være et par tracer sonder, der ikke elastisk begrænset af kollagen fibre og dermed fri til stokastisk udforske større vand fyldt porer (figur 4C). Disse "løse" sonder udstille mobility omtrent overens med et rent tyktflydende miljø. Da data for alle sonder er et gennemsnit, før viskoelastiske moduli beregnes, med et par løse sonder i en given region prøveudtagning (field of view) kan producere frekvensafhængige afbildninger af G * (ω), der varierer vildt (figur 4D).

Forkert software kalibrering kan føre til fejl under video indsamling og analyse. Under video dataindsamling, er det vigtigt at observere intensiteten histogram og juster eksponeringen tid til at give den størst dynamikområde muligt, samtidig med at billedet ikke bliver mættet. Analysen beregner raffineret midterstilling for hver sporstof probe ved at integrere intensiteten for hver pixel. Hvis billedet er mættet, vil integrationen være mindre nøjagtige på grund af en "flad top" sektionen af ​​intensiteten profil. Derudover funktionen konstateringen kalibrering er en yderst kritisk skridt i at sikre nøjagtige resultater. Korrekt valg af udvælgelsesparametrene er altafgørende. Denne proces er blevet beskrevet i udstrakt grad af Crocker og Grier 42 Savin og Doyle 43, og andre.

Figur 1
Figur 1.. Skematisk af Forsøgsmetoden. (A) Tumor spheroids dannes på agarose senge, og derefter overført til en 3D-matrix, der indeholder indlejrede tracer sonder. (B) Videodata taget på flere punkter i prøven godt, både støder op til og langt væk fra tumoren sfæroide. (C) Den stokastiske bevægelse af prober i hver video analyseres for at bestemme de lokale rheologiske egenskaber af matrixen ved hvert prøvepunkt. Disse data er samlet i en rumlig kortlægning af ECM stivhed i hele godt.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2.. Verifikation af målinger. (A) Komponenterne i G * (ω) er vist her. De beregnede værdier af G '(ω) og G "(ω) ved hjælp af PTM er meget lig dem, der opnås via en bulk rheometer. (B) 5 pi dispase sattes til midten af en brønd med radius r = 8,5 mm, med 1,0 mg / ml kollagen at måle rumlige ændringer i G * (ω). (C) beregnede værdier af G '(ω) og G "(ω) på stedet for dispase injektion, 1,5 mm fra stedet, og 3 mm fra stedet. Derudover blev en kontrol målinger foretaget i en brønd, der indeholder den samme kollagengel but uden dispase behandling. Nær behandlingsstedet G '(ω) er mindre end G "(ω). Da gelen samples yderligere fra behandlingsstedet værdierne af G '(ω) bliver større end G "(ω), og omfanget af G * (ω) stiger. Målinger blev taget 2,5 timer efter dispase injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Fig. 3. Kvantificering ændringer i ECM rheologi samtidig med påbegyndelsen af lokale matrix invasion. (A) og indeholdende en PANC-1 3D klumpformet probes på flere steder i collagen ECM, der omgiver tumoren. (B) Koordinere data kombineres med calculated G '(ω) for hvert sted til at producere en rumlig ECM stivhed kort. (C) Tumorvækst og invasion adfærd blev overvåget i løbet af 4 dage. To regioner blev identificeret som havende enten ingen interaktion med invaderende celler (område 1, blå stjerne) eller tung vekselvirkning med invaderende celler, der spontant forgrenet ud fra den store primære flercellede klumpformet masse (region 2, rød stjerne). (D) Reologiske målinger blev taget på region 1 og 2 over 4 dage. Ved den fjerde dag, var der en signifikant forskel i G '(rapporteret ved 1 rad / sek) mellem de to regioner. (E) frekvens afhængige målinger af G '(ω) og G "(ω) for region 1 og 2 på dag 4 viser en betydelig opblødning af ECM i region 2, netop korreleret med tilstedeværelsen af invasive populationer. G '(ω) og G "(ω) værdier beregnet ved hjælp af en magt lov fit til MSD-data er vist som fyldte og ubesatte punkt respectively. På dag 4, region to udstillinger er indlysende en væske-lignende viskoelastiske respons som ved tyktflydende skalering af G "(ω) plot og fraværet af den tilpassede linje for G '(ω). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. Data fra sub-optimale resultater på grund af afdrift og fejlagtig fortolkning af ECM heterogenitet. (A) MSD af et sporstof sonde begrænset i et komplekst materiale følger magt lov skalering <Δr 2 (τ)> ~ τ α (0 ≤ α ≤ 1). Derfor bør MSD værdier nærmer et plateau ved lange forsinkelser tidspunkter. Drift i prøven kan kunstigt eliminere denne adfærd, leading til at eskalere MSD-værdier ved lange forsinkelser tidspunkter. (B) Den lange latenstid afdrift i MSD vil medføre værdierne af G '(ω) og G "(ω) for at blive signifikant fejlagtige korte frekvenser. Drift kan elimineres eller reduceres enten ved at sikre, at prøven er mekanisk isoleret under dataindsamlingen eller ved hjælp af software-rutiner til at fjerne afdrift under analysen. (C) Selv i et lille synsfelt, kan to forskellige sorter af probe baner være til stede. I dette eksempel er de fleste af de sonder begrænset i matrixen, men nogle få er "løs" - deres baner er langt færre begrænsninger. (D) Forsøg på at fortolke MSD data fra både begrænset og utvungne sonder på samme tid, uden at en korrekt fortolkning af prøve heterogenitet vil forvirre målinger af viskoelastiske moduli. venligst klick her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol introducerer vi et robust og bredt anvendelig strategi for langsgående sporing lokale ændringer i ECM stivhed i 3D tumormodeller. Vi forestiller, at denne metode vil kunne vedtages med kræft biologer og biophysicists interesseret i mekanosensitive adfærd impliceret i matrix remodellering under tumorvækst og invasion processer. Præcis kvantificering af matrix nedbrydningskinetik vil være særlig værdifuldt for dem, der studerer aktiviteten af ​​matrixmetalloproteaser, lysyloxidase eller andre relevante biokemiske arter i 3D tumor modeller, der er direkte knyttet til matrix remodellering. Ud over ansøgningen til 3D tumormodeller beskrevet her, kunne man yderligere forestille sig gennemførelsen af denne tilgang i forbindelse med andre sygdomme modelsystemer, hvor ændring af matrix reologi over tid spiller vigtige roller 46,47. Nytten af ​​denne metode fortsat styrkes gennem software forbedringer, at yderligere automate processen og giver mulighed for øget gennemløb studier. Dette vil resultere i stigende grad detaljerede snapshots af det fysiske landskab af mange prøver samtidigt til brug i multi-brønds formater.

Her har vi specifikt beskrive gennemførelsen af ​​passiv partikel-sporing microrheology i 3D tumormodeller, som er velegnet til måling af lineær viskoelastiske respons i intervallet ~ snesevis af Pascal typiske for kommercielt tilgængelige ekstracellulære matrix produkter (kollagen, EHS-tumorekstrakter eller kommercielle nanofiber stilladser). Observationen af ​​stokastiske, termisk drevet bevægelse, selv med høj numerisk blænde optik at kvantificere små sonde forskydninger, er i sagens natur begrænset til den lineære ordning for disse relativt bløde ECM-miljøer, men efterforskerne som ønsker at sonden mere stive materialer kan være i stand til at tilpasse denne protokol til brug med aktive manipulationer via optisk 48 eller magnetisk indfangning 49 prober. Since den optiske eller magnetiske pincet sonde et enkelt punkt i en prøve og ikke påvirker integriteten af ​​prøven, kan disse teknikker eventuelt indarbejdes i ovennævnte protokol for at opnå langsgående målinger af mere stive prøver.

Det er vigtigt at bemærke, at andre celle genererede kræfter også kan bidrage til tracer sonde bevægelser på forskellige tidsskalaer. For eksempel under cellemigrering forekommer i løbet af timer og dage i kultur klynger af prober vil blive skubbet og trukket på grund af celle bevægelser, og det er faktisk dette forslag, der er udnyttet i trækkraft mikroskopi 50,51. De termisk drevne sonde bevægelser som analyseres for at opnå microrheology data foregår på rækkefølgen af ​​sekunder, en klart adskilles tidsskala. Selv om det er også sandt, at de langsommere dynamik belastninger forbundet med trækkraft kræfter kan bidrage til lokale ændringer i reologi 36, en styrke på denne imaging-bASED tilgang ligger i evnen til at korrelere visuelle og rheologiske ændringer i prøven. For eksempel i de repræsentative resultater i figur 3, en indlysende matrix invasion og cellemigration tilfælde korreleres med en ændring i G 'på næsten fire størrelsesordener i den tid, denne vandring finder sted.

Protokollen beskrevet her antager, at brugerne har adgang til et mikroskop med en motoriseret scene, der giver reproducerbar positionering af prøven. Labs, der ikke har denne instrumentering kan stadig gøre punktmålinger hjælp mærker eller andre visuelle referencer i prøven eller prøve luftfartsselskab til at tillade gentagne målinger på det samme punkt, selvom det sandsynligvis ville være vanskeligt at opnå den samme reproducerbarhed i positionering, som vist på repræsentative langsgående målinger her. Ved anvendelsen af ​​disse repræsentative resultater ovenfor, positionering på z-aksen blev holdt nogenlunde konstant. Men protokollen could også ændres for at medtage yderligere målinger langs z-aksen for at skabe et 3D rheologisk kort af prøven. Metoden kan også modificeres til at udnytte en scanning laser konfokal eller nogle multiphoton teknikker til 3D sektionering selvom scanningshastigheder ville indføre en begrænsning på de øverste frekvens grænser tilgængelige som måske eller måske ikke være problematisk for en given anvendelse.

I denne metode, er en betydelig tidspres pålagt af nødvendighed af hjemtransport levende celler til inkubatoren. Uden en time-lapse vejrstation kabinet til at kontrollere for temperatur, fugtighed og CO 2 niveauer, skal billede erhvervelse tid minimeres. Selv med det rette udstyr, tager dataindsamling op store mængder af tid og digital hukommelse, som begge er omfattet af praktiske begrænsninger. For eksempel, med mikroskop og kamera, der anvendes i denne undersøgelse, ville det tage omkring 35 timer til at tage de cirka 4.000 videoer er nødvendige for at kortlægge et enkelt godt på en 96-Brønds plade under anvendelse af en 100X objektiv uden mellemrum synsfelter. Disse faktorer pålægge begrænsninger på antallet af datapunkter, der realistisk set kan indsamles. Detaljeringsgraden er derfor underlagt de praktiske begrænsninger af tid til rådighed til dataindsamling, data lagerplads og tilgængeligheden af ​​en miljømæssig boliger.

Evnen til at kvantificere ændringer i ECM reologi kunne integreres yderligere sideløbende imaging-baserede metoder til kvantificering af terapeutisk respons i 3D tumormodeller 17,18,52,53. Den multi-godt 3D-model kultur system, der blev vedtaget i begge metoder tyder på en parallel gennemførelse leverer korrelation mellem cytotoksisk reaktion og ændring af mekaniske miljø. Dette kunne lette udviklingen af ​​yderligere strategier, der eksplicit er rettet mod den mekaniske fænotype eller belyser virkningen af ​​eksisterende lægemidler i denne kapacitet. En sådan indsigt kan være direkte relevante for enpproaches at øge drug delivery gennem tæt kollagen-rige tumor stroma. For eksempel i forbindelse med den repræsentative illustration af denne protokol, der præsenteres her med in vitro pancreas tumor modeller, vurdering af matrixnedbrydning følgende interventioner kunne anvendes i screening stromal udtynding regimer, en stadig vigtigere terapeutisk paradigme for kræft i bugspytkirtlen 54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker deling af Matlab partikel-tracking kode open source fra Maria Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), sammen med den tidligere IDL kode og omfattende dokumentation fra John C. Crocker og Eric R. uger. Dette arbejde blev muliggjort af støtte fra National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 og R00CA155045 (PI: JPC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine type 1 collagen BD Biosciences, San Jose, CA 354231
PANC-1 American Type Cell Culture, Manassas, VA CRL1469 or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres Life Technologies, Carlsbad, CA 906906
Matrigel BD Biosciences, Bedford, MA 354230
Agarose Fisher Bioreagents, Waltham, MA C12H18O9
NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA NC0480985
96-well Imaging plates Corning Inc., Corning, NY 3904
DMEM Hyclone, Waltham, MA SH30243.01 or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software The Mathworks, Natick, MA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer metastasis reviews. 28, 113-127 (2009).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  4. Bershadsky, A. D., Balaban, N. Q., Geiger, B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annual review of cell and developmental biology. 19, 677-695 (2003).
  5. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, 179-183 (2011).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Prog Biophys Mol Biol. 97, 163-179 (2008).
  7. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochem Biophys. 47, 300-320 (2007).
  8. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116, 2377-2388 (2003).
  9. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
  10. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9, 108-122 (2009).
  11. Assoian, R. K., Klein, E. A. Growth control by intracellular tension and extracellular stiffness. Trends Cell Biol. 18, 347-352 (2008).
  12. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4, 359-365 (2007).
  13. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature reviews. Cancer. 5, 675-688 (2005).
  14. Ulrich, T. A., Jain, A., Tanner, K., MacKay, J. L., Kumar, S. Probing cellular mechanobiology in three-dimensional culture with collagen-agarose matrices. Biomaterials. 31, 1875-1884 (2010).
  15. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix encapsulation of cancer cells. J. Vis. Exp. (34), e1692 (2009).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  17. Celli, J. P., Rizvi, I., Evans, C. L., Abu-Yousif, A. O., Hasan, T. Quantitative imaging reveals heterogeneous growth dynamics and treatment-dependent residual tumor distributions in a three-dimensional ovarian cancer model. J Biomed Opt. 15, 051603-051610 (2010).
  18. Rizvi, I., et al. Synergistic Enhancement of Carboplatin Efficacy with Photodynamic Therapy in a Three-Dimensional Model for Micrometastatic Ovarian Cancer. Cancer Res. 70, 9319-9328 (2010).
  19. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089 (2010).
  20. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell Cycle. 8, (2009).
  21. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Mason, T. G., Weitz, D. A. Optical Measurements of Frequency-Dependent Linear Viscoelastic Moduli of Complex Fluids. Physical Review Letters. 74, 1250 (1995).
  24. Mason, T. G., Ganesan, K., van Zanten, J. H., Wirtz, D., Kuo, S. C. Particle Tracking Microrheology of Complex Fluids. Physical Review Letters. 79, 3282-3285 (1997).
  25. Crocker, J. C., et al. Two-Point Microrheology of Inhomogeneous Soft Materials. Physical Review Letters. 85, 888 (2000).
  26. Valentine, M. T., et al. Investigating the microenvironments of inhomogeneous soft materials with multiple particle tracking. Physical Review E. 64, 061506 (2001).
  27. Helfer, E., et al. Microrheology of Biopolymer-Membrane Complexes. Physical Review Letters. 85, 457 (2000).
  28. Levine, A. J., Lubensky, T. C. One- and Two-Particle Microrheology. Physical Review Letters. 85, 1774 (2000).
  29. Jonas, M., Huang, H., Kamm, R. D., So, P. T. Fast fluorescence laser tracking microrheometry, II: quantitative studies of cytoskeletal mechanotransduction. Biophys J. 95, 895-909 (2008).
  30. Celli, J., et al. Viscoelastic properties and dynamics of porcine gastric mucin. Biomacromolecules. 6, 1329-1333 (2005).
  31. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Phys Rev Lett. 102, 188303 (2009).
  32. Bloom, R. J., George, J. P., Celedon, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Mapping local matrix remodeling induced by a migrating tumor cell using three-dimensional multiple-particle tracking. Biophys J. 95, 4077-4088 (2008).
  33. Gordon, V. D., et al. Measuring the mechanical stress induced by an expanding multicellular tumor system: a case study. Exp Cell Res. 289, 58-66 (2003).
  34. Li, Y., Schnekenburger, J., Duits, M. H. Intracellular particle tracking as a tool for tumor cell characterization. J Biomed Opt. 14, 064005 (2009).
  35. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical Mapping of Live Cells by Multiple-Particle-Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 83, 3162-3176 (2002).
  36. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of Mechanical Strains and Stresses around Quiescent Engineered Three-Dimensional Epithelial Tissues. Biophysical Journal. 103, 152-162 (2012).
  37. Yang, Y. L., Motte, S., Kaufman, L. J. Pore size variable type I collagen gels and their interaction with glioma cells. Biomaterials. 31, 5678-5688 (2010).
  38. Ludwig, T., Kirmse, R., Poole, K., Schwarz, U. S. Probing cellular microenvironments and tissue remodeling by atomic force microscopy. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 456, 29-49 (2008).
  39. Sipos, B., et al. A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 442, 444-452 (2003).
  40. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  41. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
  42. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  43. Savin, T., Doyle, P. S. Static and Dynamic Errors in Particle Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 88, 623-638 (2005).
  44. Evans, C. L., et al. Killing hypoxic cell populations in a 3D tumor model with EtNBS-PDT. PLoS ONE. 6, e23434 (2011).
  45. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  46. Celli, J. P., et al. Helicobacter pylori moves through mucus by reducing mucin viscoelasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14321-14326 (2009).
  47. Bansil, R., Celli, J. P., Hardcastle, J. M., Turner, B. S. The Influence of Mucus Microstructure and Rheology in Helicobacter pylori Infection. Frontiers in immunology. 4, 310 (2013).
  48. Furst, E. M. Applications of laser tweezers in complex fluid rheology. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 10, 79-86 (2005).
  49. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic Tweezers: Micromanipulation and Force Measurement at the Molecular Level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
  50. Dembo, M., Wang, Y. -L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76, 2307-2316 (1999).
  51. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: a new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS ONE. 6, e17833 (2011).
  52. Celli, J. P., Petrovic, L., Massdodi, I., Rizvi, I., Hasan, T. Overcoming therapeutic resistance in pancreatic cancer is not a simple mix of PDT and chemotherapy: Evaluation of PDT-chemotherapy combinations in 3D tumor models. Proc SPIE. , 85680R-85680R (2013).
  53. Glidden, M. D., et al. Image-Based Quantification of Benzoporphyrin Derivative Uptake, Localization, and Photobleaching in 3D Tumor Models, for Optimization of PDT Parameters. Theranostics. 2, 827-839 (2012).
  54. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Scientific reports. 4, 3751-3710 (2014).
  55. Celli, J. P. Stromal interactions as regulators of tumor growth and therapeutic response: A potential target for photodynamic therapy. Israel journal of chemistry. 52, 757-766 (2012).
  56. Garber, K. Stromal depletion goes on trial in pancreatic cancer. J Natl Cancer Inst. 102, 448-450 (2010).

Tags

Bioteknik viskoelasticitet mechanobiology ekstracellulær matrix (ECM) matrix remodellering 3D tumormodeller tumor mikromiljø stroma matrixmetalloprotease (MMP) epithelial-mesenchymal overgang (EMT)
Longitudinal Måling af ekstracellulær matrix Stivhed i 3D tumormodeller med Partikel-tracking Microrheology
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi,… More

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi, H., Celli, J. P. Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology. J. Vis. Exp. (88), e51302, doi:10.3791/51302 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter