Summary
Saggi Multiplex possono fornire informazioni utile per i meccanismi cellulari di base ed eliminare gli sprechi di reagenti ed esperimenti ripetitivi inutili. Descriviamo qui un multiplex caspasi-3/7 saggio di attività, utilizzando metodi fluorescenti e si basano luminescenti-, per determinare la vitalità cellulare in un modello in vitro ipotalamico seguente sfida ossidativa con acido palmitico.
Abstract
La capacità di multiplexing saggi in studi sui meccanismi cellulari complesse elimina la necessità di esperimenti ripetitivi, fornisce controlli interni, e diminuisce rifiuti nei costi e reagenti. Qui si descrive l'ottimizzazione di un saggio multiplex per valutare l'apoptosi in seguito a un acido palmitico (PA) sfida in un modello ipotalamica in vitro, utilizzando sia fluorescenti e luminescenti saggi basati misurare conteggio delle cellule vitali e caspasi-3/7 attività in un ben 96 formato micropiastra. Seguendo PA sfida, cellule vitali sono stati determinati da un test di fluorescenza basato resazurin-. Caspasi-3/7 attività è stata poi determinata con un substrato luminogenic, DEVD e normalizzato al numero di cellulare. Questo saggio multiplexing è una tecnica utile per determinare cambiamento nell'attività caspasi seguente uno stimolo apoptotico, come sfida acido grasso saturo. L'acido grasso saturo PA può aumentare ipotalamica stress ossidativo e apoptosi, indicando la possibilità ImportaSNO di saggi come quello descritto qui in studio del rapporto tra acidi grassi saturi e funzione neuronale.
Introduction
Le diete ricche di acidi grassi saturi come l'acido palmitico (PA) sono state legate a obesità e altre patologie concomitanti, tra cui le malattie cardiovascolari e il diabete 1, 2. Diete ricche di grassi hanno anche dimostrato di aumentare lo stress ossidativo, apoptosi, e la degenerazione neuronale nell'ipotalamo, un importante regolatore di appetito e il dispendio energetico 3-7. Comprendere il meccanismo attraverso il quale l'esposizione dieta ricca di grassi induce disregolazione ipotalamo è quindi importante per lo sviluppo di trattamenti farmacologici per l'obesità. Tuttavia, i meccanismi cellulari attraverso i quali i grassi alimentari colpisce la funzione neuronale rimangono poco chiari. Una migliore comprensione di come grassi come PA potrebbero innescare insorgenza di vie apoptotiche ipotalamici è necessario un primo passo verso questo obiettivo. L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un saggio multiplex per la sperimentazione in vitro di risposta neuronale all'esposizione PA, sviluppato per l'uso in studi di hneurodegenerazione ypothalamic. Forniamo una descrizione dettagliata di un formato a 96 pozzetti test multiplex in vitro per la misurazione della caspasi 3/7 attività per numero totale di celle in una linea differenziata immortalato topo adulto ipotalamico cellulare (designato A12) dopo la sfida ossidativo con PA 8.
In breve, la vitalità cellulare è determinata a seguito PA sfida con un saggio resazurina based. Resazurin è un composto permeabile cella subisce una riduzione enzimatica in cellule metabolicamente attive, un processo pensato avvenga tramite mitocondri 9. Cellule vitali continuamente convertono resazurin a resorufina, producendo un segnale fluorescente proporzionale al numero di cellule vitali. L'attività della caspasi-3/7 viene poi analizzata utilizzando un saggio basato lumogenic-DEVD. DEVD è una sequenza amminoacidica (Asp-Glu-Val-Asp) spaccati da caspasi-3. Quando questa sequenza è accoppiato ad una sostanza lumogenic, previa attivazione di intracellulare caspasi-3/7 e successiva scissionedi substrato DEVD, il prodotto luminescente viene rilasciato. Questa reazione è proporzionale all'attività caspasi e quindi l'induzione di apoptosi. Poiché le cellule morte non possono produrre caspasi, caspasi-3/7 attività è per sua natura transitoria; pertanto, l'analisi deve essere completata tra 30 minuti e 4 ore post-sfida, a seconda dell'efficacia delle stressor cellulare. La vitalità cellulare è inversamente proporzionale all'attività caspasi-3/7 e può essere utilizzato per determinare meccanismi della morte cellulare. Ad esempio, questo metodo è già stata utilizzata per dimostrare che il pretrattamento con l'ormone peptidico orexina riduce l'apoptosi in cellule ipotalamiche stimolate con perossido di idrogeno, suggerendo che meccanismi interessate da questo trattamento sono importanti per proteggere dai danni ossidativi 10. È importante notare questi saggi sono linea-e cellule tessuto-dipendente, in quanto si basano su attività mitocondriale per ridurre i reagenti del saggio. Questo protocollo è stato ottimizzato per topo adulto ipotalamico (A12), le cellule; tuttavia,metodi descritti possono essere modificate per adattarsi nell'ambito di ricerche simili.
Multiplexing saggi di un'unica cultura fornisce anche un vantaggio rispetto al metodo tradizionale di eseguire dosaggi individuali per diversi motivi. Oltre al risparmio di tempo, campioni di cellule e reagenti cultura, saggi di multiplazione possono anche fornire conoscenze della sopravvivenza cellulare e morte, fornire controlli interni, ed eliminare la necessità di esperimenti ripetitivi 11, 12.
Metodi alternativi hanno invocato macchie o ELISA occidentali, che sono test affidabili, ma sono costosi e che richiede tempo (1-2 giorni), soprattutto quando si utilizza un formato a 96 pozzetti. Escludendo il tempo necessario per le cellule di coltura per il saggio multiplexing, il tempo totale è meno di 3 ore. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso con A12 cellule, può essere modificato per l'utilizzo in altri modelli tenendo a mente fattori che possono influenzare l'integrità delle cellule. Scoraggiareestrazione se questo protocollo funzionerebbe per una serie di esperimenti dipende dal numero di campioni o condizioni sperimentali e su esperimenti valle pianificati.
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Protocol
1. Placcatura e la conservazione della cultura cellulare
- Scaldano Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) terreni di coltura (DMEM + 10% FBS + 1% di penicillina / streptomicina / neomicina) a 37 ° C.
- Ottenere magazzino di surgelati A12 cellule da -80 ° C.
- Rapidamente scongelare le cellule in 37 ° C a bagnomaria; una volta scongelato, delicatamente le cellule pipetta di trasferire a un pallone di coltura ventilato 75 centimetri 2 e aggiungere 10 ml di coltura.
- Incubare pallone pernottamento in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C. Aspirare il terreno dopo 24 ore e sostituirlo con mezzi freschi. Continuare a crescere le cellule fino ad ottenere il 70-80% di confluenza (2-3 giorni di crescita).
2. Conteggio e placcatura Celle
- DMEM Caldo e soluzione 1x-tripsina-EDTA a 37 ° C.
- Aspirare supporti dalle cellule e lavare due volte con fosfato sterile salina tamponata (PBS).
- Aggiungere 500 microlitri di soluzione di tripsina e incubare a 37 ° C per 2-5 min.
- Distaccarecellule da matraccio con una spatola e sospendere le cellule in 5 ml di media. Passare cellule attraverso il filtro e passare attraverso il filtro delle cellule in una provetta pulita da 50 ml. Potrebbe essere necessario passare cellule attraverso il filtro più di una volta, ma non ripetere più di tre volte.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinare quantità di cellule di coltura per seminare 6.000 cellule / pozzetto in 96 pozzetti trasparente fondo nero o bianco piastra murato in un volume finale di 100 microlitri di media. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.
3. Determinare la vitalità delle cellule e caspasi-3/7 Attività
- Trasferire PA ad una sterile 5 ml fiala di vetro e solubilizzare in 100% dimetilsolfossido (DMSO). Diluire soluzione stock PA 1:10 in DMSO e aggiungerlo al preriscaldata DMEM per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 0.1 PA mm. Per i mezzi di controllo, aggiungere la stessa concentrazione di DMSO che viene aggiunto a supporti contenenti PA.
- Rimuovere il supporto in ciascun pozzetto e sostituire con 50 mezzi microlitri + / -PA. Incubare la piastra per 2 h in 5% CO 2 a 37 ° C. Aggiungere quindi 5 ml resazurina reagenti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Utilizzando un lettore di micropiastre multimodale, record di fluorescenza (560 EX / 590 EM) per misurare la vitalità cellulare. I risultati sono presentati come unità di fluorescenza relativa (RFU).
- Per la stessa piastra, aggiungere 55 ml di reagente caspasi e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Anche in questo caso utilizzando il lettore per micropiastre, record di luminescenza per misurare l'attività della caspasi-3/7. I risultati sono presentati come unità di luminescenza relativa (RLU), con luminescenza direttamente proporzionale alla caspasi-3/7 attività.
- Per normalizzare l'attività della caspasi-3/7 per il conteggio delle cellule, dividere vitalità cellulare (RFU) da caspasi-3/7 attività (RLU).
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Representative Results
Il protocollo sopra descritto comporta multiplazione due test separati per determinare meccanismi della morte cellulare. Figura 1 mostra una panoramica del protocollo per determinare la vitalità cellulare e caspasi-3/7 attività. Attività di caspasi era significativamente aumentata in cellule stimolate con PA dopo 2 ore di incubazione (Figura 2A e Tabella 1). Perdita di integrità della membrana cellulare è un cambiamento morfologico associata con l'induzione di apoptosi, che è evidente nelle cellule dopo 2 ore di esposizione a PA (Figura 2B). Figura 3 illustra i pathway potenziale in cui PA induce apoptosi e dimostra l'importanza di ottimizzare incubazione tempo nel reagente DEVD.
Figura 1. Disegno sperimentale per un saggio multiplexper determinare l'attività della caspasi-3/7. cellule vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti per 24 ore e poi incubate in presenza o assenza di PA. I tempi di incubazione in presenza di ogni reagente possono variare a seconda del modello. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Attività Figura 2. Caspasi-3/7 è aumentata seguente 2 hr PA sfida. Ipotalamici A12 cellule sono state trattate in presenza o assenza di PA 0,1 mM per 2 h. L'attività della caspasi-3/7 era significativamente aumentata in cellule trattate con PA (p <0.01). Integrità della membrana cellulare è visibilmente perso in presenza di PA. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita. 
Figura 3. Potenziale via di morte cellulare indotta PA. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
| Controllo | 0.1 PA mM | ||||
| Cellule vitali | Caspasi 3/7 | rapporto | Cellule vitali | Caspasi 3/7 | rapporto |
| Fluorescenza (560 EX / 590 EM) | Luminescenza 650 picco nm | Caspasi / cellule vitali | Fluorescenza (560 EX / 590 EM) | Luminescenza 650 picco nm | Caspase / vitali Cells |
| 1.951,8 | 45,488 | 0,023305667 | 808,78 | 16,731 | 0,020686713 |
| 1.647,0 | 46,011 | 0,027936248 | 788,84 | 22,080 | 0,027990467 |
| 1.911,0 | 34,508 | 0,018057561 | 777,68 | 28,234 | 0,036305421 |
| 1.792,5 | 14,183 | 0,007912413 | 807,45 | 20,457 | 0,025335315 |
| 1.965,7 | 19,868 | 0,010107341 | 829,14 | 17,777 | 0,021440288 |
| 1.803,0 | 20,229 | 0,011219634 | 742,35 | 29,280 | 0,039442312 |
| 1.804,8 | 27,188 | 0,015064273 | 761,77 | 17,777 | ,023336440 |
| 1.890,1 | 40,7825 | 0,021576901 | 756,66 | 20,914 | 0,027639891 |
Tabella 1. Esempio di dati raccolti e rapporti calcolati.
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Discussion
Il saggio multiplex è una tecnica ben accettato che è stato usato dagli scienziati in numerose applicazioni come PCR, microarrays immunodetezione e altri metodi di rilevamento a base di proteine 13, 14. Recentemente, saggi multiplexing sono diventati sempre più utilizzato in vitro esperimenti basati piatto-in e sono stati convalidati come un metodo accurato per valutare la citotossicità e la vitalità 12. Nel protocollo di cui sopra, abbiamo dimostrato l'efficacia di saggi fluorescenti e luminescenti multiplazione per determinare l'attività della caspasi-3/7 e vitalità cellulare in cellule A12 PA seguenti sfida. La vitalità cellulare è stata determinata in 10 min di insulto iniziale PA, consentendo una rappresentazione rapida ed affidabile di cellule vitali. Va notato che il reagente a base rezasurin-è un saggio di cellule in vivo che permette ulteriori endpoint da misurare; tuttavia, ottimizzando i tempi di incubazione per determinare l'attività della caspasi-3/7 è essential per ottenere risultati utilizzabili 15.
L'apoptosi può essere attivato da stimoli esterni, segnali cellulari interne, e recettori di superficie con conseguente eventi morfologici e biochimici distinti. Aumento della caspasi 3, frammentazione del DNA, la perdita dell'integrità della membrana cellulare, condensazione della cromatina, e poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) scissione sono alcuni specifici marcatori di apoptosi che possono essere studiati 16. L'attivazione della caspasi 3 e 7 sono modulatori primarie di apoptosi, che li rende marcatori essenziali per valutare in manipolazioni farmacologiche volte a ridurre i danni apoptotico 17. Le cellule in fase di apoptosi prolungato finiranno sottoposti necrosi secondaria, osservabile da lisi cellulare, sottolineando l'importanza della scelta di un lasso di tempo adeguato per determinare l'attività della caspasi-3/7 11. Come precedentemente accennato, la caspasi-3/7 attività è transitorio; Pertanto, a seconda dell'efficacia di stress cellulare, determinando the tempistica appropriata per saggiare l'attività delle caspasi può richiedere un certo sforzo. Inoltre, le principali limitazioni per il nostro protocollo multiplexing sono che l'attività della caspasi-3/7 può stabilire, ma non quantificato, e il lisato risultante non può essere utilizzata per i saggi a valle (cioè Western blot o espressione genica).
Comprendere caratteristiche del ciclo cellulare di modello scelto e come potrebbe rispondere agli stress designati nell'applicare questa tecnica è fondamentale per ottenere risultati validi. Ulteriori considerazioni quando si pianifica studi che valuteranno i percorsi apoptotici sono: 1) determinare la appropriata densità di cellule che sono seminate per bene; 2) la concentrazione e di incubazione della stressante o farmaco usato; e 3) il tempo di incubazione appropriato per i reagenti utilizzati in un saggio. La mancanza di standardizzazione o di studi preliminari che affrontano queste considerazioni generalmente tradurrà in dati errati. Il tempo e lo sforzo utilizzato per standardizzare °e multiplexing test che descriviamo qui fornisce una tecnica valida, affidabile e risparmio di tempo per gli studi apoptotici 10.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti da dichiarare.
Acknowledgments
Il lavoro qui descritto è stato finanziato dal US Department of Veterans Affairs Laboratorio Biomedico di Ricerca e Sviluppo BX001686-1A1 e VA Riabilitazione Ricerca e Sviluppo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
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