Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

使用胱天蛋白酶复分析，以确定细胞凋亡的下丘脑细胞模型

Published: April 16, 2014 doi: 10.3791/51305
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4, 1,2, 1,2
1Department of Veterans Affairs, Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 4Department of Medicine, University of Minnesota Medical School, University of Minnesota

Summary

多重分析可以提供有益的信息为基础的细胞机制，消除试剂和不必要的重复实验的浪费。我们在这里描述的多路胱天蛋白酶3/7活性测定法，使用荧光和发光为基础的方法，以确定在以下与棕榈酸的氧化挑战的体外模型中的下丘脑细胞活力。

Abstract

复测定法中的复杂的细胞机制的研究的能力，省去了重复的实验中，提供了内部控制，并在成本和试剂减少浪费。这里，我们描述了多重测定，以评估细胞凋亡的优化以下棕榈酸（PA）的挑战， 在体外模型中的下丘脑，同时使用荧光和发光为基础的分析来测量在96孔的活细胞计数和caspase-3/7活性微量滴定板形式。下面的PA挑战，存活细胞用刃天青类荧光测定法测定。胱天蛋白酶3/7活性是再使用一个luminogenic基板，DEVD，并且标准化为细胞数目确定。此复用测定法是用于确定变化caspase活性以下的凋亡刺激物，如饱和脂肪酸挑战的有效技术。饱和脂肪酸的PA可以增加下丘脑的氧化应激和细胞凋亡，表明了潜在importa在研究饱和脂肪酸和神经元功能之间的关系描述此处测定法如的考。

Introduction

饮食富含饱和脂肪酸如棕榈酸（PA）的已与肥胖和其他并发症，包括心血管疾病和糖尿病1,2。高脂肪饮食也已显示出增加的氧化应激，细胞凋亡，和在下丘脑的神经元变性，食欲和能量消耗3-7中的重要调节器。了解通过高脂饮食诱导的曝光下丘脑功能失调的机制是对肥胖的药物治疗发展重要的。然而，通过这些食物中的脂肪会影响神经元功能的细胞机制仍不清楚。更好地理解如何脂肪如PA可能会引发发病丘脑凋亡途径是迈向这一目标的必要的第一步。本文的目的是描述一个多重检测用于体外测试与PA曝光神经元的反应，对于在H的研究开发利用ypothalamic神经退行性病变。我们提供了一种体外的96孔格式的多重检测，用于测量胱天蛋白酶每个细胞中分化的永生化的成体小鼠的下丘脑细胞与PA的8氧化攻击后线（称为A12）总数3/7活性的详细说明。

简单地说，细胞存活率确定通过基于刃天青分析如下PA的挑战。刃天青是经历酶减少，代谢活跃的细胞的细胞渗透性化合物想到一个过程，通过线粒体9出现。活细胞连续转换刃天青到试卤灵，产生的荧光信号正比于活细胞的数量。胱天蛋白酶3/7活性，随后分析使用DEVD-基于lumogenic测定。 DEVD是由胱天蛋白酶-3切割的氨基酸序列（ASP-GLU-VAL-ASP）。当该序列被耦合到lumogenic物质，在激活时细胞内的胱天蛋白酶3/7的和随后的裂解DEVD基板，发光产物被释放。该反应正比于胱天蛋白酶活性，从而诱导细胞凋亡。由于死细胞不能产生，即caspase-3/7活性本质上是短暂的;因此分析应该在30分钟至4小时后挑战之间完成，这取决于细胞应激的效果。细胞活力是成反比的胱天蛋白酶3/7活性，并且可以用于确定细胞死亡的机制。例如，该方法以前已经用来表明预处理与肽激素食欲减少细胞凋亡的挑战与过氧化氢 ​​的下丘脑细胞，这表明影响此治疗机制在防止氧化损伤10重要。要注意这些试验是细胞系和组织依赖性的，因为它们依赖于线粒体活性降低测定试剂是非常重要的。该协议已被优化，成年小鼠的下丘脑（A12）细胞;然而，所描述的方法可以被改变，以适应类似研究的范围之内。

从一个单一的复用培养测定以及提供了对个体进行测定几个原因的传统方法的优点。除了 ​​节省时间，细胞样本，并培养试剂，复分析还可以提供细胞存活和死亡的知识，提供内部控制，并省去了重复实验，11，12。

可供选择的方法都依赖于蛋白质印迹或ELISA中，这是可靠的测定法，但价格昂贵和费时的（1-2天），使用96孔形式时尤其如此。不含花费来培养细胞为复测定的时间，总时间不超过3小时。虽然该协议已被优化，与A12单元格的使用，它可以同时考虑的因素可能影响细胞的完整性来改变用于其他车型。阻止如果该协议将工作的一系列实验采矿取决于样本或实验条件的数量以及规划下游实验。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1。电镀细胞培养和维护

  1. 温暖的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养基（DMEM +10％FBS +1％青霉素/链霉素/新霉素）至37℃。
  2. 获得冷冻A12细胞的股价从-80°C。
  3. 快速解冻细胞37℃水浴;一旦解冻，轻轻吸细胞转移到一个75 厘米通风培养瓶中，并加入10 ml培养基。
  4. 烧瓶孵育过夜，5％CO 2培养箱在37°C吸介质后24小时，更换新鲜的培养基。持续到70-80％汇合得到（2-3天生长）生长的细胞。

2，计数和细胞电镀

  1. 温暖的DMEM和1x-胰蛋白酶-EDTA溶液至37℃。
  2. 从细胞中吸出物和介质洗2次，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
  3. 加入500μl的胰蛋白酶溶液，并在37℃下2-5分钟。
  4. 分离用刮刀和中止细胞在5ml的媒体从烧瓶中的细胞。通过过滤器传递细胞并通过细胞过滤到一个干净的50ml管中。可能需要通过过滤器传递细胞不止一次，但不要重复超过三次。
  5. 使用血细胞计数器确定细胞的量，以培养种子6000细胞/孔在96孔透明底的黑色或白色的围墙板中的100μl的介质的最终体积计数细胞。在5％CO 2下孵育板在37℃下放置24小时。

3，确定细胞活力和Caspase-3/7活性

  1. 转移PA到灭菌的5毫升玻璃小瓶中，并溶解在100％二甲亚砜（DMSO）中。稀库存PA溶液1:10 DMSO中，并把它添加到预热的DMEM培养液，以获得最终的工作为0.1mM PA浓度。用于控制媒体，添加DMSO中，添加到含有PA的介质相同的浓度。
  2. 在各取出介质井和更换50微升媒体+ / -巴勒斯坦权力机构。孵育板2小时，在5％CO 2在37℃下然后加入5微升刃天青试剂后，于室温下10分钟。
  3. 使用多模酶标仪，记录荧光（560 EX / 590 EM）来衡量细胞活力。结果表示为相对荧光单位（RFU）。
  4. 到相同的板中，添加55微升蛋白酶试剂和在室温下孵育2小时。
  5. 再次使用酶标仪，记录发光，从而测量胱天蛋白酶3/7活性。结果表示为相对发光单位（RLU），用发光成正比的胱天蛋白酶3/7活性。
  6. 正常化的caspase-3/7活性的细胞计数，由胱天蛋白酶3/7活性（RLU）除以细胞活力（RFU）。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

上述协议描述的结果在复用两个独立的实验，以确定细胞死亡的机制。 图1显示了协议的概述，以确定细胞活力和caspase-3/7活性。半胱天冬酶活性的细胞后2小时温育（ 图2A和表1）挑战与PA显著增加。的细胞膜完整性的丧失与细胞凋亡的诱导，这是明显的细胞后2小时暴露到PA（ 图2B）相关的形态学变化， 图3概括了PA诱导细胞凋亡，并演示了优化培养的重要性的潜在途径时间在DEVD试剂。

图1
图1为一个多重检测实验设计确定胱天蛋白酶3/7活性。将细胞接种在96孔板中24小时，然后接种于PA的存在或不存在。每个试剂存在孵育时间可能因型号而异。 点击这里查看大图。

图2
以下2个小时的PA挑战图2。胱天蛋白酶3/7活性增加。丘脑A12细胞在0.1mM PA的存在与否进行处理2小时。的caspase-3/7活性与宾夕法尼亚州（P <0.01）处理的细胞显著增加。细胞膜的完整性有明显消失在宾夕法尼亚州的存在。 点击这里查看大图。 图3
图3。PA诱导的细胞死亡的潜在途径。 点击这里查看大图。

控制 0.1 mm功率放大器
活细胞胱天蛋白酶3/7 比活细胞胱天蛋白酶3/7 比
荧光（560 EX / 590 EM） 发光650 nm的峰半胱天冬/活细胞荧光（560 EX / 590 EM） 发光650 nm的峰半胱天冬/可行的Ç英语学习生
1951.8 45.488 0.023305667 808.78 16.731 0.020686713
1647.0 46.​​011 0.027936248 788.84 22.080 0.027990467
1911.0 34.508 0.018057561 777.68 28.234 0.036305421
1792.5 14.183 0.007912413 807.45 20.457 0.025335315
1965.7 19.868 0.010107341 829.14 17.777 0.021440288
1803.0 20.229 0.011219634 742.35 29.280 0.039442312
1804.8 27.188 0.015064273 761.77 17.777 0.023336440
1890.1 40.7825 0.021576901 756.66 20.914 0.027639891

表1实施例所收集的数据和计算出的比率。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

在多重检测是一个已经在许多应用，如PCR芯片，免疫检测，以及其他基于蛋白质的检测方法13，14被科学家广泛接受的技术。最近，复用实验已经越来越利用体外板基础实验和已被确认为评估细胞毒性的准确方法和可行性12。在上述协议中，我们证明了复用荧光灯和发光检测的有效性，以确定在A12单元格下面的PA挑战的caspase-3/7活性和细胞活力。细胞活力，在初始的PA侮辱10分钟决定，允许活细胞的快速和可靠的代表性。应当指出的是，rezasurin基化试剂是活细胞测定法，允许进一步的端点进行测量;然而，优化的温育时间，以确定胱天蛋白酶3/7活性是ESSENTIAl来获得有用的结果15。

细胞凋亡可以由外部刺激，内部单元的信号，并产生明显的形态学和生化事件表面受体被激活。增加的胱天蛋白酶3的活性，DNA片段化，细胞膜完整性丧失，染色质凝聚和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）裂解是细胞凋亡的一些特定的标记，可以进行调查16。胱天蛋白酶3和7的激活是细胞凋亡的主要调节剂，使他们必不可少的标志物药理操作旨在减少凋亡损伤17来评估。细胞发生凋亡延长最终会发生继发性坏死，通过观察细胞裂解，强调选择合适的时间框架来确定的caspase-3/7活性11的重要性。如前所述，胱天蛋白酶3/7活性是短暂的;因此，根据细胞应激物的有效性，在确定第Ë适当的时机，以测定caspase活性可以采取一些努力。此外，我们的复用协议的主要限制是，胱天蛋白酶3/7活性可以测定，但不能定量化，将得到的溶胞产物不能被用于下游分析（ 如 Western印迹或基因表达）。

理解所选择的模型的细胞周期和如何应用这种技术时，它可能响应指定压力的特性是至关重要的，得到有效的结果。额外的考虑规划研究将评估时凋亡途径是：1）确定被以每孔接种细胞的适当的密度; 2）浓度和所使用的应激或药物孵化;和3）使用适当的孵育时间为在检测中使用的试剂。的，解决这些因素的初步研究标准化或缺乏通常会导致错误的数据。用于标准化日的时间和精力我们在这里描述ê复用检测提供了一种有价值的，可靠的和节省时间的技术凋亡的研究10。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有冲突披露。

Acknowledgments

这里所描述的工作是由退伍军人事务部，美国能源部生物医学实验室的研究和开发BX001686-1A1和VA康复研究和开发。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2  Cellutions Biosystems Inc. CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Invitrogen 10313-039
Fetal Bovine Serum  PAA Labs A15-751
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15070-063
Palmitic Acid Sigma-Aldrich P0500
Dimethy Sulfoxide  Sigma-Aldrich D2650

PrestoBlue Cell Viability Reagent		 Invitrogen A13262
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems Promega G8091
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile Thermo Fisher Scientific 165305
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
  2. Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
  3. Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
  4. Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
  5. Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
  6. Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
  7. Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
  8. Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
  9. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  10. Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
  11. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  12. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
  13. Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
  14. Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
  15. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  16. Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
  17. Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).

Tags

神经科学，第86期，细胞凋亡，肥胖，胱天蛋白酶，刃天青，DEVD，棕榈酸，下丘脑模型
使用胱天蛋白酶复分析，以确定细胞凋亡的下丘脑细胞模型
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Butterick, T. A., Duffy, C. M., Lee, … More

Butterick, T. A., Duffy, C. M., Lee, R. E., Billington, C. J., Kotz, C. M., Nixon, J. P. Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model. J. Vis. Exp. (86), e51305, doi:10.3791/51305 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter