Summary
Multiplex analyser kan gi nyttige opplysninger for grunnleggende cellulære mekanismene og eliminere sløsing av reagenser og unødvendige gjentatte eksperimenter. Vi beskriver her en multipleks caspase-3/7 aktivitetsanalyse, ved hjelp av fluorescerende og luminescerende-baserte metoder for å bestemme celle-levedyktighet i en in vitro modell hypothalamus følgende oksidativ utfordring med palmitinsyre.
Abstract
Evnen til å multiplekse assays i studier av komplekse cellulære mekanismer eliminerer behovet for gjentatte forsøk, gir intern kontroll, og reduserer avfall i kostnader og reagenser. Her beskriver vi optimalisering av en multipleks-analyse for å vurdere apoptose etter en palmitinsyre (PA) felling i en in vitro modell hypothalamus, ved bruk av både fluorescerende og luminescerende baserte analyser for å måle levedyktige celletall og kaspase-3/7 aktivitet i en 96-brønns mikrotiter-plate-format. Etter PA utfordring, ble levedyktige celler bestemt ved en resazurin baserte fluorescerende assay. Caspase-3/7-aktivitet ble deretter bestemt ved hjelp av en luminogenic substrat, DEVD og normalisert til cellenummer. Denne multipleksing undersøkelsen er en nyttig teknikk for å bestemme endringen i kaspase-aktivitet etter en apoptotisk stimulus, så som mettede fettsyrer utfordring. Den mettede fettsyre PA kan øke hypothalamus oksidativt stress og apoptose, som indikerer den potensielle importance av metoder slik som den som er beskrevet her i å studere forholdet mellom mettede fettsyrer og neuronal funksjon.
Introduction
Diett rik på mettede fettsyrer, slik som palmitin-syre (PA) har vært knyttet til fedme og andre samtidige sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom og diabetes 1, 2. Høyt fettinntak har også blitt vist å øke oksidativt stress, apoptose og neuronal degenerasjon i hypothalamus, en viktig regulator av appetitt og energiforbruk 3-7. Forstå mekanisme som fettrik diett eksponering induserer hypothalamus feilregulering er derfor viktig for utvikling av farmakologisk behandling for fedme. Men de cellulære mekanismene som fett påvirker nervecellefunksjon fortsatt uklare. En bedre forståelse av hvordan fett som PA kan utløse utbruddet av hypothalamus apoptotic trasé er et nødvendig første skritt mot dette målet. Målet med denne artikkelen er å beskrive en multipleks assay for in vitro testing av neuronal respons til eksponering PA, utviklet for bruk i studier av hypothalamic neurodegeneration. Vi gir en detaljert beskrivelse av en in vitro 96-brønners format multipleks-analyse for måling av caspase 3/7-aktivitet pr totalt antall celler i en differensiert udødelig voksen mus hypothalamus cellelinje (betegnet A12) etter oksydativ utfordring med PA 8..
I korthet blir cellenes levedyktighet bestemt etter utfordring PA via en resazurin baserte assay. Resazurin er en celle gjennomtrengelig stoff som gjennomgår enzymatisk reduksjon i metabolsk aktive celler, en fremgangsmåte tenkt skje via mitokondriene 9.. Levedyktige celler kontinuerlig konvertere resazurin til resorufin, som produserer et fluorescerende signal proporsjonal med antallet levedyktige celler. Caspase-3/7-aktivitet blir deretter analysert ved hjelp av en DEVD-baserte lumogenic assay. DEVD er en aminosyre-sekvens (Asp-Glu-Val-Asp) spaltes av caspase-3. Når denne sekvens er koplet til en lumogenic substans, ved aktivering av intracellulære caspase-3/7 og etterfølgende spaltingav DEVD substrat, blir luminescerende produktet frigjøres. Denne reaksjon er proporsjonal med kaspase-aktivitet og dermed til induksjon av apoptose. Som døde celler ikke kan produsere caspase, er caspase-3/7 aktivitets av natur forbigående; Derfor analyse bør fullføres mellom 30 min til 4 timer post-utfordring, avhengig av effektiviteten til cellen stressfaktor. Celleviabilitet er omvendt proporsjonal med caspase-3/7-aktivitet og kan brukes til å bestemme mekanismene for celledød. For eksempel har denne metoden tidligere blitt brukt til å vise at forbehandling med peptid-hormonet orexin reduserer apoptose i hypothalamus-celler utfordret med hydrogenperoksid, noe som tyder på at mekanismer som påvirkes av denne behandling er viktig for å beskytte mot oksydativ skade 10. Det er viktig å være oppmerksom på disse analysene er cellelinje-og vev-avhengig, slik at de er avhengige av mitokondriell aktivitet for å redusere analysereagensene. Denne protokollen er optimalisert for voksen mus hypothalamus (A12) celler; Menmetoder som er beskrevet kan bli endret for å passe innenfor omfanget av lignende undersøkelser.
Multiplexing assays fra en enkelt kultur vel gir en fordel i forhold til den tradisjonelle metode for å utføre individuelle analyser av flere grunner. I tillegg til å spare tid, celleprøver, og kultur reagenser, kan multipleksing assays også gi kunnskap om celle overlevelse og død, gir intern kontroll, og eliminerer behovet for gjentatte forsøk 11, 12.
Alternative metoder har stolt på Western-blots eller ELISAs, som er pålitelige analyser, men er kostbare og tidkrevende (1-2 dager), spesielt ved bruk av en 96-brønns format. Unntatt den tiden det tar for å dyrke celler for multipleksing analysen, er den totale tid som er mindre enn 3 timer. Mens denne protokollen er optimalisert for bruk med A12 celler, kan det bli endret for bruk i andre modeller, men husk samtidig faktorer som kan påvirke celle integritet. Avskrekkegruvedrift hvis denne protokollen vil fungere for en serie eksperimenter er avhengig av antallet prøver eller eksperimentelle betingelser og på nedstrøms planlagte eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Plating og vedlikehold av Cell Culture
- Varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kultur media (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / streptomycin / neomycin) til 37 ° C.
- Skaffe lager av frosne A12 celler fra -80 ° C.
- Raskt tine celler i 37 ° C vann-bad; Opptinte, forsiktig pipette celler til å overføre til en 75 cm 2 ventilert kultur kolbe og tilsett 10 ml kulturmedier.
- Inkuber kolbe over natten i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Sug media etter 24 timer og erstatte med nye medier. Fortsett voksende celler inntil 70-80% sammenløp oppnås (2-3 dager vekst).
2. Telling og Plating Cells
- Varm DMEM og 1x-trypsin-EDTA-løsning til 37 ° C.
- Sug mediet fra cellene, og vaskes to ganger med steril fosfatbufret saltløsning (PBS).
- Legg 500 pl trypsin-løsning og inkuberes ved 37 ° C i 2-5 min.
- Løsneceller fra kolben ved hjelp av en skraper og suspendere celler i 5 ml medium. Pass celler gjennom sil og passere gjennom celle sil i en ren 50 ml tube. Kan være nødvendig å passere cellene gjennom silen mer enn én gang, men ikke gjenta mer enn tre ganger.
- Telle-celler ved hjelp av et hemocytometer for å bestemme mengden av celler til kulturen til frø 6000 celler / brønn i en 96-brønns klar bunn sort eller hvit vegger plate i et sluttvolum på 100 ul av mediet. Inkuber platen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
Tre. Fastsettelse Cell Livskraftig og caspase-3/7 Activity
- Overfør PA til en steril 5 ml glassampulle, og oppløse i 100% dimetylsulfoksid (DMSO). Fortynn lager PA-løsning 1:10 i DMSO og legge den til DMEM forvarmet for å oppnå en endelig arbeidskonsentrasjon på 0,1 mM PA. For kontroll media, legger den samme konsentrasjonen av DMSO som er lagt til media som inneholder PA.
- Fjern materialet i hver brønn og erstatte med 50 mL media + / -PA. Inkuber platen i 2 timer i 5% CO2 ved 37 ° C. Deretter legger 5 pl resazurin reagens og inkuberes i 10 min ved romtemperatur.
- Ved hjelp av en multimode mikroplateleser, rekord fluorescens (560 EX / 590 EM) for å måle celle levedyktighet. Resultatene er presentert som relativ fluorescens enheter (RFU).
- Til den samme plate, tilsett 55 pl av caspase-reagens, og inkuber ved værelsetemperatur i 2 timer.
- Igjen bruker mikroplateleser, rekord luminescens å måle caspase-3/7 aktivitet. Resultatene er presentert som relative luminescens heter (RLU), med luminescens direkte proporsjonal med caspase-3/7-aktivitet.
- Å normal caspase-3/7 aktivitets til celletall, dele celle levedyktighet (RFU) etter caspase-3/7 aktivitets (RLU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen ovenfor beskriver resultatene i multipleksing to separate analyser for å bestemme mekanismene for celledød. Figur 1 viser en oversikt over den protokoll for å bestemme cellenes levedyktighet og kaspase-3/7-aktivitet. Caspase-aktivitet ble signifikant økt i cellene utfordret med PA etter 2 timers inkubasjon (figur 2A og tabell 1). Tap av cellemembranintegritet er en morfologisk endring assosiert med induksjon av apoptose, som er tydelig i celler etter 2 timers eksponering for PA (figur 2B). Figur 3 skisserer den potensielle løp hvor PA induserer apoptose og demonstrerer viktigheten av å optimalisere inkubasjon tid i DEVD-reagens.
Figur 1. Eksperimentell design for en multiplex analyseå bestemme kaspase-3/7-aktivitet. Celler blir utsådd i en 96-brønners plate i 24 timer og deretter inkubert i nærvær eller fravær av PA. Inkubasjonstidene i nærvær av hvert reagens kan variere avhengig av modell. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Caspase-3/7 aktiviteten økes etter 2 timers PA utfordring. Hypothalamus A12-celler ble behandlet i nærvær eller fravær av 0,1 mM PA i 2 timer. Caspase-3/7 aktivitet ble signifikant økt i celler behandlet med PA (p <0,01). Cellemembranen integritet er synlig tapt i nærvær av PA. Klikk her for å se større bilde. 
Figur 3. Potensiell vei for PA indusert celledød. Klikk her for å se større bilde.
| Kontroll | 0,1 mm i året | ||||
| Levedyktige celler | Caspase 3/7 | ratio | Levedyktige celler | Caspase 3/7 | ratio |
| Fluorescens (560 EX / 590 EM) | Luminescens 650 nm topp | Caspase / levedyktige celler | Fluorescens (560 EX / 590 EM) | Luminescens 650 nm topp | Caspase / levedyktig Calen |
| 1951,8 | 45,488 | 0,023305667 | 808,78 | 16,731 | 0,020686713 |
| 1647,0 | 46,011 | 0,027936248 | 788,84 | 22,080 | 0,027990467 |
| 1911,0 | 34,508 | 0,018057561 | 777,68 | 28,234 | 0,036305421 |
| 1792,5 | 14,183 | 0,007912413 | 807,45 | 20,457 | 0,025335315 |
| 1965,7 | 19,868 | 0,010107341 | 829,14 | 17,777 | 0,021440288 |
| 1803,0 | 20,229 | 0,011219634 | 742,35 | 29,280 | 0,039442312 |
| 1804,8 | 27,188 | 0,015064273 | 761,77 | 17,777 | 0,023336440 |
| 1890,1 | 40,7825 | 0,021576901 | 756,66 | 20,914 | 0,027639891 |
Tabell 1. Eksempel på innsamlede data og beregnede forholdstall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den multiplex-analysen er et godt akseptert teknikk som har blitt brukt av forskere i en rekke applikasjoner som PCR-mikromatriser, immunodeteksjonsprosedyren og andre protein-baserte deteksjonsmetoder 13, 14. Nylig har multipleksing analyser blitt stadig mer brukt i in vitro-plate-baserte forsøk og har blitt validert som en nøyaktig metode for å vurdere cytotoksisitet og levedyktighet 12. I den ovennevnte protokoll har vi demonstrere effektiviteten av multipleksing fluorescerende og luminescerende assays for å bestemme kaspase-3/7-aktivitet og cellelevedyktigheten i A12-celler Følgende PA utfordring. Cellenes levedyktighet ble bestemt i løpet av 10 min for initial PA fornærmelse, slik at for en hurtig og pålitelig fremstilling av levedyktige celler. Det bør bemerkes at rezasurin-baserte reagens er en levende celle assay som gjør det mulig for ytterligere endepunktene som skal måles; imidlertid optimalisere inkubasjonstid for å bestemme kaspase-3/7-aktivitet er vesentl å få brukbare resultater 15.
Apoptose kan aktiveres av eksterne stimuli, innvendige cellesignaler, og overflatereseptorer som resulterer i forskjellige morfologiske og biokjemiske hendelser. Økt caspase 3 aktivitet, DNA fragmentering, tap av cellemembranen integritet, kromatin kondens, og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage er noen spesifikke markører for apoptose som kan etterforsket 16. Aktivering av caspase 3 og 7 er primære modulatorer av apoptose, noe som gjør dem viktige markører for å vurdere i farmakologiske manipulasjoner med sikte på å redusere apoptotisk skade 17. Celler som gjennomgår langvarig apoptose vil etterhvert gjennomgå sekundær nekrose, observerbar av cellelyse, og understreker viktigheten av å velge en passende tidsramme for å bestemme caspase-3/7 aktivitets 11. Som tidligere nevnt, er kaspase-3/7 aktivitets transient; Derfor, avhengig av effektiviteten til cellen stressfaktor, bestemme the riktig timing å analysen caspase aktivitet kan ta litt innsats. I tillegg er de viktigste begrensninger for vår multipleksing protokoll er at caspase-3/7-aktivitet kan bestemmes, men ikke kvantifiseres, og det resulterende lysat kan ikke brukes til nedstrøms-analyser (dvs. Western blots eller genekspresjon).
Forståelse karakteristika av cellesyklus i den valgte modell, og hvor det kan svare til angitte stressfaktorer ved anvendelse av denne teknikken er kritisk for å oppnå gyldige resultater. Flere hensyn når du planlegger studier som vil evaluere apoptotiske trasé er: 1) å bestemme passende tetthet av celler som er seeded per brønn; 2) konsentrasjon og inkubering av den stressfaktor eller stoffet som brukes; og 3) den passende inkubasjonstid for reagensene som benyttes i en analyse. Mangelen på standardisering eller av foreløpige studier som tar disse hensynene vil vanligvis resultere i feilaktige data. Den tid og krefter brukes til å standard the multipleksing analysen vi beskriver her gir en verdifull, pålitelig, og tidsbesparende teknikk for apoptotiske studier 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet som beskrives her ble finansiert av US Department of Veterans Affairs bioingeniører Forskning og Utvikling BX001686-1A1 og VA Rehabilitering Forskning og Utvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
