Anvendelse av en Caspase Multiplexing-analysen fastslår apoptose i en celle hypothalamus Model

Summary

Multiplex analyser kan gi nyttige opplysninger for grunnleggende cellulære mekanismene og eliminere sløsing av reagenser og unødvendige gjentatte eksperimenter. Vi beskriver her en multipleks caspase-3/7 aktivitetsanalyse, ved hjelp av fluorescerende og luminescerende-baserte metoder for å bestemme celle-levedyktighet i en in vitro modell hypothalamus følgende oksidativ utfordring med palmitinsyre.

Abstract

Evnen til å multiplekse assays i studier av komplekse cellulære mekanismer eliminerer behovet for gjentatte forsøk, gir intern kontroll, og reduserer avfall i kostnader og reagenser. Her beskriver vi optimalisering av en multipleks-analyse for å vurdere apoptose etter en palmitinsyre (PA) felling i en in vitro modell hypothalamus, ved bruk av både fluorescerende og luminescerende baserte analyser for å måle levedyktige celletall og kaspase-3/7 aktivitet i en 96-brønns mikrotiter-plate-format. Etter PA utfordring, ble levedyktige celler bestemt ved en resazurin baserte fluorescerende assay. Caspase-3/7-aktivitet ble deretter bestemt ved hjelp av en luminogenic substrat, DEVD og normalisert til cellenummer. Denne multipleksing undersøkelsen er en nyttig teknikk for å bestemme endringen i kaspase-aktivitet etter en apoptotisk stimulus, så som mettede fettsyrer utfordring. Den mettede fettsyre PA kan øke hypothalamus oksidativt stress og apoptose, som indikerer den potensielle importance av metoder slik som den som er beskrevet her i å studere forholdet mellom mettede fettsyrer og neuronal funksjon.

Introduction

Diett rik på mettede fettsyrer, slik som palmitin-syre (PA) har vært knyttet til fedme og andre samtidige sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom og diabetes ^{1, 2.} Høyt fettinntak har også blitt vist å øke oksidativt stress, apoptose og neuronal degenerasjon i hypothalamus, en viktig regulator av appetitt og energiforbruk ^3-7. Forstå mekanisme som fettrik diett eksponering induserer hypothalamus feilregulering er derfor viktig for utvikling av farmakologisk behandling for fedme. Men de cellulære mekanismene som fett påvirker nervecellefunksjon fortsatt uklare. En bedre forståelse av hvordan fett som PA kan utløse utbruddet av hypothalamus apoptotic trasé er et nødvendig første skritt mot dette målet. Målet med denne artikkelen er å beskrive en multipleks assay for in vitro testing av neuronal respons til eksponering PA, utviklet for bruk i studier av hypothalamic neurodegeneration. Vi gir en detaljert beskrivelse av en in vitro 96-brønners format multipleks-analyse for måling av caspase 3/7-aktivitet pr totalt antall celler i en differensiert udødelig voksen mus hypothalamus cellelinje (betegnet A12) etter oksydativ utfordring med PA ^8..

I korthet blir cellenes levedyktighet bestemt etter utfordring PA via en resazurin baserte assay. Resazurin er en celle gjennomtrengelig stoff som gjennomgår enzymatisk reduksjon i metabolsk aktive celler, en fremgangsmåte tenkt skje via mitokondriene ^9.. Levedyktige celler kontinuerlig konvertere resazurin til resorufin, som produserer et fluorescerende signal proporsjonal med antallet levedyktige celler. Caspase-3/7-aktivitet blir deretter analysert ved hjelp av en DEVD-baserte lumogenic assay. DEVD er en aminosyre-sekvens (Asp-Glu-Val-Asp) spaltes av caspase-3. Når denne sekvens er koplet til en lumogenic substans, ved aktivering av intracellulære caspase-3/7 og etterfølgende spaltingav DEVD substrat, blir luminescerende produktet frigjøres. Denne reaksjon er proporsjonal med kaspase-aktivitet og dermed til induksjon av apoptose. Som døde celler ikke kan produsere caspase, er caspase-3/7 aktivitets av natur forbigående; Derfor analyse bør fullføres mellom 30 min til 4 timer post-utfordring, avhengig av effektiviteten til cellen stressfaktor. Celleviabilitet er omvendt proporsjonal med caspase-3/7-aktivitet og kan brukes til å bestemme mekanismene for celledød. For eksempel har denne metoden tidligere blitt brukt til å vise at forbehandling med peptid-hormonet orexin reduserer apoptose i hypothalamus-celler utfordret med hydrogenperoksid, noe som tyder på at mekanismer som påvirkes av denne behandling er viktig for å beskytte mot oksydativ skade ^10. Det er viktig å være oppmerksom på disse analysene er cellelinje-og vev-avhengig, slik at de er avhengige av mitokondriell aktivitet for å redusere analysereagensene. Denne protokollen er optimalisert for voksen mus hypothalamus (A12) celler; Menmetoder som er beskrevet kan bli endret for å passe innenfor omfanget av lignende undersøkelser.

Multiplexing assays fra en enkelt kultur vel gir en fordel i forhold til den tradisjonelle metode for å utføre individuelle analyser av flere grunner. I tillegg til å spare tid, celleprøver, og kultur reagenser, kan multipleksing assays også gi kunnskap om celle overlevelse og død, gir intern kontroll, og eliminerer behovet for gjentatte forsøk ^{11, 12.}

Alternative metoder har stolt på Western-blots eller ELISAs, som er pålitelige analyser, men er kostbare og tidkrevende (1-2 dager), spesielt ved bruk av en 96-brønns format. Unntatt den tiden det tar for å dyrke celler for multipleksing analysen, er den totale tid som er mindre enn 3 timer. Mens denne protokollen er optimalisert for bruk med A12 celler, kan det bli endret for bruk i andre modeller, men husk samtidig faktorer som kan påvirke celle integritet. Avskrekkegruvedrift hvis denne protokollen vil fungere for en serie eksperimenter er avhengig av antallet prøver eller eksperimentelle betingelser og på nedstrøms planlagte eksperimenter.

Protocol

En. Plating og vedlikehold av Cell Culture Varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kultur media (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / streptomycin / neomycin) til 37 ° C. Skaffe lager av frosne A12 celler fra -80 ° C. Raskt tine celler i 37 ° C vann-bad; Opptinte, forsiktig pipette celler til å overføre til en 75 cm 2 ventilert kultur kolbe og tilsett 10 ml kulturmedier. Inkuber kolbe over natten i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Sug media etter 24 timer …

Representative Results

Protokollen ovenfor beskriver resultatene i multipleksing to separate analyser for å bestemme mekanismene for celledød. Figur 1 viser en oversikt over den protokoll for å bestemme cellenes levedyktighet og kaspase-3/7-aktivitet. Caspase-aktivitet ble signifikant økt i cellene utfordret med PA etter 2 timers inkubasjon (figur 2A og tabell 1). Tap av cellemembranintegritet er en morfologisk endring assosiert med induksjon av apoptose, som er tydelig i celler etter 2 t…

Discussion

Den multiplex-analysen er et godt akseptert teknikk som har blitt brukt av forskere i en rekke applikasjoner som PCR-mikromatriser, immunodeteksjonsprosedyren og andre protein-baserte deteksjonsmetoder ^{13, 14.} Nylig har multipleksing analyser blitt stadig mer brukt i in vitro-plate-baserte forsøk og har blitt validert som en nøyaktig metode for å vurdere cytotoksisitet og levedyktighet ^12. I den ovennevnte protokoll har vi demonstrere effektiviteten av multipleksing fluorescere…

Materials

Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	10313-039
Fetal bovine serum	PAA Labs	A15-751
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	P0500
Dimethy sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13262
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems	Promega	G8091
Equipment
96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile	Thermo Fisher Scientific	165305
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate	Molecular Devices