Summary
Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.
Abstract
De mogelijkheid om multiplex assays in studies van complexe cellulaire mechanismen elimineert de noodzaak voor herhaalde experimenten, verschaft interne controles en vermindert afval kosten en reagentia. Hier beschrijven we optimalisatie van een multiplex assay apoptose beoordelen na een palmitinezuur (PA) uitdaging in een in vitro model hypothalamus, waarbij zowel fluorescerende en luminescerende gebaseerde bepalingen om levensvatbare cellen en caspase-3/7 te meten in een 96 putjes microtiterplaatformaat. Na PA uitdaging, werden levensvatbare cellen bepaald door een-resazurin gebaseerde fluorescentie. Caspase-3/7 activiteit werd vervolgens bepaald met een luminogenic substraat, DEVD en genormaliseerd naar het aantal cellen. Dit multiplexing test is een nuttige techniek voor het bepalen van veranderingen in caspase activiteit na een apoptotische stimulus, zoals verzadigde vetzuren uitdaging. De verzadigde vetzuren PA kan verhogen hypothalamus oxidatieve stress en apoptose, met vermelding van de mogelijke invoernce assays zoals beschreven hier bestuderen van verbanden tussen verzadigde vetzuren en neuronale functie.
Introduction
Diëten rijk aan verzadigde vetzuren zoals palmitinezuur (PA) zijn verbonden met obesitas en andere comorbiditeiten, waaronder cardiovasculaire ziekte en diabetes 1, 2. Vetrijke diëten hebben ook aangetoond dat oxidatieve stress, apoptose en neuronale degeneratie in de hypothalamus, een belangrijke regulator van de eetlust en het energieverbruik verhogen 3-7. Inzicht in het mechanisme waardoor blootstelling vetrijke dieet induceert hypothalamus ontregeling is dus belangrijk voor de ontwikkeling van farmacologische behandelingen voor zwaarlijvigheid. Echter, de cellulaire mechanismen waardoor vet in de voeding van invloed op neuronale functie blijven onduidelijk. Een beter begrip van hoe vetten zoals PA begin van de hypothalamus apoptoseroutes zou kunnen leiden is een noodzakelijke eerste stap in de richting van dit doel. Het doel van dit artikel is om een multiplex assay voor in vitro testen van neuronale respons op PA belichting, ontwikkeld voor gebruik in studies van h beschrijvenypothalamic neurodegeneratie. Wij geven een gedetailleerde beschrijving van een in vitro 96-well formaat multiplex assay voor het meten caspase 3/7 activiteit per totaal aantal cellen in een gedifferentieerde geïmmortaliseerde volwassen muis hypothalamus cellijn (aangeduid A12) na challenge met oxidatieve PA 8.
In het kort wordt levensvatbaarheid van de cellen bepaald volgens PA uitdaging via een resazurin gebaseerde test. Resazurin is een cel permeabele stof die enzymatische reductie van metabool actieve cellen ondergaat, een werkwijze verondersteld op te treden via de mitochondriën 9. Levensvatbare cellen continu omzetten Resazurin te resorufine, produceren een fluorescent signaal evenredig met het aantal levensvatbare cellen. Caspase-3/7 Activiteit vervolgens geanalyseerd met een DEVD-gebaseerde lumogenic assay. DEVD is een aminozuursequentie (Asp-Glu-Val-Asp) gesplitst door caspase-3. Wanneer deze sequentie is gekoppeld met een lumogenic stof, na activatie van intracellulaire caspase-3/7 en daaropvolgende splitsingvan DEVD substraat, wordt het lichtgevende product uitgebracht. Deze reactie is evenredig met caspase activiteit en daarmee de inductie van apoptose. Dode cellen niet kan produceren caspase, caspase-3/7 activiteit is van nature van voorbijgaande aard; Daarom analyse moet verrichten tussen 30 minuten tot 4 uur na challenge, afhankelijk van de effectiviteit van de cel stressor. Cellevensvatbaarheid is omgekeerd evenredig met caspase-3/7 activiteit en kunnen worden gebruikt om mechanismen van celdood bepalen. Zo heeft deze methode eerder gebruikt dat voorbehandeling met het peptide hormoon orexin vermindert apoptose in hypothalamus cellen geprikkeld met waterstofperoxide, wat suggereert dat de mechanismen die door deze behandeling zijn belangrijk in het beschermen tegen oxidatieve beschadiging 10 te tonen. Het is belangrijk op te merken deze tests zijn cellijn-en weefsel-afhankelijke, als ze vertrouwen op mitochondriale activiteit assay reagentia verlagen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor volwassen muis hypothalamus (A12) cellen; echter,beschreven werkwijzen kunnen worden gewijzigd om te passen onder soortgelijk onderzoek.
Multiplexing testen van een kweekputje biedt een voordeel boven de traditionele methode om afzonderlijke tests om verschillende redenen. Naast het besparen van tijd, celsteekproeven en cultuur reagentia, kan multiplexing assays ook kennis van de overleving van de cel en de dood, bieden interne controles, en elimineren de noodzaak voor herhaalde experimenten 11, 12.
Alternatieve werkwijzen ingeroepen Western blots of ELISA's, waarvoor betrouwbare tests zijn, maar zijn duur en tijdrovend (1-2 dagen), vooral bij gebruik van een 96-putjes. Exclusief de tijd die het kost om de cultuur cellen voor de multiplexing-assay, de totale tijd is minder dan 3 uur. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met A12 cellen kunnen worden aangepast voor gebruik in andere modellen maar vergeet factoren die cel integriteit kunnen beïnvloeden. Afschrikkenmijnbouw of dit protocol zou werken voor een reeks experimenten afhankelijk van het aantal monsters en proefomstandigheden en geplande downstream experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating en onderhoud van Cultuur van de Cel
- Warm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) cultuur media (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine / Neomycine) tot 37 ° C.
- Verkrijgen voorraad van bevroren A12 cellen van -80 ° C.
- Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad; eenmaal ontdooid, zachtjes pipet cellen over te dragen aan een 75 cm 2 geventileerde kolf en voeg 10 ml van de cultuur media.
- Incubeer kolf overnacht in 5% CO 2 incubator bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Blijven groeien cellen tot 70-80% confluentie verkregen (2-3 dagen groei).
2. Tellen en Plating Cellen
- Warm DMEM en 1x met trypsine-EDTA-oplossing tot 37 ° C.
- Zuig media uit cellen en was tweemaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 500 pi van trypsine-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten.
- Losmakencellen van kolf met een schraper en suspendeer de cellen in 5 ml medium. Passeren cellen door zeef en passeren cel zeef in een schone 50 ml tube. Kan nodig zijn om de cellen meer dan een keer passeren zeef, maar niet herhalen meer dan drie keer.
- Tellen cellen met een hemocytometer om hoeveelheid cellen vast cultuur tot 6.000 cellen / putje zaad in een 96-well clear bottom zwart of wit ommuurde plaat in een eindvolume van 100 ul medium. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.
3. Bepalen levensvatbaarheid van de cellen en caspase-3/7 Activiteit
- Breng PA een steriele 5 ml glazen flesje en oplosbaar in 100% dimethylsulfoxide (DMSO). Verdun voorraad PA oplossing 01:10 in DMSO toevoegen aan DMEM voorverwarmd tot een uiteindelijke werking concentratie van 0,1 mM PA verkrijgen. Voor controle-media, voeg dezelfde concentratie van DMSO die wordt toegevoegd aan media met PA.
- Verwijder de media in elk putje en te vervangen door 50 ul media + / -PA. Incubeer de plaat gedurende 2 uur in 5% CO2 bij 37 ° C. Voeg vervolgens 5 ul resazurin reagens en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Met behulp van een multimode microplaataflezer, opnemen fluorescentie (560 EX / 590 EM) levensvatbaarheid van de cellen te meten. Resultaten worden gepresenteerd als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU).
- Om dezelfde plaat, voeg 55 ul van caspase reagens en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Nogmaals met de microplaatlezer, opnemen luminescentie tot caspase-3/7 activiteit te meten. Resultaten worden gepresenteerd als relatieve luminescentie-eenheden (RLU) met luminescentie recht evenredig met caspase-3/7 activiteit.
- Om caspase-3/7 activiteit normaliseren om celgetal, verdeel cel levensvatbaarheid (RFU) door caspase-3/7 activiteit (RLU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hierboven beschreven resultaten multiplexing twee assays mechanismen van celdood bepalen. Figuur 1 toont een overzicht van het protocol levensvatbaarheid van de cellen en caspase-3/7 activiteit te bepalen. Caspase activiteit significant verhoogd in cellen geprikkeld met PA na 2 uur incubatie (Figuur 2A en tabel 1). Verlies van celmembraanintegriteit een morfologische verandering geassocieerd met de inductie van apoptose, die zichtbaar is in cellen na 2 uur blootstelling aan PA (figuur 2B). Figuur 3 schetst de mogelijke route waarin PA induceert apoptose en toont het belang van het optimaliseren incubatie tijd in de DEVD reagens.
Figuur 1. Experimenteel ontwerp voor een multiplex assaycaspase-3/7 activiteit te bepalen. Cellen worden uitgezaaid in een 96-well plaat gedurende 24 uur en vervolgens geïncubeerd in de aanwezigheid of afwezigheid van PA. Incubatietijd in de aanwezigheid van elk reagens kan variëren afhankelijk van het model. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Caspase-3/7 Activiteit toegenomen na 2 uur PA uitdaging. Hypothalamus A12 cellen werden in aanwezigheid of afwezigheid van 0,1 mM PA behandeld gedurende 2 uur. Caspase-3/7 activiteit significant verhoogd in cellen behandeld met PA (p <0.01). Celmembraan integriteit is zichtbaar verloren in de aanwezigheid van PA. Klik hier voor grotere afbeelding. 
Figuur 3. Mogelijke route van PA-geïnduceerde celdood. Klik hier voor grotere afbeelding.
| Controle | 0,1 mM PA | ||||
| Levensvatbare cellen | Caspase 3/7 | verhouding | Levensvatbare cellen | Caspase 3/7 | verhouding |
| Fluorescentie (560 EX / 590 EM) | Luminescentie 650 nm piek | Caspase / levensvatbare cellen | Fluorescentie (560 EX / 590 EM) | Luminescentie 650 nm piek | Caspase / Levensvatbare Cellen |
| 1951,8 | 45,488 | 0,023305667 | 808,78 | 16,731 | 0,020686713 |
| 1647,0 | 46,011 | 0,027936248 | 788,84 | 22.080 | 0,027990467 |
| 1911,0 | 34,508 | 0,018057561 | 777,68 | 28,234 | 0,036305421 |
| 1792,5 | 14,183 | 0,007912413 | 807,45 | 20,457 | 0,025335315 |
| 1965,7 | 19,868 | 0,010107341 | 829,14 | 17,777 | 0,021440288 |
| 1803,0 | 20.229 | 0,011219634 | 742,35 | 29,280 | 0,039442312 |
| 1804,8 | 27,188 | 0,015064273 | 761,77 | 17,777 | 0,023336440 |
| 1890,1 | 40,7825 | 0,021576901 | 756,66 | 20,914 | 0,027639891 |
Tabel 1. Voorbeeld van de verzamelde gegevens en berekende ratio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De multiplex test is een algemeen aanvaarde techniek die is gebruikt door wetenschappers in talrijke toepassingen zoals PCR microarrays, immunodetectie en andere op eiwit gebaseerde detectiemethoden 13, 14. Onlangs hebben multiplexing assays steeds gebruikt in in vitro-plaat gebaseerde experimenten en zijn gevalideerd als een nauwkeurige methode om de cytotoxiciteit en de levensvatbaarheid 12. In het bovenstaande protocol, we tonen de effectiviteit van multiplexing TL-en lichtgevende assays om caspase-3/7 activiteit en levensvatbaarheid van de cellen bepalen A12 cellen na PA uitdaging. Cellevensvatbaarheid werd bepaald binnen 10 minuten initiële PA belediging, waardoor een snelle en betrouwbare weergave van levensvatbare cellen. Opgemerkt wordt dat de rezasurin gebaseerde reagens een levende cel assay die wordt verdere eindpunten te meten; echter, het optimaliseren van de incubatietijd voor caspase-3/7 activiteit te bepalen is essential tot bruikbare resultaten te verkrijgen 15.
Apoptose kan worden geactiveerd door externe prikkels, interne celsignalen en oppervlaktereceptoren waardoor verschillende morfologische en biochemische gebeurtenissen. Verhoogde caspase 3 activiteit, DNA-fragmentatie, verlies van celmembraan integriteit, chromatine condensatie, en poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) splitsing zijn een aantal specifieke merkers van apoptose die kunnen worden onderzocht 16. Activering van caspase 3 en 7 zijn de primaire modulatoren van apoptose, waardoor ze essentiële markers om te beoordelen in farmacologische manipulaties gericht op het terugdringen apoptotische schade 17. Cellen die langdurig apoptose zal uiteindelijk ondergaan secundaire necrose, waarneembaar cellysis, het benadrukken van het belang van het kiezen van een juiste tijdsbestek tot caspase-3/7 activiteit 11 te bepalen. Zoals eerder vermeld, caspase-3/7 activiteit voorbijgaande; Daarom, afhankelijk effectiviteit cel stressor, bepalen the juiste timing om caspaseactiviteit test kan enige inspanning. Bovendien beschikt de grootste beperkingen voor onze multiplexing protocol is dat caspase-3/7 activiteit kan bepaald maar niet gekwantificeerd en de resulterende lysaat kan niet worden gebruikt voor stroomafwaartse testen (bijvoorbeeld Western-blots of genexpressie).
Inzicht kenmerken van de celcyclus van het model en hoe het zou reageren aangewezen stressoren bij de toepassing van deze techniek is essentieel voor betrouwbare resultaten te verkrijgen. Aanvullende overwegingen bij de planning van studies die zal evalueren apoptoseroutes zijn: 1) het bepalen van de juiste dichtheid van cellen die per well; 2) concentratie en incubatie van de stressor of drugs gebruikt; en 3) de geschikte incubatietijd voor de reagentia in een test. Het gebrek aan standaardisatie of van voorbereidende studies dat deze overwegingen te pakken zal in het algemeen leiden tot foutieve gegevens. De tijd en moeite gebruikt om e standaardiserene multiplexing test hier bedoeld een waardevolle, betrouwbare en tijdbesparende techniek voor apoptotische studies 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Het hier beschreven onderzoek werd gefinancierd door het Amerikaanse Department of Veterans Affairs Biomedische Laboratorium Onderzoek en Ontwikkeling BX001686-1A1 en VA Revalidatie Onderzoek en Ontwikkeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
