Summary
Den primære endepunkt i kliniske studier for nevromuskulære lidelser er generelt forbedret muskelfunksjon. Derfor vurdere effekten av potensielle terapeutiske forbindelser på muskel ytelse pre klinisk i musemodeller er av stor betydning. Vi her beskriver flere funksjonelle tester for å løse dette.
Abstract
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en alvorlig og progressiv muskelsvinn lidelse som ingen kur er tilgjengelig. Likevel har flere potensielle farmasøytiske forbindelser og genterapi tilnærminger kommet inn i kliniske studier. Med bedring i muskelfunksjonen er den viktigste endepunktet i disse studiene, har mye av det vært lagt vekt på å sette opp pålitelig, reproduserbar, og enkel å utføre funksjonstester til pre klinisk vurdere muskelfunksjonen, styrke, kondisjon og koordinasjon i MDX musemodell for DMD. Både invasive og ikke-invasive tester er tilgjengelige. Tester som ikke forverrer sykdommen kan brukes til å bestemme den naturlige historien til sykdommen og effekten av terapeutiske intervensjoner (f.eks. Forbena grep styrke test, to forskjellige hengende tester ved hjelp av enten en tråd eller et rutenett og rotarod kjører). Alternativt kan tvinges tredemølle løpe brukes til å forbedre sykdomsprogresjon og / eller vurderebeskyttende effekten av terapeutiske intervensjoner på sykdom patologi. Vi her beskrive hvordan du utfører disse mest brukte funksjonelle tester i en pålitelig og reproduserbar måte. Ved hjelp av disse protokoller basert på standard operasjonsprosedyrer muliggjør sammenligning av data mellom ulike laboratorier.
Introduction
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er den vanligste nevromuskulær lidelse som påvirker 1:5,000 nyfødte gutter. Denne alvorlige og progressiv muskelsvinn sykdom skyldes mutasjoner i DMD-genet som forstyrrer den åpne leseramme og hindre syntesen av funksjonelt dystrophin protein. Muskelfibre mangler dystrofin er sårbare for å utøve indusert skade. Ved avsugning av musklenes regenerative kapasitet, og på grunn av kronisk betennelse av skadet muskel, blir fibrene erstattet med bindevev og fett, deretter fører til et tap av funksjon. Vanligvis DMD pasienter mister førlighet i underekstremitetene tidlig i det andre tiåret. Senere, også musklene i armene og skulderen hofteholder er berørt, og pasienter ofte utvikle thoracolumbar skoliose skyldes asymmetrisk svekkelse av musklene som støtter ryggmargen. Assistert ventilasjon er vanligvis nødvendig i slutten av tenårene eller tidlig i tjueårene. Svikt føre luftveier og hjertetil døden i den tredje eller fjerde tiår en.
Selv om den utløsende genet har blitt oppdaget over 25 år siden 2, er det ingen kur tilgjengelig for DMD. Men, bedre helse omsorg og bruk av kortikosteroider har økt levealder i den vestlige verden tre. Med bruk av dyremodeller som MDX mus, store skritt fremover i oppdagelsen av potensielle terapeutiske strategier har blitt gjort. MDX mus er den mest brukte DMD mus modell. Den har en punktmutasjon i exon 23 i den murine Dmd genet og følgelig mangler dystrofin 4.. I løpet av de siste par årene, har mange forslag til strategier kommet inn i kliniske studier 5-9. I disse studiene, er forbedring av muskelfunksjonen det primære endepunktet, underliggende betydningen av å teste nytten av forbindelser på muskelfunksjon hos mus under preklinisk stadium av testing.
Som DMDpasienter, også dystrofin negative muskelfibre av MDX mus er sårbare for å utøve indusert skade og deres muskelfunksjon er svekket i forhold til C57BL/10ScSnJ villtype mus. Denne nedskrivning kan vurderes med en rekke funksjonelle tester. Noen av disse testene er ikke-invasiv og ikke forstyrrer muskel patologi (f.eks forbena grep styrke, hengende tester og rotarod kjører). Derfor kan de brukes til å overvåke den naturlige historie av sykdom eller fastslå effekten av forbindelser på sykdomsprogresjon. For å få en grundig bilde av påvirkning av forbindelser på muskelfunksjon i MDX mus, kan en funksjonstest regime som ikke forstyrrer sykdomsprogresjon som består av alle disse testene brukes 10.
Alternativt kan tvinges tredemølle kjører brukes til forsettlig forverre sykdomsutvikling og teste de beskyttende kapasitet av forbindelser 11. Tredemøllen kan også værebrukt som effektmål der kjøretiden til utmattelse er målt 12, eller som et verktøy for å tretthet MDX mus slik at de utfører mindre bra i en etterfølgende funksjonstest sikre større forskjeller i ytelse mellom behandlingsgruppene 13. Når du velger funksjonelle tester, bør deres effekt på sykdomsutvikling holdes i tankene, spesielt når testing dystrophic mus som MDX mus 14.
Vi her beskriver i detalj hvordan du skal utføre de mest brukte funksjonstester i en pålitelig og reproduserbar måte basert på tilgjengelige standard operasjonsprosedyrer fra TREAT-NMD nettverk. Klikk her for å besøke TREAT-NMD .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene er beskrevet her ble godkjent av dyreetikk komité (DEC) av Leiden University Medical Center (LUMC). Mus ble avlet av dyret innretningen av LUMC og holdt i individuelt ventilerte bur med 12 timers lys mørke sykluser. De hadde ad libitum adgang til vann og standard Chow.
Ved utførelse av en hvilken som helst av de funksjonelle tester som er beskrevet nedenfor, eksperimentelle betingelser må være strengt kontrollert for å redusere variasjon. Helst bør alder og kjønn matchet mus brukes, så ytelsen er forskjellig mellom alder og kjønn. Mus som tilhører samme kull bør randomisert i de eksperimentelle gruppene. Dyr bør testes av samme operatør, som er blinde for de eksperimentelle gruppene. Tester skal utføres på samme tid på dagen og ukedag, samme rom for å utjevne lukt, lyder, etc. 14 Stor variasjon mellom individuelle mus og tidspunkter kan observeres for allefunksjonelle tester, derfor 6-8 mus / eksperimentelle gruppen bør brukes. Funksjonell test ytelse kan også i stor grad variere mellom ulike innavlede villtype stammer. Derfor bør eksperimentelle og kontrollere villtype mus alltid har tilsvarende bakgrunn (i tilfelle MDX mus bruker C57BL/10ScSnJ villtype belastning). Alle data som er beskrevet her har blitt oppnådd med C57BL/10ScSnJ vill type belastning, som vi refererer til som villtype fra nå av. Forsøkene som beskrives her kan benyttes i lengderetningen fra minst 1-19 måneders alder i MDX-og villtype-mus. Tester bør ikke gjentas mer enn en gang i uken for å hindre mus fra å miste interesse og vilje til å utføre oppgaven.
En. Forbena Grip Strength Test
Bruk forbena grep styrke test for å måle styrken på forbein. Testen er basert på tendensen som en mus for å instinktivt gripe et rutenett når suspendert i halen 15, og ADAPTEd fra DMD_M2.2.001.pdf .
- Apparat satt opp: Fest et rutenett til en kraft svinger, som måler den maksimale kraften fra musen på nettet i løpet av pull. Kontroller at innstillingen er på Peak spenning modus (T-PK) for å trekke. Enhetene av kraft kan justeres i enten gram-av-kraft, gram-of-kraft, pounds-of-kraft, kg-av-kraft, eller Newtons.
Merk: Vi foretrekker å jobbe med gram som enhet av verdier. Flere meter er kommersielt tilgjengelig, men kun aksiale transdusere gi pålitelige resultater så spak typen force transdusere er negativt påvirket av de fysiske lovene i spaken effekt. Enten en nonflexible gitter eller trekant kan brukes med stolper som er 1-2 mm i diameter. - Før testen, vurderer kroppsvekt av musen, for å tillate normalisering for kroppsvekt.
- Bruk gram som enhet av verdier. Tilbakestill måleren ved starten av hvert recording.
- Fjern musen fra buret sitt ved å ta tak i halen og beveger den horisontalt mot rutenettet.
- Kontroller at musen griper rutenettet tett med begge forpotene.
- Trekk musen bort fra brettet slik at dens forståelse er brutt, den høyeste kraften til nettet vil bli vist på svingeren display, som kan være enten manuelt eller automatisk registrert.
- Bare ta trekker i betraktning hvor mus viser motstand mot eksperimentator. Avvis tiltak hvor bare ett med forpotene, og bakbena ble brukt, og hvor muse slått under trekk.
- La muse trekk risten tre ganger på rad, og deretter returnere det i buret etter en hvileperiode på minst ett minutt. Merk: mellom serie trekker en hvileperiode som er nødvendig for musen til å utvinne og unngå vane formasjonen.
- Så la muse utføre fire serier av forsøk, hver etterfulgt av en kort hvileperiode. På denne måten mouse har trukket totalt 15x (3 drag x 5 ganger = 15 trekk).
- Bestem maksimalt grep styrke og normalisere for kroppsvekt ved å ta gjennomsnittet av de tre høyeste verdiene av de 15 verdiene samles.
- Valgfritt: Bestem tretthet ved å beregne reduksjonen mellom gjennomsnittet av de to første og de to siste serie trekker en 2 +3 = A, 4 5 6 = B, 10 +11 +12 = C og 13 14 + 15 = D. Formelen: (C + D) / (A + B) gir en verdi på 1 til mus som ikke er utslitt. Dette kan uttrykkes i prosent, slik som en mus uten tretthet har en verdi på 0% og en mus som forelimbs er fullstendig utmattet har en verdi på 100%.
2. Hengende tester
Med hengende tester, balanse, koordinasjon og muskel tilstand kan vurderes. Disse testene er basert på kunnskapen om at mus er ivrige etter å bli hengende på en wire eller rutenett til utmattelse 16. Det er to karakteristiske hengende tester i hvilken ved starten av testen entenbare de to forelimbs eller alle fire lemmer blir brukt, ved hjelp av en wire eller rutenett hhv. Den hengende test ved hjelp av wire og rutenettet er den lengste henge tid metode tilpasset fra DMD_M.2.1.004.pdf og DMD_M.2.1.005.pdf hhv. Et fast hengende grense benyttes på 600 sek. Flertallet av villtype mus kan henge for 600 sek, mens dystrophic mus ikke kan. For å redusere tid bruker å utføre denne testen, ble en maksimal hengende gang satt på plass. Mus som faller utenfor wire eller rutenett før da får opptil to prøver. Dette er gjort for å gjenforsikre at mus er egentlig ikke i stand til å henge og ikke faller på grunn av klossethet.
- Hengende test med to lemmer
- Apparat satt opp: Tett sikre en 2 mm tykk metall klut hengeren til en hylle med tape og vedlikeholde hengeren rundt 370; cm over et lag av sengetøy. Merk: alternativt kan et 55 cm bredt 2 mm tykt metallisk ledning som er tett festet mellom to vertikale tribunen anvendes. Den avstand på 37 cm er tilstrekkelig til å stimulere mus til å forbli hengende, men også lav nok til å hindre mus mot skader ved fall ned. Ledningen skal ikke vibrere eller fortrenge under testen, da dette kan påvirke resultatene av musen.
- Håndtere musa via halen og bringe den i nærheten av ledningen.
- La mus griper tråden med forpotene bare de to, og senk bakbena på en slik måte at musen kun henger med de to forpotene på ledningen (figur 2B).
- Direkte starter tidtakeren når musen er utgitt. Etter utgivelsen, sterke mus prøve å fange den ledningen med alle fire lemmer og hale, som er tillatt (figur 2C).
- Når en mus viser utilbørlig atferd (som å balansere på eller bevisst hoppe av ledningen som sheier i Tall 2D og 2E), direkte løse dette ved å erstatte musen på ledningen uten å stoppe timeren.
- Når en mus faller av wire, stoppe tidtakeren og registrere hengende tid.
- Når musene er i stand til å henge for 600 sek, ta dem av wire og returnere dem til buret. Mus som faller før denne grensen er gitt maksimalt to flere prøver.
- Registrer den maksimale hengende tid (dvs. den lengste av de prøvelser) og bruke dette for videre analyse.
- Hengende test med fire lemmer
- Apparat satt opp: Bruk enten en håndlaget firkant eller lokket av et stort bur for en rotte eller kanin for denne testen. Plasser gitteret 25 cm ovenfor myke senger for å hindre mus fra å skade seg selv ved å falle, men også for å hindre mus å bevisst hoppe av rutenettet. Tett sikre brettet slik at eksperimentator ikke trenger å holde rutenettet manuelt under forsøket som disse bevegelsene kanskje jegnterfere med musen ytelse.
- Plasser musen på brettet slik at det griper den med sine fire poter.
- Snu brettet slik at musen henger og direkte starter tidtakeren.
- Testen sesjon ender for mus som er i stand til å henge i en varighet på 600 sek. Gi mus som faller av rutenettet tidligere maksimalt to flere prøver.
- Bruk maksimum hengende tid (dvs.. Den lengste av de forsøk) for videre analyse.
Tre. Rotarod Running
Med rotarod test muskelstyrke, kan koordinasjon, balanse, og tilstanden bestemmes 17.
- Apparat satt opp: For denne testen, mus må kjøre på en roterende tube. Sørg for at den jevne hastigheten er satt til 5 rotasjoner per minutt (rpm), og at hastigheten øker 5-45 rpm i første 15 sek når den startes. Etter dette må det for å opprettholde dens hastighet.
- Plasser musene på røret på rotarodnår den roterer med en jevn langsom hastighet av 5 rpm. Fem mus kan testes samtidig.
- Starte kjøringen når alle mus er plassert. I løpet av de første 15 sek hastigheten av røret akselererer 5-45 rpm hvoretter den opprettholder den hastigheten.
- Følg med på løp. Kjøretiden blir kontinuerlig registrert av programvaren. Spilletid stopper automatisk når en mus faller av røret da dette aktiverer tidslinjen plassert under røret. Reposisjonering mus som snu vendt i motsatt retning på røret under kjøring uten å stoppe røret til å rotere.
- Avslutt testen sesjon for mus som er i stand til å kjøre for en varighet på 500 sek. Gi mus maksimalt to flere forsøk slik at de kan forbedre sin driftstid, når de faller tidligere.
- Bruk maksimal driftstid (dvs. den lengste av forsøkene) for videre analyse.
4. Tredemølle Trening
Dentredemølle kan brukes på tre måter som et verktøy i preklinisk forskning. For det første kan tvinges tredemølle løpe bli brukt til å forsterke sykdoms patologi som beskrevet i denne protokoll (se også: DMD_M2.1.001.pdf ). Dernest kan den maksimale kjøreevne for mus og effekten av behandlinger på dette vurderes (Se for metoden å la mus løpe til utmattelse DMD_M.2.1.003.pdf ). Endelig kan tredemølle løping brukes før en annen funksjonstest for å utmatte musen slik at den utfører mindre bra i den andre testen 13. Dette gjøres ved å utøve mus to ganger eller tre ganger ukentlig, som beskrevet nedenfor, direkte etterfulgt av enten en av de funksjonelle tester som beskrevet i protokoll 1-3.
- Apparat satt opp: Det er flere tredemøller kommersielt tilgjengelige på hvor flere mus kan run samtidig og hvor høyden, varighet og hastighet kan reguleres. Noen tredemøller er utstyrt med et rutenett for å levere lav intensitet sjokk å oppmuntre mus til å kjøre. Men MDX mus er følsomme for stress og kan lett bli motivert på en vennligere måte ved et lett puff med hånden i den løpende retning. Derfor er det sterkt oppfordret til å IKKE bruke sjokk rutenett. Generelt er stimulering med hånden bare nødvendig under den første løpe økt.
- Plasser mus på den horisontale tredemølle.
- Start tredemølle på en løpehastighet på 12 m / min. Lavere hastigheter (8 m / min) har til å bli brukt i gamle mus (> 15 måneder), hvor høyere hastigheter lett føre til utmattelse.
- I løpet av den første time, oppfordrer mus for å drives ved å skyve dem når de er i nærheten av enden av beltet.
- Når musene har løpt en varighet på 30 minutter, legg dem tilbake i buret sitt.
- Gjenta dette to ganger i uken for eksempel 12 uker. Tillat hvileperioder når det trengs. For eksempel har noen MDX mus må slutte å kjøre, og bør få lov til å hvile i et par min. Hvis dette skjer, slår beltet av, gi alle musene en hvileperiode på to minutter, snu beltet på i to minutter ved 4 m / min. Etter dette, øker hastigheten til 12 m / min, og tillate mus til å fullføre den protokoll. Det er viktig at alle mus fullføre hele løpe protokollen.
Merk: I tilfelle MDX mus trenger hvile perioder, bør du vurdere en varm opp før 30 min trening protokollen. Denne varme opp sesjon består av: 2 min akklimatiseringsperiode med en hastighet på 4 m / min, umiddelbart etterfulgt av en 8 minutters oppvarming på 8 m / min.
I våre hender 4-16 uker gamle kvinnelige MDX mus er i stand til å fullføre 30 min trening protokollen uten å hvile. Andre har rapportert at i alders matchet mannlige MDX mus 45% av musene trenger hvileperioder for å fullføre øvelsen. Den varme opp protokoll reduseres mengden stopper 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forbena grep styrke av vill type og MDX mus øker i alderen 4-12 uker og reduserer igjen i eldre mus. Svekkelser i kraft allerede kan observeres hos unge MDX mus. Representative data for 9 uker gamle hunnmus er vist i figurene 1A og 1 B. Selv om tretthet ikke skiller mellom de stammer ennå i denne alderen, MDX mus er svakere enn villtype mus. Vi har ikke data ennå på trettbarhet i eldre MDX og villtype mus.
For å få pålitelige og reproduserbare resultater, flere vurderinger må gjøres av den samme eksperimentator. Vi her beskriver å trekke 15 ganger / individ, men mindre antall drag (så lavt som fem drag) også gi pålitelige data. Nøye oppmerksomhet skal rettes til plassering av potene på rutenettet som dette kan i stor grad påvirke utfallet. Under trekk, bør bare begge forpotene brukes, og de har til be plasseres pent ved siden av hverandre (figur 1C). Når musen ikke viser motstanden mot trekk, bør verdien ikke tas i betraktning.
For de to lem og fire lemmer hengende tester, spesielt unge (4-16 uker gamle) villtype mus kan enkelt nå den maksimale hengende tid på 600 sek. Contrastingly, er ytelsen til unge MDX mus svekket (de nesten aldri oppnå maksimal hengende tid) og også forverres med alderen, selv om begge stammer sette alle krefter i å utføre disse henge tester på sitt beste evner (Tall 2A og 3A). Større forskjeller i hengende tider mellom MDX-og villtype-mus ble oppnådd med tråden. Derfor kan selv små effektstørrelser av forbindelser på muskelfunksjon oppdages ved hjelp av dette forsøket. Hengende ytelse (eller noen annen form for ytelse) er forskjellig innenfor og mellom individene over tid resulterer i høyt standardavvik barer. Nonetheless, mdx mus konsekvent utføre verre enn matchende villtype mus (Figur 2A). Utføre flere vurderinger kan gi mer detaljert innsikt i funksjonelle forbedringer på behandling enn bare endepunkt målinger. Det bør være oppmerksom på at i den første økten dyrene lære å utføre en funksjonstest. Denne lærekurve, som er til stede i alle testene, er klart synlig mellom 4-6 uker gamle. Men fordi mus også vokse raskt i denne aldersperioden, et skille mellom forbedring på grunn av læring og / eller vekst kan ikke gjøres. Kjønnsforskjeller i hengende ytelse for de to lemmer henger test har også blitt funnet. Utførelse av kvinnelige MDX mus er høyere enn for menn ved ~ 100 sek, og ytelsen til tredemølle utfordret kvinnelige MDX mus er nesten sammenlignes med at av de ubestridte hanner (sammenlign figur 2A med 4A). Dette funnet understreker viktigheten av å bruke alder ennd kjønn matchet mus for å unngå skjevhet. Vi har foreløpige data tyder på at forskjeller i ytelse i både hengende tester mellom MDX og villtype muse økninger i svært gammel (18 måneder) muse.
Noen mus viser upassende oppførsel for å unngå å henge på ledningen som; balanserer på wire, hoppe av ledningen bevisst etc. (Tall 2D og 2E), selv om de fleste av mus i samsvar med testen og henge med enten to eller fire lemmer ( Tall 2B og 2C). Av og til, sterke mus hoppe av ledningen med vilje. De henger forut for hopping med bare de to bakben og halen på viren og let ned for å beregne avstanden til bakken. Upassende oppførsel som er tidvis sett på nettet i løpet av fire lem hengende testen består av bevisst hoppe av rutenettet eller klatring på rutenettet. Alle upassende former for atferd kan være easily distingvert og bør ikke være tillatt. Mus som unngår hengende i en av disse måtene bør være direkte plassert tilbake på wire eller rutenett uten å stoppe timeren.
På rotarod, MDX mus nesten aldri kjøre for maksimal driftstid på 500 sek, mens en større andel av villtype mus gjøre (Figur 3B). Med alderen, kjører ytelsen til begge stammer avtar. Noen mus er i stand til å klemme tett på den roterende rør og unngå å kjøre med 'cartwheeling' rundt. Dette kan ikke korrigeres for, og er en alvorlig begrensning av testen når flere mus begynne å gjøre dette i lengre perioder, og dermed øke variasjonen innenfor de eksperimentelle gruppene. Spesielt for noen mus som delvis drives og dels Cartwheel, og ved overgangen fra cartwheeling til å kjøre fall. Noen mus snu på den roterende røret mens du kjører. Dette problemet bør tas opp for ved direkte reposisjonere musene på røret, medut å stoppe det. Også denne type adferd begrenser nytten av denne test.
Tvunget tredemølle kjører er en enkel og effektiv øvelse for å forverre sykdommen patologi i nontreated MDX mus, mens villtype mus som gjennomgår den samme protokollen er ikke berørt. Vanligvis mus bli kjent med tredemølle etter en innledende treningsøkt og er villig til å kjøre, spesielt når flere mus kjører samtidig. Gamle MDX mus (over 15 måneder) har vanskeligheter med å kjøre og kan ikke takle den samme løpehastighet på 12 m / min i 30 min brukt for unge mus. Derfor er en langsommere å kjøre fart på 8 m / min i 30 min anbefalte å la alle mus for å fullføre hele protokollen. MDX mus er spesielt sårbare for eksentriske kontraksjoner, derfor løping i nedoverbakke kan bare brukes for en kort varighet.
Alternativt, andre funksjonelle tester som de to lem hengende ledning test kan utføres direkte etter å ha kjørt (figur 4A). Ved hjelp av denne studiedesign, forskjeller mellom stammer eller behandlingsarmene er sannsynlig å øke som tredemølle utfordret ubehandlede MDX mus er mindre i stand til å utføre disse testene enn stillesittende MDX mus 13.
Som nevnt tidligere, når man studerer muskelfunksjon i MDX mus, må C57BL/10ScSnJ villtypestammen som skal brukes som er av tilsvarende genetisk bakgrunn. Vi anbefaler dette som selv mellom innavlede villtype stammer tredemølle kjører ytelse skiller 18,19. Men også i ikke-invasiv funksjonelle tester, er funksjonelle ytelse påvirket av genetiske bakgrunn. Figur 5 illustrerer dette i tre representative grafer der ytelse av MDX mus på en BL/10 bakgrunn og på en blandet bakgrunn bestående av BL/10, BL/6J, DBA2 og 129OLA er sammenlignet. Slik man kan forstå den blandede bakgrunns musprestere bedre i de hengende ledning tester og verre på rotarod.
Figur 1. Forbena grep styrke, representative resultater og riktig plassering av potene. A. forbena grep styrke normalisert for kroppsvekt på ni uker gammel kvinnelig MDX (n = 5) og villtype (n = 4) mus. Grip styrke er allerede svekket i unge MDX mus. Stjernene indikerer p <0,05, og data er presentert som gjennomsnitt ± st.dev. B. Fatigue av de samme individer som vist i A, var i gjennomsnitt mindre enn 10% og ikke varierer mellom stammene. C. For å oppnå pålitelige data, oppmerksomhet bør tas hensyn til plassering av potene under forbena grep styrke analyse. Riktig plassering av musen, to forpotene er ved siden av hverandre, bakbena are ikke berøre nettet og musen er å trekke i en rett linje D. Feil plassering av forpotene;. musa er ikke trekke i en rett linje. Når dette skjer, eller når bare én forpotens eller også bakbena blir brukt, slår musen rundt under trekking eller mangler for å vise motstand, data skal kastes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. To lem hengende tester, representative resultater og passende og upassende hengende oppførsel. A. Et representativt eksempel på de to lemmer hengende test utført en gang i uken i hann MDX (n = 18, 4 til 10 uker, n = 13, 11 og 12 uker, n = 10 og 13 uker) og alder og kjønn matchet villtype mus (n = 6). En læringskurve er synlig for begge stammer i de første ukene av testing. Utførelse av MDX mus var verre sammenlignet med villtype mus. Data presentert som gjennomsnitt ± st.dev. Maksimal hengende Fristen er vist med den stiplede linjen. B. Den korrekte startposisjonen til denne testen er med de to forpotene. C. Avhengig av den funksjonelle evne til mus og man kan bruke bakbena og hale. D og E. En liten undergruppe av mus, spesielt sterke villtype mus, kan av og til å unngå å henge ved å klatre på sidestengene eller balansere på wiren. Noen mus med vilje hoppe av wire. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Fire lem hengende og rotarod kjører test. A. Fire lem hengende ytelse vurdert en gang ukentlig i mannlig MDX (n = 18, 4-10 uker, n = 13, 11 og 12 uker, n = 8, 13 uker) og villtype ( n = 6) mus. Over tid, MDX mus henge mindre lang enn villtype mus. B. Rotarod kjøretider ikke var forskjellig mellom unge mannlige MDX (n = 18, 4-10 uker, n = 13, 11 og 12 uker, n = 10, 13 uker ) og villtype-mus (n = 6). Data er representert som gjennomsnitt ± st.dev.
Figur 4. Effekten av tvang tredemølle kjører trening protokollen på funksjonell ytelse og skjelettmuskel patologi i hunnmus. Muskel patologi var bevisstforsterkes ved å la mus kjøres på en horisontal tredemølle tre ganger i uken ved 12 m / min i 30 min for en varighet på 12 uker. Direkte etter løping, mus hadde til å delta i de to lem hengende test. Mens alle villtype-mus (n = 5) forblir hengende til den maksimalt tillatte, alle MDX-mus (n = 6) faller av tråd tidligere (p <0,001, data presentert som gjennomsnitt ± st.dev.). B. Tilstedeværelsen membranskade ble bestemt ved å vurdere plasma kreatin kinase (CK) nivåer som lekker ut av muskelfibre gjennom tårer i membranen. CK ble forhøyet i MDX mus sammenlignet med villtype mus før trening. Tredemølle trening umiddelbart økte verdier (p <0,01 indikert med stjerne, data presentert som gjennomsnitt ± st.dev.) I MDX mus, mens de holdt seg lav i villtype mus. CD. Musklene MDX mus er svært sårbare for tredemølle trening, forverring sykdom patologi omfattende enfter noen uker med å kjøre. Disse haematoxylin og eosin stainings av quadriceps av en 16 ukers gammel nonexercised (C) og tredemølle utøvd (D) MDX mus viser at omfattende fibrose og nekrose utvikles. E. Muskler av vill type mus som gjennomgår den samme løpe protokollen er ikke berørt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Effekt av en blandet bakgrunn på funksjonell ytelse i MDX muse. Forskjeller i genetisk bakgrunn påvirker funksjonelle ytelse. For å illustrere dette, utførelse av hann MDX (BL/10 bakgrunn, n = 18, 4 til 10 uker, n = 13, 11 og 12 tissks, n = 10, 13 uker) og MDX (blandet BL/10, BL/6J, DBA2 og 129OLA bakgrunn, n = 5) mus ble sammenlignet over tid. A. To lem hengende teste ytelsen betydelig forskjellig mellom de to stammene. B. Fire lem hengende testresultater var noe høyere i de blandede bakgrunn MDX mus. C. Rotarod kjører ganger også litt forskjellig mellom stammer. Data presentert som gjennomsnitt ± st.dev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De funksjonelle tester som presenteres her er reproduserbare, lett å utføre og som gjelder for villtype og dystrofe mus uavhengig av deres alder. Testene gir nyttige verktøy til pre klinisk vurdere muskelfunksjonen, styrke, kondisjon og koordinasjon. Når du skal teste effekten av et sammensatt på den naturlige historien til sykdommen, de ikke-invasive tester beskrevet her (forbena grep styrke, både hengende testene og rotarod test) kan være pent kombinert i en funksjonstest regime hvor disse testene blir utført på etterfølgende dager . Disse protokollene er ikke skadelig for MDX mus, og kan brukes i en langsgående måte 10. Det bør være oppmerksom på at utfall av hver av disse testene er generert av ulike eller delvis overlappende muskelgrupper i stedet for en individuell muskel. Derfor er bruk av en kombinasjon av flere tester som anbefales for å oppnå en mer fullstendig bilde og derved bedre innsikt i funksjonaliteten av erfamentale grupper. Alternativt kan funksjonelle forbedringer av en eneste muskel bli vurdert ved hjelp av muskelfysiologi målinger 20.
Som atferdstester, også funksjonelle tester kan vise omfattende variasjon mellom forskjellige mus, eller innen en mus mellom ulike vurderinger. For å redusere variasjonen, bør alle testene utføres av den samme eksperimentator som er kjent med musene. Eksterne variabler som lukter og lyder i rommet, bør tid på dagen og ukedag som testen er utført holdes så konstant som mulig. Mus bør være kjønn og alder matchet. Når du bruker tredemølle kjører for å forverre sykdomsutvikling, er det viktig å bruke en standardisert protokoll hvor alle kjører parametere (kjører tid, hastighet og helling) holdes konstant over tid for alle eksperimentelle grupper, slik at alle mus behandles likt. Selv om flertallet av mus er opptatt av å delta i de funksjonelle tester og de fleste dyr viser høynivåer av vilje, noen mus (primært sterk villtype mus) tidvis unngå å utføre testen og viser unngåelsesatferd. Når dette ikke er korrigert for, kan falske konklusjoner trekkes 21. Heldigvis er disse typer atferd kun observert sporadisk og kan korrigeres for ved å plassere muse tilbake på ledningen, rutenett eller rotarod, eller trekke en annen tid på grep styrke meter.
Forbedringer i en funksjonstest (f.eks hengende test vurdere muskelfunksjon) trenger ikke nødvendigvis å co skje med forbedringer i en annen test (forbena grep styrke vurdere eneste muskelstyrke). I MDX mus, kan forbedringer i muskelfunksjonen skilles tidligere enn i muskelstyrke. Dette er også sett i DMD pasienter som deltar i kliniske studier hvor klinisk relevante forbedringer i 6 min gangtest ikke cooccur med forbedringer i muskelstyrke 6,7. Dette kan imidlertiddelvis avhenge av arbeidsmekanismen til forbindelsen testet, og det er mulig at andre forbindelser forbedre styrke og ikke funksjonen. Derfor bør resultatene av testene tolkes med virkningsmekanismen av forbindelsen i tankene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Margriet Hulsker for hennes fotografiske assistanse og hjelp i å skaffe bilder av mus og anmelderne for sine svært konstruktive kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av ZonMw, TREAT-NMD (kontraktsnummer LSHM-CT-2006-036825) og Duchenne Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
- Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
- Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
- Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
- Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
- Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
- Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
- van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
- De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
- Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
- van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
- Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
- Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
- Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
- Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
- Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
- Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).
