Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

doi: 10.3791/51305 Published: April 16, 2014

Summary

מבחני זמנית יכולים לספק מידע מועיל למנגנונים תאיים בסיסיים ולמנוע בזבוז של חומרים כימיים וניסויים חוזרים מיותרים. אנו מתארים כאן assay פעילות זמנית caspase-3/7, תוך שימוש בשיטות ניאון ומבוסס זורח, כדי לקבוע כדאיות תא במודל ההיפותלמוס במבחנה הבאה אתגר חמצוני עם חומצה פלמיטית.

Abstract

היכולת זמנית מבחני במחקרים של מנגנונים תאיים מורכבים מבטלת את הצורך בניסויים חוזרים ונשנים, מספקת בקרות פנימיות, ומצמצמת בזבוז בעלויות וחומרים כימיים. כאן אנו מתארים אופטימיזציה של assay זמנית להעריך אפופטוזיס הבאים חומצה פלמיטית אתגר (PA) במודל ההיפותלמוס במבחנה, באמצעות שני ניאון וזורח מבוסס מבחני כדי למדוד ספירת תאי קיימא וcaspase-3/7 פעילות ב96 היטב פורמט צלחת microtiter. בעקבות אתגר הרשות הפלסטינית, תאי קיימא נקבעו על ידי assay ניאון מבוסס resazurin. Caspase-3/7 פעילות הייתה אז נקבע באמצעות מצע luminogenic, DEVD, ומנורמל למספר סלולרי. assay הריבוב זוהי טכניקה שימושית לקביעת שינוי בפעילות caspase הבאה גירוי אפופטוטיים, כגון אתגר חומצת שומן רווי. חומצת השומן הרווי הרשות יכולה להגדיל את לחץ חמצוני ההיפותלמוס ואפופטוזיס, המציין את פוטנציאל importaNCE של מבחני כגון זה שתואר כאן בחקר הקשר בין חומצות שומן רוויות ותפקוד עצבי.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

דיאטות עשירות בחומצות שומן רוויות, כגון חומצה פלמיטית (PA) נמצאו קשורות להשמנת יתר ומחלות רקע אחרים, כוללים מחלת סוכרת 1, 2 לב וכלי דם. דיאטות שומן גבוהה יש גם הוכחו כדי להגדיל את לחץ חמצוני, אפופטוזיס, וניוון עצבי בהיפותלמוס, רגולטור חשוב של תיאבון והאנרגיה ההוצאה 3-7. הבנת המנגנון שבאמצעותו חשיפת דיאטת שומן גבוה גורמת לחוסר ויסות ההיפותלמוס כן ​​חשובה לפיתוח של טיפולים תרופתיים להשמנת יתר. עם זאת, המנגנונים התאיים שבאמצעותו שומן משפיע על תפקוד עצבי עדיין אינם ברורים. הבנה טובה יותר של איך שומנים כגון הרשות הפלסטינית עלולים לעורר התפרצות של מסלולים אפופטוטיים ההיפותלמוס היא צעד ראשון הכרחי לקראת מטרה זו. מטרת מאמר זה היא לתאר זמנית assay לבדיקות במבחנה של תגובה העצבית לחשיפה של הרשות הפלסטינית, שפותח עבור שימוש במחקרים של שעותניוון מוחיים ypothalamic. אנו מספקים תיאור מפורט של assay במבחנה 96 היטב תבנית זמנית למדידת caspase 3/7 פעילות למספר כולל של תאים בשורה מובחנת הונצחה עכבר המבוגר ההיפותלמוס תא (המיועדת A12) לאחר אתגר חמצוני עם הרשות הפלסטינית 8.

בקצרה, כדאיות תא נקבעת בעקבות אתגר הרשות הפלסטינית באמצעות assay resazurin מבוסס. Resazurin היא תרכובת חדירה תאים שעוברת הפחתה האנזימטית בתאים פעילים מטבולית, תהליך המחשבה להתרחש באמצעות המיטוכונדריה 9. תאי קיימא ברציפות להמיר resazurin לresorufin, הפקת אות ניאון פרופורציונלית למספר תאי קיימא. פעילות caspase-3/7 אז הוא ניתח באמצעות assay lumogenic מבוסס DEVD. DEVD הוא רצף חומצות אמינו (ASP-Glu-Val-ASP) ביקע ידי caspase-3. כאשר רצף זה הוא מצמידים את חומר lumogenic, עם הפעלה של caspase-3/7 תאיים ומחשוף שלאחר מכןשל מצע DEVD, המוצר זורח הוא שוחרר. תגובה זו היא מידתית לפעילות caspase ובכך לאינדוקציה של אפופטוזיס. ככל שתאים מתים לא יכולים לייצר caspase, caspase-3/7 פעילות היא על ידי חולף טבע; לכן ניתוח אמור להסתיים בין 30 דקות עד 4 שעות לאחר אתגר, תלוי באפקטיבי של לחץ בתא. כדאיות תא עומד ביחס הפוך לפעילות caspase-3/7 והוא יכול לשמש כדי לקבוע מנגנונים של מוות של תאים. לדוגמא, בשיטה זו יש בעבר נהגה להראות טיפול מקדים שעם הורמון פפטיד orexin מפחית אפופטוזיס בתאי ההיפותלמוס תיגר עם מי חמצן, מה שמרמז כי המנגנונים מושפעים מטיפול זה הם חשובים בהגנה מפני נזק חמצוני 10. חשוב לציין, מבחני אלה הם תא קו ורקמות תלויות, כפי שהם סומכים על פעילות המיטוכונדריה להפחית ריאגנטים assay. פרוטוקול זה כבר מותאם לההיפותלמוס עכבר בוגר (A12) תאים; עם זאת,שיטות שתוארו ניתן לשנות כדי שיתאימו למסגרת של מחקר דומה.

מבחני ריבוב מתרבות אחת גם מספק יתרון על פני השיטה המסורתית של ביצוע מבחני בודדים מכמה סיבות. בנוסף לחיסכון בזמן, דגימות תאים, וחומרים כימיים תרבות, מבחני ריבוב יכולים גם לספק ידע של הישרדות תא ומוות, מספקים בקרות פנימיות, ולבטל את הצורך בניסויים חוזרים ונשנים 11, 12.

שיטות אלטרנטיבי יש לסמוך על כתמים מערביים או ELISAs, שהם מבחני אמינים, אבל הם יקרים וזמן רב (1-2 ימים), במיוחד בעת שימוש בפורמט 96 היטב. לא כולל את הזמן שלוקח לתאי תרבות עבור assay הריבוב, הזמן הכולל הוא פחות מ -3 שעות. בעוד פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם A12 תאים, זה יכול להיות שונה לשימוש במודלים אחרים, תוך שמירה על בגורמים נפשי שעלולות להשפיע על שלמות תא. להרתיעכרייה אם פרוטוקול זה יעבוד עבור סדרה של ניסויים תלויה במספר דוגמאות או תנאי ניסוי ועל ניסויים במורד הזרם מתוכננים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ציפוי ותחזוקה של תרבית תאים

  1. תקשורת ותרבות הנשר בינוני השתנה Dulbecco החם (DMEM) (FBS +10% DMEM + 1% פניצילין / סטרפטומיצין / neomycin) 37 ° C.
  2. השג המניה של A12 תאים קפואים מ-80 ° C.
  3. במהירות להפשיר תאים ב37 אמבט מים מעלות צלזיוס; מופשר פעם אחת, בעדינות תאי פיפטה להעביר לבקבוק תרבות פרקה 75 2 ס"מ ולהוסיף 10 מיליליטר של תקשורת ותרבות.
  4. דגירה לילה בקבוק ב 5% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. תקשורת לשאוב לאחר 24 שעות ולהחליף עם תקשורת טרי. להמשיך ולצמוח תאים עד מפגש 70-80% מתקבל (צמיחת 2-3 ימים).

2. תאי ספירה וציפוי

  1. DMEM חם ופתרון 1x-טריפסין-EDTA 37 ° C.
  2. תקשורת לשאוב מהתאים ולשטוף פעמיים עם שנאגרו מלוח פוספט סטרילי (PBS).
  3. הוסף 500 μl של פתרון טריפסין ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
  4. לנתקתאים מבקבוק באמצעות מגרד ולהשעות תאים 5 מיליליטר של תקשורת. עובר תאים דרך מסננת ותעבור דרך מסננת תא לתוך צינור מיליליטר נקי 50. ייתכן שיצטרך לעבור תאים דרך מסננת יותר מפעם אחת, אבל לא חוזר יותר משלוש פעמים.
  5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע כמות תאים לתרבות לזרע 6,000 תאים / היטב בצלחת 96 היטב ברורה תחתונה שחורה או לבנה מוקפת חומה בנפח סופי של המדיה 100 μl. דגירה צלחת ב 5% CO 2 ב-C ° 37 ל24 שעות.

3. קביעת כדאיויות תא וcaspase-3/7 פעילות

  1. העבר את הרשות הפלסטינית לבקבוקון זכוכית 5 מיליליטר סטרילי וsolubilize ב100% sulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל פתרון הרשות הפלסטינית מניית 1:10 ב DMSO ולהוסיף אותו לprewarmed DMEM כדי להשיג ריכוז עבודה סופי של 0.1 מ"מ הרשות הפלסטינית. לבקרת מדיה, להוסיף אותו הריכוז של DMSO שמתווסף לתקשורת המכילה הרשות הפלסטינית.
  2. הסר את המדיה בכל טוב ולהחליף עם 50 תקשורת μl + / -הרשות הפלסטינית. דגירה את הצלחת לשעה 2 ב5% CO 2 ב 37 ° C. לאחר מכן להוסיף 5 מגיב resazurin μl ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. באמצעות קורא microplate אופניים, הקרינה שיא (560 EM EX / 590) כדי למדוד כדאיות תא. תוצאות מוצגות כיחידות יחסי הקרינה (RFU).
  4. לאותה הצלחת, להוסיף 55 μl של מגיב caspase ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
  5. שוב באמצעות קורא microplate, הארה שיא כדי למדוד את פעילות caspase-3/7. תוצאות מוצגות כיחידות יחסי הארה (RLU), עם הארה ביחס ישר לcaspase-3/7 פעילות.
  6. לנרמל את פעילות caspase-3/7 לספירת תאים, לחלק את תא הכדאיות (RFU) על ידי caspase-3/7 פעילות (RLU).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול לעיל מתאר את תוצאות בשני מבחני נפרדים הריבוב לקבוע מנגנונים של מוות של תאים. איור 1 מציגה סקירה כללית של הפרוטוקול כדי לקבוע כדאיות תא וcaspase-3/7 פעילות. פעילות caspase הייתה גדלה באופן משמעותי בתאי תיגר עם הרשות הפלסטינית לאחר 2 דגירה שעה (איור 2 א ולוח 1). אובדן שלמות קרום תא הוא שינוי המורפולוגי הקשורים לגרימת מות תאים מתוכנת, שבאה לידי ביטוי בתאים לאחר חשיפת 2 שעות לרשות פלסטינית (איור 2). איור 3 מתאר את מסלול הפוטנציאל שבו הרשות הפלסטינית גורמת למות תאים ומדגימה את החשיבות של אופטימיזציה של דגירה זמן במגיב DEVD.

איור 1
איור 1. עיצוב ניסיוני לassay זמניתכדי לקבוע פעילות caspase-3/7. תאים הם זורעים בצלחת 96 היטב ל24 שעות ולאחר מכן הודגרו בנוכחות או עדר של הרשות הפלסטינית. פעמים דגירה בנוכחות של כל אחד מגיב עשויות להשתנות תלוי בדגם. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
פעילות איור 2. caspase-3/7 הוא גדל בעקבות אתגר הרשות הפלסטינית שעה 2. טופלו A12 תאי ההיפותלמוס בנוכחותו או היעדריו של 0.1 מ"מ הרשות הפלסטינית במשך שעה 2. פעילות caspase-3/7 הייתה גדלה באופן משמעותי בתאים שטופלו עם הרשות הפלסטינית (p <0.01). שלמות קרום תא הולכת לאיבוד בעליל בנוכחות הרשות הפלסטינית. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 3
איור 3. מסלול אפשרי של מוות של תאים הנגרמים הרשות הפלסטינית. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

בקרה 0.1 מ"מ הרשות הפלסטינית
תאי קיימא Caspase 3/7 יחס תאי קיימא Caspase 3/7 יחס
הקרינה (560 EM EX / 590) הארה 650 שיא ננומטר Caspase / תאי קיימא הקרינה (560 EM EX / 590) הארה 650 שיא ננומטר Caspase / C קיימאאמות
1951.8 45.488 .023305667 808.78 16.731 .020686713
1647.0 46.011 .027936248 788.84 22.080 .027990467
1911.0 34.508 .018057561 777.68 28.234 .036305421
1792.5 14.183 .007912413 807.45 20.457 .025335315
1965.7 19.868 .010107341 829.14 17.777 .021440288
1803.0 20.229 .011219634 742.35 29.280 .039442312
1804.8 27.188 .015064273 761.77 17.777 .023336440
1890.1 40.7825 .021576901 756.66 20.914 .027639891

טבלת 1. דוגמא של הנתונים שנאספו ויחסים מחושבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זמנית assay הוא טכניקה מקובלת היטב כי כבר בשימוש על ידי מדענים במספר רבים של יישומים כגון microarrays PCR, immunodetection, ושיטות המבוססים על חלבונים אחרים זיהוי 13, 14. לאחרונה, מבחני ריבוב הפכו מנוצלים יותר ויותר בניסויים במבחנה המבוססת על צלחת ואומת כשיטת מדויקת להערכת cytotoxicity וכדאיות 12. בפרוטוקול לעיל, אנו מדגימים את היעילות של מבחני ניאון וזורח ריבוב לקבוע פעילות caspase-3/7 וכדאיויות תא בתאים A12 הבאים אתגר הרשות הפלסטינית. כדאיות תא נקבעו בתוך 10 דקות של עלבון רשות ראשוני, המאפשרות ייצוג מהיר ואמין של תאי קיימא. יש לציין שמגיב מבוסס rezasurin הוא assay תא חי המאפשר לנקודתי קצה נוספות כדי להימדד; עם זאת, אופטימיזציה של זמן דגירה כדי לקבוע פעילות caspase-3/7 היא essential כדי להשיג תוצאות שמישים 15.

אפופטוזיס יכול להיות מופעל על ידי גירויים חיצוניים, אותות תא פנימיים, וקולטנים פני השטח וכתוצאה מאירועים מורפולוגיים וביוכימיים שונים. עלה caspase 3 פעילות, פיצול ה-DNA, אובדן שלמות קרום תא, עיבוי הכרומטין, ופולי (ADP-ריבוז) מחשוף פולימראז (PARP) כמה סמנים ספציפיים של אפופטוזיס שיכול להיחקר 16. הפעלה של caspase 3 ו -7 הן מאפננים עיקריים של אפופטוזיס, שהופך אותם סמנים חיוניים כדי להעריך במניפולציות תרופתי שמטרתה צמצום נזק אפופטוטיים 17. תאים עוברים אפופטוזיס הממושך סופו של דבר יעברו נמק המשני, נצפים על ידי תמוגה תא, דבר המלמד על החשיבות של בחירת מסגרת זמן מתאימה כדי לקבוע פעילות caspase-3/7 11. כפי שהוזכר קודם לכן, caspase-3/7 פעילות היא זמנית; לכן, ה בהתאם ליעילותו של לחץ תא, קביעהעיתוי מתאים לדואר assay פעילות caspase יכול לקחת חלק במאמץ. בנוסף, המגבלות העיקריות לפרוטוקול הריבוב שלנו הן שפעילות caspase-3/7 יכולה נקבעה אך לא לכימות, וכתוצאה מכך לא lysate יכול לשמש למבחנים במורד הזרם (כלומר כתמים מערביים או ביטוי גנים).

הבנת מאפיינים של מחזור התא של המודל שנבחר ואיך הוא עשוי להגיב ללחצים שיועדו בעת יישום טכניקה זו היא קריטית כדי להשיג תוצאות תקפות. שיקולים נוספים בעת תכנון מחקרים שיעריכו את מסלולים אפופטוטיים הם: 1) קביעת הצפיפות המתאימה של תאים שהם זורעים בכל טוב; 2) ריכוז ודגירה של הלחץ או תרופה המשמש; וזמן הדגירה המתאים לחומרים הכימיים המשמשים בassay 3). חוסר סטנדרטיזציה או של מחקרים ראשוניים המתייחסים לשיקולים אלה יהיה בדרך כלל תוצאה של נתונים שגויים. הזמן והמאמץ המשמש לתקן הassay ריבוב דואר שאנו מתארים כאן מספק טכניקה חשובה, אמינה, ואת החיסכון בזמן ללימודים אפופטוטיים 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש הסופרים אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgments

העבודה המתוארת כאן מומנה על ידי משרד החוץ האמריקאי לענייני יוצאי צבא במעבדת המחקר ביו ופיתוח BX001686-1A1 ומחקר שיקום VA ופיתוח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2  Cellutions Biosystems Inc. CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Invitrogen 10313-039
Fetal Bovine Serum  PAA Labs A15-751
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15070-063
Palmitic Acid Sigma-Aldrich P0500
Dimethy Sulfoxide  Sigma-Aldrich D2650

PrestoBlue Cell Viability Reagent
Invitrogen A13262
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems Promega G8091
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile Thermo Fisher Scientific 165305
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
  2. Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
  3. Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
  4. Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
  5. Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
  6. Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
  7. Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
  8. Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
  9. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  10. Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
  11. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  12. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
  13. Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
  14. Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
  15. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  16. Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
  17. Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Butterick, T. A., Duffy, C. M., Lee, R. E., Billington, C. J., Kotz, C. M., Nixon, J. P. Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model. J. Vis. Exp. (86), e51305, doi:10.3791/51305 (2014).More

Butterick, T. A., Duffy, C. M., Lee, R. E., Billington, C. J., Kotz, C. M., Nixon, J. P. Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model. J. Vis. Exp. (86), e51305, doi:10.3791/51305 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter