Anvendelse af en Caspase Multiplexing assay til bestemmelse af apoptose i en Hypothalamus Cell Model

Summary

Multiplex analyser kan give gavnlig information for basale cellulære mekanismer og eliminere spild af reagenser og unødvendige gentagne eksperimenter. Vi beskriver her en multiplex caspase-3/7 aktivitet assay anvendelse af fluorescerende-og luminescerende-baserede metoder, for at bestemme cellelevedygtighed i en in vitro hypothalamus model efter oxidativ udfordring med palmitinsyre.

Abstract

Evnen til multiplex assays undersøgelser af komplekse cellulære mekanismer eliminerer behovet for gentagne eksperimenter giver interne kontroller, og mindsker spild omkostninger og reagenser. Her beskrives optimering af et multipleks assay til at vurdere apoptose efter en palmitinsyre (PA) udfordring i en in vitro hypothalamus model, ved hjælp af både fluorescerende og luminescerende assays til at måle levedygtige celletal og caspase-3/7 aktivitet i en 96-brønds mikrotiterpladeformat. Efter PA udfordring blev levedygtige celler bestemmes ved en resazurin-baserede fluorescerende assay. Caspase-3/7 aktivitet blev derefter bestemt ved hjælp af en luminogene substrat, DEVD og normaliseret til celle nummer. Denne multiplexing analyse er en nyttig teknik til at bestemme ændringer i caspaseaktivitet efter en apoptotisk stimulus, såsom mættet fedtsyre udfordring. Den mættede fedtsyre PA kan øge hypothalamus oxidativt stress og apoptose, der angiver den mulige indførselnce af assays, såsom den der er beskrevet her i at studere forholdet mellem mættede fedtsyrer og neuronal funktion.

Introduction

Kost rig på mættede fedtsyrer, såsom palmitinsyre (PA) har været knyttet til fedme og andre følgesygdomme, herunder hjerte-kar-sygdomme og diabetes ^{1, 2.} Højt fedtindhold har også vist sig at øge oxidativ stress, apoptose og neuronal degeneration i hypothalamus, en vigtig regulator af appetit og energiforbrug ^3-7. Er derfor vigtig for udviklingen af ​​farmakologiske behandlinger for fedme Forstå den mekanisme, hvorigennem højt fedtindhold kost eksponering inducerer hypothalamus dysregulering. Men de cellulære mekanismer, hvorigennem fedt påvirker neuronal funktion er fortsat uklare. En bedre forståelse af, hvordan fedtstoffer, såsom PA kan udløse udbrud af hypothalamus apoptotiske veje er et nødvendigt første skridt hen imod dette mål. Målet med denne artikel er at beskrive en multiplex assay for in vitro-test af neuronal respons på PA eksponering, udviklet til brug i studier af hypothalamic neurodegeneration. Vi giver en detaljeret beskrivelse af en in vitro 96-brønds format multiplex assay til måling af caspase 3/7 aktivitet pr samlede antal celler i en differentieret udødeliggjort voksen mus hypothalamus cellelinje (betegnet A12) efter oxidativ udfordring med PA ^8.

Kort fortalt cellelevedygtighed bestemt efter PA udfordring via en resazurin assay. Resazurin er en celle-permeable forbindelse, der undergår enzymatisk reduktion af metabolisk aktive celler, en fremgangsmåde tænkt ske via mitokondrierne ^9. Levedygtige celler kontinuerligt konvertere resazurin til resorufin, der producerer et fluorescerende signal proportionalt med antallet af levedygtige celler. Caspase-3/7 aktivitet analyseres derefter ved hjælp af en DEVD-baserede lumogenic assay. DEVD er en aminosyresekvens (Asp-Glu-Val-Asp) spaltes af caspase-3. Når denne sekvens er koblet til en lumogenic stof ved aktivering af intracellulær caspase-3/7 og efterfølgende spaltningaf DEVD substrat, det luminescerende produkt frigivet. Denne reaktion er proportional med caspaseaktivitet og dermed til induktion af apoptose. Da døde celler ikke kan producere caspase, caspase-3/7 aktivitet er af natur forbigående; analyse derfor skal udfyldes mellem 30 min til 4 timer efter udfordring, afhængigt af effektiviteten af ​​celle stressor. Cellelevedygtighed er omvendt proportional med caspase-3/7 aktivitet og kan anvendes til at bestemme mekanismer for celledød. For eksempel har denne metode tidligere blevet anvendt til at vise, at forbehandling med peptid hormon orexin nedsætter apoptose i hypothalamus celler udfordret med hydrogenperoxid, hvilket tyder på, at mekanismer, der er ramt af denne behandling er vigtige i at beskytte mod oxidativ skade ^10. Det er vigtigt at bemærke disse assays er cellelinie-og vævs-afhængig, da de afhængige mitokondriel aktivitet at reducere assayreagenser. Denne protokol er optimeret til voksen mus hypothalamus (A12) celler; imidlertidbeskrevne fremgangsmåder kan ændres til at passe inden for rammerne af tilsvarende forskning.

Multiplexing assays fra en enkelt kultur og giver en fordel i forhold til den traditionelle metode til udførelse af individuelle analyser af flere grunde. Ud over at spare tid, celleprøver og kultur reagenser kan multiplexing assays også give viden af cellernes overlevelse og død, giver den interne kontrol, og fjerne behovet for gentagne forsøg ^{11, 12.}

Alternative metoder har påberåbt Western blots eller ELISA'er, som er pålidelige analyser, men er dyre og tidskrævende (1-2 dage), især ved anvendelse af en 96-brønds format. Fradrag af den tid, det tager at dyrke celler til multiplexing assay samlede tid er mindre end 3 timer. Mens dette protokol er blevet optimeret til brug med A12-celler, kan det ændres til brug i andre modeller samtidig huske faktorer, der kan påvirke celle integritet. Determinedrift Hvis denne protokol ville arbejde for en række forsøg, afhænger af antallet af prøver eller eksperimentelle betingelser, og om planlagte downstream eksperimenter.

Protocol

1.. Plating og vedligeholdelse af Cell Culture Varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin) til 37 ° C. Opnå lager af frosne A12 celler fra -80 ° C. Hurtigt optø cellerne i 37 ° C vandbad; Optøede, forsigtigt pipette celler til at overføre til en 75 cm 2 ventileret kultur kolbe og tilsættes 10 ml af dyrkningsmedier. Inkuber kolbe natten over i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Aspirer…

Representative Results

Protokollen Ovenstående beskriver resultater i multiplexing to separate analyser for at fastslå mekanismer for celledød. Figur 1 viser en oversigt over protokollen til at bestemme cellernes levedygtighed og caspase-3/7 aktivitet. Caspaseaktivitet var signifikant forøget i celler udfordret med PA efter 2 timers inkubation (figur 2A og tabel 1). Tab af cellemembranens integritet er en morfologisk ændring der er associeret med induktion af apoptose, som er tydelig i c…

Discussion

Multiplex analyse er et godt accepteret teknik, der er blevet brugt af forskere i talrige applikationer såsom PCR microarrays, immundetektion og andre protein-baserede metoder til påvisning ^{13, 14.} For nylig har multiplexing assays blevet stadig mere anvendt i in vitro plade-baserede eksperimenter og er blevet valideret som en præcis metode til vurdering af cytotoksicitet og levedygtighed ^12.. I ovenstående protokol, vi demonstrere effektiviteten af ​​multiplexing fluorescerende og…

Materials

Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	10313-039
Fetal bovine serum	PAA Labs	A15-751
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	P0500
Dimethy sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13262
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems	Promega	G8091
Equipment
96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile	Thermo Fisher Scientific	165305
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate	Molecular Devices