Summary
Ensayos multiplex pueden proporcionar información útil para los mecanismos celulares básicos y eliminar los residuos de los reactivos y experimentos repetitivos innecesarios. Se describe aquí un múltiplex de la caspasa-3/7 ensayo de actividad, utilizando métodos fluorescentes y luminiscentes basados en, para determinar la viabilidad celular en un modelo hipotalámico in vitro después de desafío oxidativo con ácido palmítico.
Abstract
La capacidad de multiplexar ensayos en los estudios de los mecanismos celulares complejas elimina la necesidad de experimentos repetitivos, proporciona controles internos, y disminuye los residuos en los costos y los reactivos. Aquí se describe la optimización de un ensayo múltiple para evaluar la apoptosis después de un ácido palmítico (PA) en un modelo de desafío hipotalámico in vitro, usando tanto fluorescente y luminiscente basada en ensayos para medir el recuento de células viables y la caspasa-3/7 actividad en un 96-así formato de placa de microtitulación. Después de la exposición PA, las células viables se determinaron por un ensayo fluorescente basado en resazurina. La caspasa-3/7 actividad fue luego determinado utilizando un sustrato luminógeno, DEVD, y se normalizó al número de células. Este ensayo multiplexado es una técnica útil para determinar el cambio en la actividad de la caspasa después de un estímulo apoptótico, tales como desafío ácido graso saturado. El ácido graso saturado PA puede aumentar el estrés oxidativo del hipotálamo y la apoptosis, lo que indica el potencial de importaciónNCE de ensayos tales como el que se describe aquí en el estudio de la relación entre los ácidos grasos saturados y la función neuronal.
Introduction
Las dietas ricas en ácidos grasos saturados, como el ácido palmítico (PA) se han relacionado con la obesidad y otras comorbilidades, como la enfermedad cardiovascular y la diabetes 1, 2. Las dietas altas en grasa también se ha demostrado que aumentar el estrés oxidativo, la apoptosis, y la degeneración neuronal en el hipotálamo, un importante regulador del apetito y el gasto de energía 3-7. Entender el mecanismo a través del cual la exposición dieta rica en grasas induce desregulación hipotalámica tanto, es importante para el desarrollo de tratamientos farmacológicos para la obesidad. Sin embargo, los mecanismos celulares a través del cual la grasa dietética afecta a la función neuronal siguen sin estar claros. Una mejor comprensión de cómo las grasas tales como PA podrían dar lugar a la aparición de las vías de apoptosis hipotálamo es un primer paso necesario hacia este objetivo. El objetivo de este artículo es describir un ensayo múltiple para las pruebas in vitro de la respuesta neuronal a la exposición PA, desarrollado para su uso en estudios de hneurodegeneración ypothalamic. Proporcionamos una descripción detallada de un formato de 96 pocillos de ensayo multiplex in vitro para medir la caspasa 3/7 actividad por el número total de células en un ratón adulto línea diferenciada inmortalizado hipotalámico celular (designado A12) después del desafío oxidativo con PA 8.
En pocas palabras, la viabilidad celular se determina después de la exposición a través de un ensayo de PA resazurin basado. La resazurina es un compuesto permeable a la célula que se somete a reducción enzimática en las células metabólicamente activas, un proceso de pensamiento que se produzca a través de la mitocondria 9. Las células viables se convierten continuamente resazurina a resorufina, la producción de una señal fluorescente proporcional al número de células viables. La actividad de caspasa-3/7 se analiza a continuación, utilizando un ensayo basado lumogenic-DEVD. DEVD es una secuencia de aminoácidos (Asp-Glu-Val-Asp) escindido por la caspasa-3. Cuando esta secuencia está acoplado a una sustancia lumogenic, tras la activación de intracelular de la caspasa-3/7 y posterior escisiónde sustrato DEVD, el producto luminiscente se libera. Esta reacción es proporcional a la actividad de caspasa y por lo tanto a la inducción de la apoptosis. Como las células muertas no pueden producir la caspasa, la caspasa-3/7 actividad es de naturaleza transitoria; Por lo tanto, el análisis debe ser completado entre 30 min a 4 horas después de la exposición, en función de la eficacia de estrés celular. La viabilidad celular es inversamente proporcional a la actividad de la caspasa-3/7 y se puede utilizar para determinar los mecanismos de muerte celular. Por ejemplo, este método se ha utilizado anteriormente para mostrar que el tratamiento previo con la hormona péptido orexina reduce la apoptosis en las células hipotalámicas desafiados con peróxido de hidrógeno, lo que sugiere que los mecanismos afectados por este tratamiento son importantes en la protección contra el daño oxidativo 10. Es importante tener en cuenta estos ensayos son la línea-y celular dependiente de tejido, ya que se basan en la actividad mitocondrial para reducir los reactivos de ensayo. Este protocolo ha sido optimizado para (A12), las células del hipotálamo de ratones adultos; Sin embargo,métodos descritos pueden alterarse para ajustarse dentro del alcance de investigaciones similares.
Ensayos de multiplexación de un solo pocillo de cultivo proporciona una ventaja sobre el método tradicional de realizar ensayos individuales por varias razones. Además de tiempo, muestras de células, y los reactivos de cultivo de ahorro, los ensayos de multiplexación también pueden proporcionar el conocimiento de la supervivencia celular y la muerte, proporcionar controles internos, y eliminar la necesidad de experimentos repetitivos 11, 12.
Los métodos alternativos se han basado en transferencias de Western o ELISA, que son ensayos fiables, pero son caros y consumir tiempo (1-2 días), especialmente cuando se utiliza un formato de 96 pocillos. Excluyendo el tiempo que tarda en células de cultivo para el ensayo de multiplexación, el tiempo total es de menos de 3 h. Aunque este protocolo ha sido optimizado para su uso con células A12, y puede ser modificada para su uso en otros modelos teniendo en cuenta factores que pueden influir en la integridad celular. Disuadirminería si este protocolo funcionaría para una serie de experimentos depende del número de muestras o condiciones experimentales y en experimentos posteriores previstas.
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Protocol
1. Plating y Mantenimiento de Cultivos Celulares
- Medio Eagle Modificado de calentamiento por Dulbecco (DMEM) medio de cultivo (DMEM + 10% de FBS + 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina) a 37 ° C.
- Obtener un balance de las células congeladas A12 de -80 ° C.
- Rápidamente descongelar las células en 37 ° C baño de agua; una vez descongelado, suavemente las células de pipeta para transferir a un frasco de cultivo de ventilación 75 cm2 y añadir 10 ml de medio de cultivo.
- Incubar frasco durante la noche en 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C. Aspirar los medios después de 24 horas y reemplazar con medio fresco. Continúe creciendo las células hasta que se obtenga un 70-80% de confluencia (crecimiento de 2-3 días).
2. Contar y células en placas
- DMEM Cálido y 1 x solución de tripsina-EDTA a 37 º C.
- Aspirar los medios de las células y se lavan dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).
- Añadir 500 l de solución de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 2-5 min.
- Despegarcélulas del frasco utilizando una espátula y suspender las células en 5 ml de medio. Pasar las células a través del filtro y pasar a través de filtro de células en un tubo limpio de 50 ml. Puede que tenga que pasar las células a través del filtro más de una vez, pero no repita más de tres veces.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro para determinar el importe de las células a la cultura de sembrar 6.000 células / pocillo en una placa de color negro o blanco 96 pocillos de fondo claro amurallado en un volumen final de 100 l de los medios de comunicación. Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas.
3. La determinación de la viabilidad celular y la caspasa-3/7 Actividad
- Transferencia PA a un vial de vidrio de 5 ml estéril y solubilizar en 100% de dimetil sulfóxido (DMSO). Diluir la solución madre PA 1:10 en DMSO y añadirlo a precalentado DMEM para obtener una concentración de trabajo final de 0,1 mM PA. Para los medios de control, agregue la misma concentración de DMSO que se añade a los medios de comunicación que contienen PA.
- Retire los medios de comunicación en cada pozo y reemplazar con 50 medios mu l + / -PA. Incubar la placa durante 2 horas en 5% de CO 2 a 37 ° C. Añadir a continuación 5 reactivo resazurin l y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- El uso de un lector de microplacas multimodo, ficha fluorescencia (560 EX / 590 EM) para medir la viabilidad celular. Los resultados se presentan como unidades de fluorescencia relativa (RFU).
- Para la misma placa, añadir 55 l de reactivo de caspasa y se incuba a temperatura ambiente durante 2 h.
- Una vez más mediante el lector de microplacas, ficha luminiscencia para medir la actividad de la caspasa-3/7. Los resultados se presentan como unidades relativas de luminiscencia (RLU), con luminiscencia directamente proporcional a la caspasa-3/7 actividad.
- Para normalizar la actividad de caspasa-3/7 para el recuento de células, dividir la viabilidad celular (RFU) por la caspasa-3/7 actividad (RLU).
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Representative Results
El protocolo anterior describe los resultados en dos ensayos separados de multiplexación para determinar los mecanismos de muerte celular. Figura 1 muestra una visión general del protocolo para determinar la viabilidad celular y la caspasa-3/7 actividad. Actividad caspasa fue significativamente mayor en las células estimuladas con PA después de 2 horas de incubación (Figura 2A y el Cuadro 1). La pérdida de integridad de la membrana celular es un cambio morfológico asociado con la inducción de la apoptosis, que es evidente en las células después de 2 h de exposición a PA (Figura 2B). Figura 3 describe la vía de potencial en la que PA induce la apoptosis y demuestra la importancia de optimizar la incubación tiempo en el reactivo DEVD.
Figura 1. Diseño experimental para un ensayo múltiplepara determinar la actividad de la caspasa-3/7. Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos durante 24 horas y después se incubaron en presencia o ausencia de PA. Los tiempos de incubación en presencia de cada reactivo puede variar dependiendo del modelo. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
La actividad de la Figura 2. Caspasa-3/7 se incrementa después de la exposición PA 2 h. Células hipotalámicas A12 fueron tratados en la presencia o ausencia de 0,1 mM de PA durante 2 horas. La actividad de caspasa-3/7 fue significativamente mayor en las células tratadas con PA (p <0,01). Integridad de la membrana celular se pierde visiblemente en presencia de PA. Haga clic aquí para ver la imagen más grande. 
Figura 3. Potencial vía de la muerte celular inducida por el PA. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
| Control | 0,1 mM de PA | ||||
| Las células viables | Caspasa 3/7 | proporción | Las células viables | Caspasa 3/7 | proporción |
| Fluorescencia (560 EX / 590 EM) | Luminiscencia 650 nm pico | Caspasa / células viables | Fluorescencia (560 EX / 590 EM) | Luminiscencia 650 nm pico | La caspasa / Viable Cells |
| 1951.8 | 45.488 | 0.023305667 | 808.78 | 16.731 | 0.020686713 |
| 1647.0 | 46.011 | 0.027936248 | 788.84 | 22.080 | 0.027990467 |
| 1911.0 | 34.508 | 0.018057561 | 777.68 | 28.234 | 0.036305421 |
| 1792.5 | 14.183 | 0.007912413 | 807.45 | 20.457 | 0.025335315 |
| 1965.7 | 19.868 | 0.010107341 | 829.14 | 17.777 | 0.021440288 |
| 1803.0 | 20.229 | 0.011219634 | 742.35 | 29.280 | 0.039442312 |
| 1804.8 | 27.188 | 0.015064273 | 761.77 | 17.777 | 0.023336440 |
| 1890.1 | 40.7825 | 0.021576901 | 756.66 | 20.914 | 0.027639891 |
Tabla 1. Ejemplo de los datos recogidos y los coeficientes calculados.
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Discussion
El ensayo multiplex es una técnica bien aceptada que ha sido usado por los científicos en numerosas aplicaciones tales como microarrays de PCR, inmunodetección, y otros métodos de detección basados en proteínas 13, 14. Recientemente, los ensayos de multiplexado se han convertido en cada vez más utilizado en los experimentos in vitro basado en la placa y se han validado como un método preciso para determinar la citotoxicidad y viabilidad 12. En el protocolo anterior, se demuestra la eficacia de ensayos fluorescentes y luminiscentes de multiplexación para determinar la actividad de la caspasa-3/7 y la viabilidad celular en células A12 siguientes desafío PA. La viabilidad celular se determinó dentro de 10 min de lesión inicial PA, lo que permite una representación rápida y fiable de células viables. Cabe señalar que el reactivo de base-rezasurin es un ensayo de células en vivo que permite más puntos finales para ser medidos; Sin embargo, la optimización del tiempo de incubación para determinar la actividad de la caspasa-3/7 es essential para obtener resultados utilizables 15.
La apoptosis puede ser activado por estímulos externos, las señales internas de la célula, y los receptores de superficie resultantes en acontecimientos morfológicos y bioquímicos distintos. Aumento de la actividad de caspasa 3, la fragmentación del ADN, pérdida de integridad de la membrana celular, condensación de la cromatina, y la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de escisión son algunos marcadores específicos de la apoptosis que pueden investigarse 16. La activación de caspasa 3 y 7 son moduladores primarios de la apoptosis, lo que los marcadores esenciales para evaluar en las manipulaciones farmacológicas dirigidas a reducir el daño por apoptosis 17. Las células que sufren apoptosis prolongada eventualmente sufrir necrosis secundaria, observable por la lisis celular, lo que subraya la importancia de la elección de un marco de tiempo apropiado para determinar la actividad de la caspasa-3/7 11. Como se mencionó anteriormente, la caspasa-3/7 actividad es transitoria; Por lo tanto, dependiendo de la eficacia de estrés celular, para determinar the momento apropiado para analizar la actividad de caspasas puede tomar un poco de esfuerzo. Además, las principales limitaciones de nuestro protocolo de multiplexación son que la actividad de la caspasa-3/7 puede determinar, pero no cuantificado, y el lisado resultante no puede ser utilizado para los ensayos de aguas abajo (es decir, Western blots o expresión de genes).
Comprender las características del ciclo celular del modelo elegido y cómo podría responder a los factores de estrés designados al aplicar esta técnica es fundamental para obtener resultados válidos. Consideraciones adicionales en la planificación de los estudios que evaluarán las vías de apoptosis son: 1) la determinación de la densidad adecuada de las células que están sembradas por pocillo; 2) la concentración y la incubación del agente estresante o medicamento que se usa; y 3) el tiempo de incubación apropiado para los reactivos utilizados en un ensayo. La falta de normalización o de los estudios preliminares que abordan estas consideraciones generalmente dará como resultado en datos erróneos. El tiempo y esfuerzo utilizado para estandarizar ªensayo de multiplexación e describimos aquí proporciona una técnica valiosa, confiable y de ahorro de tiempo para los estudios de apoptosis 10.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos a revelar.
Acknowledgments
El trabajo aquí descrito fue financiado por los EE.UU. Departamento de Asuntos de Veteranos Biomédica Laboratorio de Investigación y Desarrollo BX001686-1A1 y VA Rehabilitación de Investigación y Desarrollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
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