Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

Published: June 10, 2014 doi: 10.3791/51302
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston
* These authors contributed equally

Summary

Deeltjes volgen microrheology kunnen worden gebruikt om niet-destructieve kwantificeren en veranderingen in extracellulaire matrix mechanische eigenschappen in 3D tumormodellen ruimtelijk in kaart.

Abstract

De mechanische micro is getoond om als cruciale regulator van tumorgroei gedrag en signalering, die zelf is gerenoveerd en aangepast als onderdeel van een reeks van complexe, tweezijdige mechanosensitive interacties. Terwijl de ontwikkeling van biologisch relevante 3D tumormodellen mechanistische studies over het effect van matrix reologie op tumorgroei hebben vergemakkelijkt, het inverse probleem in kaart brengen van veranderingen in de mechanische omgeving veroorzaakt door tumoren blijft uitdagend. Hier beschrijven we de toepassing van deeltjes volgen microrheology (PTM) in combinatie met 3D-modellen van pancreaskanker als onderdeel van een robuuste en levensvatbare oplossing voor longitudinaal meten van fysische veranderingen in de tumor micro-omgeving in situ. De hier beschreven methode integreert een systeem voor het bereiden van in vitro 3D-modellen ingebed in een model extracellulaire matrix (ECM) steiger van type I collageen met fluorescent gelabelde probes gelijkmatig verspreid poling-en tijdsafhankelijke microrheology metingen in de hele specimen. In vitro tumoren worden verzilverd en gemerkt parallel omstandigheden met behulp multiwell beeldverwerkingsplaten. Op basis van gevestigde methoden, worden video's van tracer sonde bewegingen omgezet via de gegeneraliseerde Stokes Einstein Relatie (GSER) om de complexe frequentie-afhankelijke visco-elastische shear modulus, G * (ω) melden. Omdat deze aanpak is op basis van beeldvormingstechnieken, wordt de mechanische karakterisering ook afgebeeld op grote uitgezonden licht ruimtelijke velden zich gelijktijdig kwalitatieve veranderingen in 3D tumorgrootte en fenotype. Representatieve resultaten tonen contrasterende mechanische respons in de subregio's in verband met gelokaliseerde-invasie veroorzaakte matrixafbraak evenals kalibratie van het systeem, zijn validatie data gepresenteerd. Ongewenste uitkomsten van gemeenschappelijke experimentele fouten en oplossen van deze problemen worden ook gepresenteerd. De 96-well 3D cultuur plating formaat in dit protocol geïmplementeerd is conducive om correlatie van microrheology metingen met therapeutische screeningstesten of moleculaire beeldvorming tot nieuwe inzichten in effecten van behandelingen of biochemische stimuli op de mechanische micro-omgeving te krijgen.

Introduction

Uit een groeiende hoeveelheid bewijs in de literatuur dat kankercellen, zoals met niet-maligne zoogdiercellen epitheelcellen, zijn zeer gevoelig voor de mechanische en biofysische eigenschappen van de omringende extracellulaire matrix (ECM) en andere micro componenten 1-9. Elegant mechanistische studies hebben inzichten in de rol van extracellulaire stijfheid als een complex mechanosensitive signalering partner die kwaadaardige groei en de morfogenese 2,3,10,11 regelt. Dit werk is in het bijzonder bevorderd door de ontwikkeling van 3D in vitro tumormodellen die biologisch opnieuw relevant weefselarchitectuur en kunnen worden gekweekt in scaffold materialen met instelbare mechanica en afgebeeld door optische microscopie 12-19. De andere zijde van deze mechanoregulatory dialoog tussen tumor en micro waardoor kankercellen beurt de reologie van hun omgeving te wijzigen, ietwatmoeilijker te bestuderen. Bijvoorbeeld, tijdens invasieprocessen cellen aan de omtrek van een tumor kan ondergaan epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) en verhoging expressie van matrix metalloproteasen (MMP's) die plaatselijke afbraak van ECM 20-22, die van invloed mechanosensitive groei gedrag veroorzaken andere proximale tumorcellen. Via allerlei biochemische processen, kankercellen voortdurend bellen de lokale stijfheid van hun omgeving op en neer om verschillende processen aan te passen op verschillende tijdstippen. De hier beschreven methode is ingegeven door de behoefte aan analytische instrumenten die lokale veranderingen in de stijfheid en de naleving van de ECM tijdens de groei, die kan worden geïntegreerd met 3D tumor modellen en lengterichting gecorreleerd met biochemische en fenotypische veranderingen zonder beëindiging van de cultuur te melden.

Op zoek naar een geschikte techniek te implementeren in deze context, particle-tracking-microrheology (PTM) naar voren als een sterke kandidaat.Deze methode, bereidde aanvankelijk door Mason en Weitz 23,24, gebruikt de beweging van tracer probes ingebed in een complex fluïdum de frequentieafhankelijke complexe viscoelastische afschuifmodulus G * (ω) melden bij micron lengteschalen. Deze algemene benadering is ontwikkeld met meerdere variaties geschikt voor verschillende toepassingen in zachte gecondenseerde materie, colloïden, biofysica en polymeerfysica 25-31. PTM heeft bepaalde voordelen boven andere werkwijzen, aangezien uitlezingen lokale visco-elasticiteit worden door niet-destructieve beeldvorming van video biochemisch actieve tracer probes die zijn opgenomen bij de bereiding en de plaats blijft gedurende langere perioden van groei. Dit in tegenstelling tot de gouden standaard metingen met een oscillerende shear bulk reometer, die noodzakelijkerwijs beëindiging van de kweek en rapporteert de grootste macroscopische reologie van het monster plaats puntmetingen in het complex 3D tumor microenvirlieu. Inderdaad een aantal studies hebben illustreerde het nut van uitlegging metingen van bewegingen verklikstof peilstift in of rond kanker of niet-kankercellen te vervormingen geassocieerd met celmigratie 32, mechanische stress veroorzaakt door een expanderende sferoïde 33, intracellulaire reologie 34,35 meten, en om mechanische belastingen in gemanipuleerde weefsels 36, en de relatie tussen poriegrootte en invasie snelheid: 37 kaart. Andere technieken voor microrheology zoals atomaire kracht microscopie (AFM) kan worden uitgevoerd, maar hoofdzakelijk voor tasten op het monsteroppervlak en kunnen ook cultuur steriliteit dat longitudinale metingen compliceren 38 vormen.

We beschrijven hier een uitgebreid protocol omvat methoden voor de groei van 3D bolvormige tumoren geschikt voor overdracht in ECM met ingebouwde fluorescerende probes voor video particle-tracking en analysemethoden voor het betrouwbaar in kaart brengen van ruimtelijkeveranderingen in microrheology loop van de tijd in cultuur. In de onderhavige uitvoering worden 3D tumormodellen gekweekt in meerdere putjes formaat met een uitzicht op integratie van microrheology metingen met andere traditionele testen (bijvoorbeeld cytotoxiciteit) die dit formaat is bevorderlijk. In deze representatieve illustratie van deze methodologie we cultuur in vitro 3D sferoïden met PANC-1 cellen, een gevestigde pancreaskanker cellijn bekend sferoïden 39, maar alle metingen hierin beschreven vormen zijn breed toepasbaar te bestuderen van vaste tumoren met verschillende cellijnen geschikt voor 3D-cultuur. Omdat deze methode wordt inherent beeldvorming-gebaseerde het wordt bij uitstek geschikt voor co-registratie van microrheology data met grote doorvallend-lichtvelden van mening dat veranderingen in de groei cel, migratie en fenotype rapporteren hoge-resolutie. De implementatie van PTM geïntegreerd met doorvallend licht microscopie op deze manier veronderstelt reproduceerbare positionering van de microscoop podium which is typisch beschikbaar op gemotoriseerde commerciële Widefield epifluorescentie biologische microscopen. Het onderstaande protocol ontwikkeld kan worden uitgevoerd met elk redelijk uitgerust geautomatiseerde fluorescentie biologische microscoop. Dit is een inherent data-intensieve methode, die verwerving van gigabyte digitale video-microscopie gegevens voor offline verwerking vereist.

In het volgende protocol Protocol 1 betrekking op de initiële bereiding van bolvormige tumoren die hier beschreven middels agarose overlay maar kan worden gesubstitueerd met een verscheidenheid aan andere methoden, zoals opknoping druppel 40 of roterende cultuur 41 technieken. Protocol 2 beschrijft het proces om sferoïden in een collageen steiger hoewel alternatief kunnen in vitro 3D tumoren worden geteeld door het inkapselen en insluiten van cellen geresuspendeerd in ECM 12,15, in plaats van enkele voorgevormde niet-hechtende sferoïden. Bijbehorende protocollen beschrijven procedures voor obtaining tijdsopgeloste microrheology metingen door het verwerven en verwerken van video microscopie data, respectievelijk. Gegevensverwerking beschreven MATLAB, maken gebruik van open source routines voor PTM gebaseerd op algoritmen oorspronkelijk beschreven door Crocker en Grier 42, die ook uitgebreid ontwikkeld voor verschillende software platforms (zie http://www.physics.emory.edu/ ~ weken / IDL /).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kweken bolvormige tumoren

  1. Meng 10 ml van celkweek kwaliteit water met 0,1 g agarose tot een 1% agarose oplossing te verkrijgen.
  2. Warmte agarose oplossing boven 70 ° C (ongeveer 14 seconden in een standaard magnetron of met een verwarmingsplaat) voor aliquoting 40 ul van agarose oplossing in een goed op een 96-wells plaat.
  3. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur tijdens het oogsten van cellen onder toepassing van standaardtechnieken.
  4. Gebruik een hemacytometer om de concentratie van cellen te bepalen in de suspensie.
  5. Verdunde celsuspensie tot 1000 cellen / ml en voeg 100 ul van deze verdunning naar de put met de uitgeharde agarose bed.
  6. Plaats het monster op een schudder overnacht in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2.
  7. Verwijder monster uit shaker en voeg 100 ul van media voor celkweek.
  8. Incubeer sferoïden totdat gewenste diameter is bereikt. Bijvoorbeeld, na 9 dagen, spheroid zal ongeveer 450 micrometer in doorsnede zijn. Gedurende deze tijd kan verse groeimedia worden toegevoegd aan de putjes maar aspiratie moet worden vermeden omdat dit zal resulteren in verwijdering van de sferoïde.

2. Voorbereiden 3D bolvormige tumoren Ingebed in ECM

  1. Bereid een werkplek met benodigde materialen in een laminaire stroming kap.
  2. Bereid een verdund mengsel van carboxylaat gemodificeerde 1 micrometer diameter fluorescerende tracer sondes door toevoeging van 2 delen voorraad sondes (2% vaste stof) tot 25 delen steriel water.
  3. Verwijderen van een fles van 3,1 mg / ml collageen uit de koelkast en plaats deze op het ijs.
  4. Aliquot 125 ul van collageen in een lege 2 ml flacon.
  5. Voeg 50 ul van verdunde tracer probe-oplossing aan de flacon met het collageen en vortex kort probes verspreiden.
  6. Voeg 235 ul van geschikte celkweek medium dat fenolrood (die geel zal blijken) voor een totaal volume van 410 ml en vortex kort voordat u 205 ml (helft van het totale volume) en het in een nieuwe 2 ml flacon. Vial 1 zal de tumor spheroïde bevatten en Vial 2 zal een controle mengsel zijn.
  7. Voeg ~ 2 ui 1 M NaOH tot injectieflacon 1 om de oplossing terug naar neutrale pH (kweekmedium dat fenol rood moeten terugkeren naar rood) te brengen. Merk op dat dit zal leiden tot het mengsel begint genezen als het niet op ijs gehouden. Vortex kort te mengen, dan onmiddellijk terug naar ijs rack.
    OPMERKING: De sferoïde is nauwelijks zichtbaar met het blote oog na 9 dagen kweken en nadat het uit de agarose bed is een moeilijke taak. Gebruik van een dissectie microscoop kan nuttig zijn voor sommige gebruikers. Behoud van de integriteit van de bolvormige tijdens de overdracht van het grootste belang.
  8. Met behulp van een brede mond pipet tip, verwijder voorzichtig 40 ul van media uit het putje met de tumor spheroïde. Bewaar deze 40 ui tijdens het uitvoeren van de volgende stap.
  9. Controleer het goed om te zien of de bolvormigewerd in de vorige stap. Als het was, voeg de 40 pl met de bolvormige om injectieflacon 1. Indien niet, dan plaatst de 40 pi terug in de put en herhaal de vorige stap.
  10. Roer Vial 1 (geen risico vortexen, kan het bolvormige beschadigen) alvorens het mengsel in 60 ui porties in drie putjes van een 96-wells plaat. Inspecteer elk putje met een microscoop na het toevoegen van het mengsel te bepalen die goed bevat sferoïde.
  11. Voeg ~ 2 ul 1 M NaOH en 40 pi celkweekmedium te Vial 2 en vortex voor aliquotting 60 ul van dit mengsel een lege put in de plaat met 96 putjes en etikettering als controle.
  12. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator uitharden ten minste 1 uur.

3. Construct Grid van Bemonsteringspunten en Neem een ​​video op elk punt

  1. Breng het monster plaat uit de incubator aan de microscoop podium. Laat 10 min voor het monster te equilibrate de kamertemperatuur wanneer een verwarmde stadium niet beschikbaar.
  2. Let op de monster met laag vermogen objectief lenzen om zeker te zijn is intact en klaar voor de beeldvorming. Bepaal de tumor positie binnen de put.
  3. Beslissen hoeveel meetpunten te nemen. Meestal zal de 20 meetpunten in elk putje, verdeeld in concentrische ringen rond de bolvormige voldoende gedetailleerde resultaten te produceren.
  4. Verplaats de fase op elke gewenste positie gebruiken microscoop interface software om de x en y coördinaten (of opnemen coördinaten handmatig als interface software niet beschikbaar) opnemen.
  5. Schakel de microscoop om een ​​hoog aangedreven objectief (meestal 100X), en selecteer de juiste filter kubus voor de golflengte van de tracer sondes. Gebruik de lijst van punten gemaakt in stap 3.4 om naar het eerste punt in het net.
  6. Pas de focus naar de bodem van de put te vinden, dan omhoog naar een gezichtsveld (FOV) met meerdere in-focus trac vindener probes.
  7. Let op de intensiteit histogram en de belichting in intensiteit en tijd om de grootste dynamisch bereik mogelijk met dien verstande dat het beeld niet verzadigd raken.
  8. Het verkrijgen van een video sequentie bij een framerate van 20-30 msec per frame (ongeveer 800 frames of 16-24 sec in lengte wordt aanbevolen om voldoende statistische gegevens voor robuuste MSD berekening evenwicht met de noodzaak voor het minimaliseren van acquisitie tijd op elke ruimtelijke roosterpunt bieden) en slaan met een passende overeenkomst. Tijdens de opname, hoeft de microscoop of tafel niet aan.
  9. Herhaal stap 3,6-3,9 voor elk monsterpunt in het raster.
  10. Herhaal stap 3,3-3,10 voor elke wel in het experiment.

4. Analyseer videogegevens Bereken reologische eigenschappen van elk monster Point

  1. Kopieer alle videogegevens een analyse-map (eventueel op een andere computer).
  2. Beeldgegevens importeren in MATLAB of andere analyse software.
    NOTE: Uitgebreide documentatie met betrekking tot de set van MATLAB hier aangenomen deeltje volgen routines is beschikbaar op http://people.umass.edu/kilfoil . Het gebruik van een aangepaste aanroepende functie voor het automatisch verwerken van meerdere bestanden op verschillende posities wordt aanbevolen.
  3. Kalibreer de software door het analyseren van verschillende frames van de video om adequaat te bepalen selectie en afwijzing parameters (grootte, bandpass, etc.) voor het identificeren sonde center posities. Uitgebreide achtergrond voor deze cruciale stappen wordt beschreven door Crocker en Grier.
  4. Gebruik de software om elke probe positie voor alle videobeelden automatisch te bepalen en vervolgens deze posities ook in trajecten.
  5. Gebruik de baangegevens de gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) berekenen als functie van de vertraging, waarbij u de geschikte ruimtelijke kalibratiefactor (micrometer per pixel) Voor het specifiek objectieflens elke pixel binning, enz. (gewoonlijk uitgevoerdmeta-data).
  6. Bereken G * (met behulp van de gegeneraliseerde Stokes-Einstein relatie rekening gehouden met de grenzen van de toepasbaarheid van GSER voor een bepaald monster 24,28,43. Alternatief gebruikers willen ECM eigenschappen rechtstreeks van MSD interpreteren door eenvoudig de macht wet schaalvergroting, plateau waarden, indexen van heterogeniteit of andere parameters.
  7. Herhaal stap 4.2 tot 4.6 voor elke FOV in het experiment.
  8. Positiegegevens co-register uit stap 3.4 met visco-elastische modulii op een bepaalde frequentie van belang. Afhankelijk van de fabrikant van de gebruikte microscoop, kan deze stap worden vergemakkelijkt door een aangepaste routine die microscoop metagegevens of positiegegevens handmatig worden getabelleerd leest.
  9. Gebruik 3D-interpolatie functies om een ​​ruimtelijke reologie kaart van de ECM te genereren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de geldigheid van G * (ω) metingen bij gelokaliseerde posities binnen een complex model tumormicromilieu controleren werden twee eerste validatie-experimenten uitgevoerd. Ten eerste, we wilden onze metingen te valideren tegen de "gouden standaard" van bulk oscillerende shear reometrie. We bereidden identieke monsters van collageen matrix (zonder cellen) in een concentratie van 1,0 mg / ml collageen. Deze monsters werden onderzocht met een bulk reometer (TA Instruments AR-G2, met 40 mm parallelle plaatgeometrie) en PTM (met dezelfde parameters als in dit protocol) en de resulterende metingen van G (ω) en G "(ω ) werden vergeleken (Figuur 2A). Uitstekende overeenkomst werd gevonden tussen de twee metingen. Ten tweede, om het vermogen van dit protocol punt veranderingen in de ECM reologie we een 1,0 mg / ml collageen matrix en ingebedde tracer kralen bereid meten vestigen. Het monster werd vervolgens behandeld met eencentrale injectie van 5 ui Dispase (figuur 2B), die snel verteert collageen. Na incubatie gedurende 3 uur om gelokaliseerde collageen spijsvertering plaatsvindt, werd videogegevens genomen op verschillende afstanden van de injectieplaats, en metingen van G (ω) en G "(ω) werden telkens. De grootte van G "(ω = 1 rad / sec) bleek groter dan dat van G" zijn (ω = 1 rad / sec) op de injectieplaats. Metingen bij toenemende afstand van de injectieplaats bleken een toenemende omvang van G *, alsmede een toenemende verhouding van G "G" (Figuur 2C) hebben. De grootte van de sterk aangetaste regio ~ 2 mm is met een geschatte afstand van diffusie van een eiwit met hydrodynamische straal R H = 1 nm (het molecuulgewicht van Dispase is 32,5 kDa) door collageen gedigereerd met viscositeit van η = 10 - 3 Pa · s bij 37 ° C: . Daarom zijn de resultaten overeenkomen met de verwachte verweking van de matrix bij de injectieplaats en tonen onze vermogen om nauwkeurige, gelokaliseerde metingen van matrix reologie maken.

Representatieve gegevens van een 3D tumormodel bereid volgens dit protocol wordt getoond in figuur 3. Video gegevens werden verzameld op 19 vaste locaties in het collageen steiger, vormen een ruwe raster rond de tumor (Figuur 3A). Deze coördinaatgegevens werd met berekende waarden voor G '(ω) een ruimtelijk plan van ECM stijfheid (figuur 3B) te creëren. Deze ruimtelijke kaart toont duidelijk een zone van verhoogde stijfheid onmiddellijk proximaal van de tumor bolvormige op dag 2, die kunnen worden gecorreleerd met de afzetting van collageen IV, laminine V eend andere basale membraan componenten afgezet door de bolvormige zelf 17,18,44,45, of lokale compressie van de ECM door de expanderende spheroïde.

Tumorgroei en matrix invasie evenementen werden gevolgd gedurende 4 dagen. Twee regio's werden geïdentificeerd als die ofwel geen bewijs van invasieve cellen in de tumor periferie, of uitgesproken bewijs van binnenvallende cellen (Figuur 3C). PTM metingen werden genomen op de gebieden 1 en 2 over 4 dagen. Op dag 4, was er een significant verschil in G '(gerapporteerd bij 1 rad / sec) tussen de twee regio's (Figuur 3D). Frequentie-afhankelijke metingen van G 'en G "voor de regio's 1 en 2 op dag 4 tonen aanzienlijke verzachting van de ECM in regio 2, het invasieve gebied (figuur 3E). Op dag 4 regio twee producties een vloeistof-achtige visco-elastische respons, duidelijk door viskeuze schaling van de G "plot (figuur 3E).

Vertegenwoordiger suboptimaleResultaten van algemene experimentele fouten en analyse worden getoond in Figuur 4. Het meest duidelijke foutenbron ligt in de stabiliteit van de installatie waarop video microscopie wordt uitgevoerd. Als de laboratoriumtafel wordt verplaatst of als er een andere externe bron van trillingen, kan parel trajecten kunstmatig worden beïnvloed, hetgeen een afwijking in de data. Drift zorgt ervoor dat de MSD om drastisch te verhogen bij hoge vertraging tijden (Figuur 4A), die ook zorgt ervoor dat de G '(ω) en G "(ω) berekende waarden sterk toenemen bij lage frequenties (Figuur 4B). Drift kan worden verminderd door het gebruik van een pneumatische luchtgeveerd lab bank, en door simpelweg de zorg om de installatie niet tegen het lijf terwijl video's worden opgenomen. Daarnaast kan drift tijdens de nabewerking met software routines worden verwijderd. Deze routines zijn geschikt voor het verwijderen drift die ongeveer gelijkmatig over een bekende tijdsinterval. Onregelmatige drift (misschien veroorzaaktdoor tegen het podium tijdens data-acquisitie) is problematischer. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het monster mechanisch geïsoleerd van de omgeving tijdens het verzamelen van gegevens blijft.

Een andere potentiële bron van onduidelijke resultaten komt van onjuiste interpretatie van het monster heterogeniteit. Hoewel het vermogen om te observeren en te kwantificeren ruimtelijke heterogeniteit in een monster is inderdaad een van de gewezen sterke punten van PTM 26 (en iets dat verloren is gegaan in de traditionele bulk reologiemetingen), kan onjuiste groepering van clusters van sonde trajecten leiden tot verkeerde conclusies. Gezien het feit dat veranderingen in de ECM stijfheid gerapporteerd door deze methodiek zijn inherent heterogeen, zoals het materiaal zelf, in een bepaald gebied van mening, kunnen er een paar tracer probes die niet elastisch zijn beperkt door collageen vezels en dus vrij stochastisch verkennen grotere water gevulde poriën (Figuur 4C). Deze "losse" sondes tentoonstelling mMobiliteit ongeveer overeen met een zuiver viskeuze omgeving. Aangezien gegevens voor alle sondes wordt gemiddeld voor visco-elastische moduli worden berekend, met een paar losse sondes in een bepaalde steekproef regio (gezichtsveld) kunnen afhankelijk van de frequentie plots van G * (ω) die wild variëren (Figuur 4D) te produceren.

Onjuiste software kalibratie kan tot fouten leiden tijdens video-verzameling en analyse. Tijdens video verzamelen van gegevens, is het belangrijk om de intensiteit histogram observeren en pas de belichting aan tijd om de grootste dynamisch bereik mogelijk met dien verstande dat het beeld niet verzadigd raken. De analyse berekent verfijnde centrum posities voor elke tracer probe door integratie van de intensiteit van elke pixel. Als het beeld verzadigd, zal deze integratie minder nauwkeurig zijn door een sectie vlakke top 'van het intensiteitsprofiel. Daarnaast is de functie vaststelling kalibratie een kritieke stap om nauwkeurige resultaten. Juiste keuze van de selectie parameters staat voorop. Deze werkwijze is uitvoerig beschreven door Crocker en Grier 42, Savin en Doyle 43 en anderen.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van Experimentele procedure. (A) bolvormige tumoren worden gevormd op agarose bedden, en vervolgens overgebracht naar een 3D-matrix met ingebouwde tracer probes. (B) Video gegevens gebruikt op verschillende punten in de monsteropening, zowel tegen en ver van de tumor sferoïde. (C) De stochastische beweging van de probes in elke video wordt geanalyseerd om de lokale reologische eigenschappen van de matrix te bepalen bij elk bemonsteringspunt. Deze gegevens worden verzameld in een ruimtelijke afbeelding van ECM stijfheid in de compleet.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Verificatie van de metingen. (A) De componenten van G * (ω) worden hier getoond. De berekende waarden van G "(ω) en G" (ω) met PTM zijn vergelijkbaar met die verkregen via een bulk rheometer. (B) 5 gl Dispase werd toegevoegd aan het centrum van een goed met straal r = 8,5 mm bevattende 1,0 mg / ml collageen spatiële veranderingen in G * (ω) te meten. (C) Berekende waarden voor G '(ω) en G "(ω) op de plaats van de injectie Dispase, 1,5 mm van de plaats, en 3 mm van de plaats. Daarnaast werd een controlemeting in een putje met dezelfde collageengel but zonder dispase behandeling. Nabij de behandelingsplaats G (ω) kleiner is dan G "(ω). Als de gel verder wordt bemonsterd uit de behandelingsplaats de waarden van G "(ω) groter worden dan G" (ω), en de grootte van G * (ω) toeneemt. Metingen werden genomen 2,5 uur na dispase injectie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Kwantificeren veranderingen in ECM reologie gelijktijdig met de aanvang van de lokale matrix invasie. (A) het putje met een PANC-1 3D sferoïde wordt gesondeerd op meerdere locaties in de collageen ECM rondom de tumor. (B) Zorg voor data wordt gecombineerd met calculated G '(ω) voor elke locatie een ruimtelijke ECM stijfheid kaart te produceren. (C) Tumor groei en invasie gedrag werden gevolgd gedurende 4 dagen. Twee regio's werden geïdentificeerd als die ofwel geen interactie met het binnenvallen van cellen (regio 1, blauw sterretje) of zware interactie met het binnenvallen van cellen die spontaan vertakt uit de grote primaire meercellige bolvormige massa (regio 2, rood sterretje). (D) Reologische metingen werden genomen op de gebieden 1 en 2 over 4 dagen. Op de vierde dag was er een significant verschil in G '(gerapporteerd bij 1 rad / sec) tussen de twee regio. (E) Frequentie afhankelijke metingen van G (ω) en G "(ω) voor regio 1 en 2 op dag 4 vertonen aanzienlijke verweking van de ECM op regio 2 juist gecorreleerd met de aanwezigheid van invasieve populaties. G '(ω) en G "(ω) waarden berekend met behulp van een power wet fit MSD gegevens worden getoond als gevuld en ongevuld punt respectively. Op dag 4, regio twee producties een vloeistof-achtige visco-elastische respons zoals blijkt door viskeuze schaling van de G "(ω) plot en de afwezigheid van de lijn voor G '(ω). Klik hier om een grotere versie van te bekijken dit cijfer.

Figuur 4
Figuur 4. Gegevens van suboptimale resultaten als gevolg van drift en onjuiste interpretatie van ECM heterogeniteit. (A) Het MSD van een tracer sonde opgesloten in een complexe materie volgt macht wet scaling <Ar 2 (τ)> ~ τ α (0 ≤ α ≤ 1). Daarom moet MSD waarden een plateau aanpak op lange vertraging tijden. Drift in de steekproef kan kunstmatig elimineren dit gedrag, leading om escalerende MSD waarden op lange vertraging tijden. (B) De lange aanlooptijd drift in de MSD zal de waarden G (ω) en G "(ω) aanzienlijk foutieve Snel frequenties worden. Drift kan worden opgeheven of verminderd, hetzij door ervoor te zorgen dat het monster mechanisch is geïsoleerd tijdens het verzamelen van gegevens of door het gebruik van software routines om drift te verwijderen tijdens de analyse. (C) zelfs in een klein gezichtsveld, twee verschillende soorten probe trajecten aanwezig zijn. In dit voorbeeld meeste probes worden opgesloten in de matrix, maar enkele zijn 'los' - hun traject veel minder constrained. (D) Proberen MSD gegevens van beide gedwongen en ongedwongen probes tegelijkertijd zonder de juiste interpretatie van het monster heterogeniteit zullen metingen van de visco-elastische moduli beschamen interpreteren. Gelieve click hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit protocol introduceren we een robuuste en breed toepasbare strategie voor het longitudinaal volgen van lokale veranderingen in de ECM stijfheid in 3D tumor modellen. Wij voorzien dat deze methodologie door kanker biologen en biofysici geïnteresseerd in mechanosensitive gedrag betrokken bij matrix remodeling tijdens tumorgroei en invasie processen kan worden aangenomen. Precieze kwantificering van matrix afbraakkinetiek kan bijzonder waardevol zijn om die het bestuderen van de activiteit van matrixmetalloproteases, lysyloxidase of andere relevante biochemische soorten in 3D tumor modellen die rechtstreeks verband houden met matrix remodeling. Afgezien van de toepassing om 3D-tumor modellen hier beschreven, kan men verder voorstellen dat de uitvoering van deze aanpak in combinatie met andere ziekte modelsystemen waarin wijziging van matrix reologie in de tijd speelt een belangrijke rol 46,47. De bruikbaarheid van deze methode verder worden verbeterd door software verbeteringen verdere automaate het proces en zorgen voor een snellere doorvoer studies. Dit zal resulteren in meer gedetailleerde momentopnamen van het fysieke landschap van vele monsters, tegelijkertijd, in multi-well formaat.

Hier is specifiek de toepassing van passieve particle tracking microrheology 3D tumormodellen, die goed geschikt is voor het meten van lineaire visco-elastische respons in het traject beschrijven ~ tientallen Pascal typisch commercieel beschikbare producten extracellulaire matrix (collageen, EHS-tumor extracten of commerciële nanofiber steigers). De waarneming van stochastische, thermisch aangedreven beweging, zelfs bij hoge numerieke apertuur optiek kleine sonde verplaatsingen kwantificeren, is inherent beperkt tot de lineaire regime van deze relatief zacht ECM omgevingen, maar onderzoekers willende stijvere materialen probe in staat zijn om dit protocol aanpassen voor gebruik met actieve manipulaties 48 via optische of magnetische vangst 49 probes. Since de optische of magnetische pincet sonde een punt in een monster en hebben geen invloed op de integriteit van het monster, deze technieken zou kunnen worden in het bovenstaande protocol opgenomen om longitudinale metingen van meer rigide monsters te verkrijgen.

Het is belangrijk op te merken dat andere mobiele optredende krachten kan bijdragen tot tracer probe bewegingen op verschillende tijdschalen. Bijvoorbeeld tijdens celmigratie optreden in de loop van uren en dagen kweken clusters van probes wordt geduwd en getrokken door celbewegingen en het is inderdaad deze beweging die wordt gebruikt in trekkracht microscopie 50,51. De thermisch aangedreven bewegingen sonde die zijn geanalyseerd om microrheology verkrijgen van gegevens vindt plaats op de orde van seconden, een duidelijk scheiden tijdschaal. Hoewel het ook waar dat de langzamere dynamiek van spanningen en vervormingen verbonden trekkrachten kunnen bijdragen aan de lokale veranderingen in reologie 36, een kracht van deze weergave-based aanpak ligt in het vermogen om visuele en reologische veranderingen in het monster correleren. Bijvoorbeeld in de representatieve resultaten in Figuur 3, een duidelijke matrix invasie en celmigratie event wordt gecorreleerd met een verandering in G 'van bijna vier ordes van grootte gedurende de tijd deze migratie plaatsvindt.

De hier beschreven protocol veronderstelt dat de gebruiker toegang tot een microscoop met een gemotoriseerde stadium dat reproduceerbare positionering van het monster biedt. Laboratoria die deze instrumenten hebben kunnen nog steeds puntmetingen met stempels of andere visuele aanwijzingen in het monster of monsterdrager herhaalde metingen wordt op hetzelfde punt, hoewel het waarschijnlijk moeilijk zijn om hetzelfde reproduceerbaarheid in de positionering te bereiken zoals in de representatieve longitudinale metingen hier. Voor de toepassing van deze representatieve resultaten hierboven positioneren op de z-as werd nagenoeg constant gehouden. Echter, het protocol could worden gewijzigd om aanvullende metingen langs de z-as bevatten om een ​​3D-kaart van de reologische monster ontstaat. De werkwijze kan ook worden gemodificeerd om een ​​laser scanning confocale of multiphoton technieken 3D snijden hoewel scansnelheden beperking zou opleggen aan de maximumfrequentie toegankelijk die al dan niet problematisch zijn voor een bepaalde toepassing te gebruiken.

In deze werkwijze wordt een aanzienlijke tijdsdruk opgelegd door de noodzaak terugkeer levende cellen aan de incubator. Zonder een time-lapse weerstation behuizing om te controleren voor temperatuur, vochtigheid en CO 2 verdiepingen, moet beeldaanwinst tijd worden geminimaliseerd. Zelfs met de juiste apparatuur, het verzamelen van gegevens neemt veel tijd en digitale geheugen, die beide tegen praktische beperkingen zijn. Bijvoorbeeld met microscoop en camera in deze studie, zou het ongeveer 35 uur duren om de ongeveer 4.000's nodig kunnen aan een enkele kaart op een 96-Well plaat met behulp van een 100x objectief met geen ruimte tussen gezichtsveld. Deze factoren beperken de het aantal gegevenspunten die realistisch kan worden verzameld. Het niveau van detail is dan ook om de praktische beperkingen opgelegd door beschikbaar voor het verzamelen van gegevens, data-opslag ruimte en de beschikbaarheid van een milieu huisvesting tijd onderwerp.

De mogelijkheid om veranderingen in de ECM reologie kwantificeren kan verder worden geïntegreerd met-imaging gebaseerde methoden voor het kwantificeren van de therapeutische respons in 3D tumormodellen 17,18,52,53. De multi-well 3D-model cultuur in beide methoden aangenomen systeem suggereert een parallelle implementatie verstrekken correlatie tussen cytotoxische respons en wijziging van de mechanische omgeving. Dit kan de ontwikkeling van nieuwe strategieën die expliciet gericht zijn op de mechanische fenotype of verhelderen de impact van bestaande therapeutica in deze capaciteit te bevorderen. Dergelijke inzichten kunnen direct relevant voor een wordenpproaches naar drug delivery te verbeteren door dichte collageen-rijke tumorstroma. Bijvoorbeeld, in de context van de representatieve afbeelding van dit protocol hier gepresenteerd in vitro alvleesklier tumormodellen, de evaluatie van matrixafbraak volgende acties kunnen worden gebruikt bij het ​​screenen stromale uitputting regimes, een steeds belangrijker therapeutische paradigma voor pancreaskanker 54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

We dankbaar de open-source delen van MATLAB-deeltje volgen code die door Maria Kilfoil (erkennen http://people.umass.edu/kilfoil/ ), samen met de eerdere IDL code en uitgebreide documentatie die door John C. Crocker en Eric R. Weeks. Dit werk werd mogelijk gemaakt door financiële steun van het National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 en R00CA155045 (PI: JPC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine type 1 collagen BD Biosciences, San Jose, CA 354231
PANC-1 American Type Cell Culture, Manassas, VA CRL1469 or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres Life Technologies, Carlsbad, CA 906906
Matrigel BD Biosciences, Bedford, MA 354230
Agarose Fisher Bioreagents, Waltham, MA C12H18O9
NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA NC0480985
96-well Imaging plates Corning Inc., Corning, NY 3904
DMEM Hyclone, Waltham, MA SH30243.01 or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software The Mathworks, Natick, MA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer metastasis reviews. 28, 113-127 (2009).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  4. Bershadsky, A. D., Balaban, N. Q., Geiger, B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annual review of cell and developmental biology. 19, 677-695 (2003).
  5. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, 179-183 (2011).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Prog Biophys Mol Biol. 97, 163-179 (2008).
  7. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochem Biophys. 47, 300-320 (2007).
  8. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116, 2377-2388 (2003).
  9. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
  10. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9, 108-122 (2009).
  11. Assoian, R. K., Klein, E. A. Growth control by intracellular tension and extracellular stiffness. Trends Cell Biol. 18, 347-352 (2008).
  12. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4, 359-365 (2007).
  13. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature reviews. Cancer. 5, 675-688 (2005).
  14. Ulrich, T. A., Jain, A., Tanner, K., MacKay, J. L., Kumar, S. Probing cellular mechanobiology in three-dimensional culture with collagen-agarose matrices. Biomaterials. 31, 1875-1884 (2010).
  15. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix encapsulation of cancer cells. J. Vis. Exp. (34), e1692 (2009).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  17. Celli, J. P., Rizvi, I., Evans, C. L., Abu-Yousif, A. O., Hasan, T. Quantitative imaging reveals heterogeneous growth dynamics and treatment-dependent residual tumor distributions in a three-dimensional ovarian cancer model. J Biomed Opt. 15, 051603-051610 (2010).
  18. Rizvi, I., et al. Synergistic Enhancement of Carboplatin Efficacy with Photodynamic Therapy in a Three-Dimensional Model for Micrometastatic Ovarian Cancer. Cancer Res. 70, 9319-9328 (2010).
  19. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089 (2010).
  20. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell Cycle. 8, (2009).
  21. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Mason, T. G., Weitz, D. A. Optical Measurements of Frequency-Dependent Linear Viscoelastic Moduli of Complex Fluids. Physical Review Letters. 74, 1250 (1995).
  24. Mason, T. G., Ganesan, K., van Zanten, J. H., Wirtz, D., Kuo, S. C. Particle Tracking Microrheology of Complex Fluids. Physical Review Letters. 79, 3282-3285 (1997).
  25. Crocker, J. C., et al. Two-Point Microrheology of Inhomogeneous Soft Materials. Physical Review Letters. 85, 888 (2000).
  26. Valentine, M. T., et al. Investigating the microenvironments of inhomogeneous soft materials with multiple particle tracking. Physical Review E. 64, 061506 (2001).
  27. Helfer, E., et al. Microrheology of Biopolymer-Membrane Complexes. Physical Review Letters. 85, 457 (2000).
  28. Levine, A. J., Lubensky, T. C. One- and Two-Particle Microrheology. Physical Review Letters. 85, 1774 (2000).
  29. Jonas, M., Huang, H., Kamm, R. D., So, P. T. Fast fluorescence laser tracking microrheometry, II: quantitative studies of cytoskeletal mechanotransduction. Biophys J. 95, 895-909 (2008).
  30. Celli, J., et al. Viscoelastic properties and dynamics of porcine gastric mucin. Biomacromolecules. 6, 1329-1333 (2005).
  31. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Phys Rev Lett. 102, 188303 (2009).
  32. Bloom, R. J., George, J. P., Celedon, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Mapping local matrix remodeling induced by a migrating tumor cell using three-dimensional multiple-particle tracking. Biophys J. 95, 4077-4088 (2008).
  33. Gordon, V. D., et al. Measuring the mechanical stress induced by an expanding multicellular tumor system: a case study. Exp Cell Res. 289, 58-66 (2003).
  34. Li, Y., Schnekenburger, J., Duits, M. H. Intracellular particle tracking as a tool for tumor cell characterization. J Biomed Opt. 14, 064005 (2009).
  35. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical Mapping of Live Cells by Multiple-Particle-Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 83, 3162-3176 (2002).
  36. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of Mechanical Strains and Stresses around Quiescent Engineered Three-Dimensional Epithelial Tissues. Biophysical Journal. 103, 152-162 (2012).
  37. Yang, Y. L., Motte, S., Kaufman, L. J. Pore size variable type I collagen gels and their interaction with glioma cells. Biomaterials. 31, 5678-5688 (2010).
  38. Ludwig, T., Kirmse, R., Poole, K., Schwarz, U. S. Probing cellular microenvironments and tissue remodeling by atomic force microscopy. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 456, 29-49 (2008).
  39. Sipos, B., et al. A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 442, 444-452 (2003).
  40. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  41. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
  42. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  43. Savin, T., Doyle, P. S. Static and Dynamic Errors in Particle Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 88, 623-638 (2005).
  44. Evans, C. L., et al. Killing hypoxic cell populations in a 3D tumor model with EtNBS-PDT. PLoS ONE. 6, e23434 (2011).
  45. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  46. Celli, J. P., et al. Helicobacter pylori moves through mucus by reducing mucin viscoelasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14321-14326 (2009).
  47. Bansil, R., Celli, J. P., Hardcastle, J. M., Turner, B. S. The Influence of Mucus Microstructure and Rheology in Helicobacter pylori Infection. Frontiers in immunology. 4, 310 (2013).
  48. Furst, E. M. Applications of laser tweezers in complex fluid rheology. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 10, 79-86 (2005).
  49. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic Tweezers: Micromanipulation and Force Measurement at the Molecular Level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
  50. Dembo, M., Wang, Y. -L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76, 2307-2316 (1999).
  51. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: a new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS ONE. 6, e17833 (2011).
  52. Celli, J. P., Petrovic, L., Massdodi, I., Rizvi, I., Hasan, T. Overcoming therapeutic resistance in pancreatic cancer is not a simple mix of PDT and chemotherapy: Evaluation of PDT-chemotherapy combinations in 3D tumor models. Proc SPIE. , 85680R-85680R (2013).
  53. Glidden, M. D., et al. Image-Based Quantification of Benzoporphyrin Derivative Uptake, Localization, and Photobleaching in 3D Tumor Models, for Optimization of PDT Parameters. Theranostics. 2, 827-839 (2012).
  54. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Scientific reports. 4, 3751-3710 (2014).
  55. Celli, J. P. Stromal interactions as regulators of tumor growth and therapeutic response: A potential target for photodynamic therapy. Israel journal of chemistry. 52, 757-766 (2012).
  56. Garber, K. Stromal depletion goes on trial in pancreatic cancer. J Natl Cancer Inst. 102, 448-450 (2010).

Tags

Biotechniek visco-elasticiteit mechanobiology extracellulaire matrix (ECM) matrix remodeling 3D tumor modellen tumormicromilieu stroma matrixmetalloprotease (MMP) epitheliale-mesenchymale transitie (EMT)
Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi,… More

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi, H., Celli, J. P. Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology. J. Vis. Exp. (88), e51302, doi:10.3791/51302 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter