Summary
Tredimensionelle kultur af brystepitelceller celler på en rekonstitueret basalmembran er en nyttig metode til at rekapitulere in vivo arkitektur godartet bryst, og for at differentiere den maligne fænotype fra godartede bryst fænotype. Vigtigere er det, kan dette system anvendes til at studere invasive carcinomer i andre væv.
Abstract
Invasive brystcarcinomer er en gruppe af ondartede epitheltumorer kendetegnet ved invasion af tilstødende væv og tilbøjelighed til at metastaserer. Samspillet af signaler mellem kræftceller og deres mikromiljø udøver en stærk indflydelse på brystkræft vækst og biologisk adfærd 1.. Men de fleste af disse signaler fra den ekstracellulære matrix er tabt eller deres relevans understudied når celler dyrkes i todimensional kultur (2D) som et monolag. I de senere år har tredimensional (3D) kultur på en rekonstitueret basalmembran dukket op som en metode til valg at rekapitulere vævsarkitekturen af godartede og ondartede brystceller. Celler dyrket i 3D bevarer de vigtige signaler fra den ekstracellulære matrix og giver en fysiologisk relevant ex vivo systemet 2,3. Af note, er der voksende beviser for, at cellerne opfører sig anderledes, når de dyrkes i 3D i forhold til 2D 4.. 3D kultureffektivt kan bruges som et middel til at differentiere den maligne fænotype fra godartede bryst fænotype og for at understøtte den cellulære og molekylære signalering involveret 3. Et af de særlige karakteristika af godartede epitelceller er, at de er polariseret, så den apikale cytoplasma mod lumen og den basale cytoplasma hviler på basalmembranen. Denne apico-basal polaritet er tabt i invasive brystcarcinomaer, der er karakteriseret ved cellulær forvaltningsmæssigt og dannelse af anastomoserende og forgrening tubuli, der på bedste beskub infiltrerer omgivende stroma. Kan reproduceres Disse histopatologiske forskelle mellem godartede kirtel og invasiv karcinom i 3D 6,7. Brug passende udlæsning som kvantificering af enkelt runde acinare strukturer eller differential ekspression af validerede molekylære markører for celleproliferation, polaritet og apoptose i kombination med andre molekylær-og cellebiologi teknikker, 3D kultue kan give et vigtigt redskab til bedre at forstå de cellulære forandringer under malign transformation og til afgrænsning af den ansvarlige signalering.
Introduction
Tredimensionelle kultur (3D) af bryst epitelceller på rekonstitueret basalmembran er en vigtig model til undersøgelse af komplekse fænotype og signalering af normalt bryst og brystkræft 2,3. Den funktionelle enhed af brystkræft er den terminale kanal luftrør enhed (TDLU), der består af en lille kanal, som forgrener sig acini. De acini er meget organiserede strukturer, der består af to cellelag, epitelceller og myoepitelcellerne, som er omgivet af en basalmembran 5. Det mest karakteristiske træk ved normale acini er cellulær polarisering, tilknytning til den underliggende basalmembran og specialiserede celle-celle-kontakter. Denne indviklede organisation er forstyrret i invasive karcinomer. De udbredte 2D kulturer, hvor cellerne dyrkes som monolag, ikke mulighed for dannelse af acini. Således er monolagskultur mangler i at tilvejebringe et system til at fange de indviklede forhold mellem epitelcelleri normal bryst og deres deregulering i brystkræft. Funktionelle monotypic epitelial kulturer af bryst celler er blevet udviklet i flere laboratorier 2,3. 3D kultur involverer væksten af bryst celler på Matrigel, som er en solubiliseret ekstrakt afledt fra Engelbreth-Holm-Swarm muse sarkomceller og er kommercielt tilgængelige. Andre 3D-substrater såsom kollagen I anvendes også. De bryst celler kan dyrkes i 3D af 3D indlejret assay, hvor cellerne dyrkes indlejret i Matrigel 2. Alternativt kan celler dyrkes ved 3D oven assay, også kaldet 3D overlay assay, som er omkostningseffektiv, da det kræver mindre volumen Matrigel og letter tidsforskydningen overvågning af kolonidannelse med fasekontrast billeddannelse og er ideel til in situ billeddannelse 2 -3. 3D oven assay er blevet anvendt til at definere sammenhængen mellem acinar fænotype og genekspressionsprofilen 7.
3D kultur kan virkningsfuldely bruges til at skelne normale og godartede celler fra invasive karcinom. Normal og godartede bryst celler danner vækst anholdt polariserede strukturer med en veldefineret lumen i centrum på Matrigel hvorimod invasive karcinom celler vokser frodigt og på bedste beskub med nogen rydning af lumen. E6/E7 udødeliggjort menneskelige brystkirtler epitelceller og MCF10A cellelinie, hvilket er et spontant udødeliggjort cellelinie isoleret fra en 36 år gammel patient med fibrocystisk ændringer, med succes er blevet brugt til at generobre godartet bryst fænotype i 3D 3,8 og har tjent som et modelsystem til at studere det onkogene og tumor suppressor funktion af flere molekyler 8,9. Disse godartede celler kan manipuleret til at manipulere genet (r) af interesse ved indførelsen af lentivirus / retrovirus. Hvis genet (r) af interesse er en tumor suppressor vil shRNA medieret knockdown føre til en malign transformation hvorimod hvis genet af interesse er et onkogen overekspression i godartede cellerskal vise en malign fænotype. I begge tilfælde acinar strukturer dannet i 3D kan fange den maligne transformation.
Godartede enkelte celler udpladet i 3D begynder at formere sig og danne runde sfæriske strukturer. Ved dag 5-8 denne sfærisk aggregat af celler vil differentiere til en omkreds polariseret lag af celler, der er i kontakt med Matrigel, og en indre masse på mindre polariserede celler, som mangler kontakt med Matrigel. I de næste 10-15 dage de indre celler begynder at dø ved apoptose danner en klar lumen. De maligne celler vil vokse på bedste beskub at miste deres polaritet. Stærkt maligne celler sædvanligvis forgrening strukturer. Disse forskelle i fænotype kan opfanges af tidsforskydningen fasekontrast billeddannelse og ved in situ immunfarvning med relevante molekylære markører. De mest almindeligt anvendte markører er alfa 6-integrinet basal polaritet markering, i kombination med spredning markør phospho-histon 3 og apoptotic markør spaltet caspase-3. Sidstnævnte er vigtigt at afgøre, om der er lumen dannelse i midten af acini, en funktion af normale og godartede bryst celler. Andre polaritet og celle-celle kontakt markører omfatter GM130, laminin, ERM, E-cadherin. Alternativt brystkræft cellelinier kan manipuleres til at manipulere genet af interesse. I dette tilfælde tilbagevenden til en mere vækst standset godartet fænotype kan anvendes som en udlæsning at skelne fra kræft fænotype.
3D kultur kan også omhyggeligt bruges til at afgrænse de signalveje, der er involveret i malign transformation 10-11. Ved hjælp af ovennævnte udlæsninger, farmakologiske hæmmere, blokerende antistoffer eller rekombinante proteiner kan bruges kan lokalisere på det molekylære signalering fører til malign transformation. Med fortsatte bestræbelser fra forskellige laboratorier, er det muligt at udvinde cellerne fra 3D til at isolere RNA og også forberede lysates for immunoblotting og immunologiskenoprecipitation. Disse strategier er beskrevet i en trinvis og detaljeret måde i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af materiale og Kultur Medier
- Thaw vækstfaktor reduceret (GFR) Matrigel ved 4 ° CO / N.
- Varm op komplette medier for påkrævet cellelinje ved 37 ° C. MCF10A-ATCC angivne medier; HME-Hams F-12-medium suppleret med 5% føtalt bovint serum, 1 ug / ml hydrocortison, 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml epidermal vækstfaktor og 100 ng / ml koleratoksin; SUM149-Hams F-12 medier suppleret med 5% FBS, 2 ug / ml hydrocortison og 5 ug / ml insulin; og MDA-MB-231 til 10% FBS-DMEM
- Forkøling en 8-godt kammer slide på is.
- Forbered vævskultur hætte og forsyninger.
2.. Tre Dimensional Kultur i 8-godt Chamber Slide
- Coat hver brønd i 8-brønds objektglas med 40 pi af GFR Matrigel. Tilsæt Matrigel i midten af diaset og derefter spredt ved hjælp af en P200 pipettespids. Forsøger at spredes så jævnt som muligt, og at bobler og overspreading hvilket kan føre tilmenisk formation.
- Glassene inkuberes ved 37 ° C under 5% CO2. Mens Matrigel er størkne, Trypsinisér cellerne, indsamle og spin ved 150 xg i vævskultur centrifuge i 4 min.
- Tæl cellerne og fortyndes til 12.500 celler / ml i komplette medier i de respektive cellelinje. Læg GFR Matrigel til 2%, og der tilsættes 400 pi til hver brønd i en Matrigel præcoatede kammer slide.
- Glassene inkuberes i CO 2 inkubator. Giv friske komplette medieændringer hver 4. dag indtil 15 dage.
- Behandling med farmakologiske hæmmere: For inhibitor studier tilføje småmolekyleinhibitorer til den fuldstændige medier på tidspunktet for plettering efterfulgt af friske medieændringer suppleret med inhibitorer hver tre dage samtidig vokser cellerne på GFR Matrigel.
- Behandling med oprenset protein:
- Plate cellerne efter trin 2,1-2,3. Lad kulturerne til at vokse i 4 dage efterfulgt af serum starvatipå i 16 timer.
- På dag 5, behandling af cellerne med passende koncentration af oprenset protein i 0,1% FBS suppleret medier til serum udsultede celler. Giv frisk medier forandring med renset protein efter 2 dage.
- På dag 10 erstatter de konditionerede medier med komplet HME medier. Lad kulturerne til at vokse i yderligere 5 dage.
- Immunofluorescens-farvning af acinære strukturer dyrkes på Matrigel:
- Forbered 2% paraformaldehyd, 0,5% Triton X-100 og 100 mM glycin i 1X PBS, pH 7,4. Forbered immunofluorescens puffer (IF-buffer), som består af 1x PBS indeholdende 0,1% bovint serumalbumin, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20.
- Brug en P200 pipettespids til omhyggeligt at aspirere konditionerede medier.
- Fastgør acinære strukturer med 2% frisklavet paraformaldehyd ved stuetemperatur (RT) i 20 min.
- Permeabilisere cellerne med 0,5% Triton X-100 i 10 minutter ved 4 ° C.
- Vask kulturs tre gange med 100 mM glycin, 10-15 min for hver vask.
- Bloker af cellerne med 10% gedeserum i IF-buffer, som kaldes primær blok, i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuberes kulturerne med en 20 ug / ml gede anti-muse-F (ab ') 2-fragment i den primære blok-buffer i 30 minutter. Dette trin er vigtigt at blokere immunreaktive mus IgG arter Matrigel.
- Inkuberes med primært antistof i den anden blokerende opløsning (Primary blok 20 ug / ml gede-anti-muse-F (ab ') 2-fragment) O / N ved 4 ° C.
- Der vaskes tre gange med IF-buffer i 10-15 min hver med blide vuggende.
- Inkuberes med fluorescerende konjugerede sekundære antistoffer i IF-buffer i 45 min.
- Wash 3x 10 min hver med IF-buffer med blide vuggende.
- Monter dias med anti-fade reagens indeholdende DAPI at visualisere cellekerner.
- Lad objektglassene tørre O / N ved RT.
- Billede erhvervelse: Anskaf konfokal billeder på kolonien midsection af celler dyrket oven på Matrigel. For mere information erhverve en serie af optiske sektioner i hele længden af acinært struktur ved Z stabling.
3.. Tre Dimensional Kultur i 2-godt Chamber Slides for Immunoblotting
- Forkøling en 2-godt kammer slide på is. Følg trin 2,1-2,4 opskalering reagenserne til 2-brønds kammer slide f.eks frakke med 160 pi Matrigel, og der tilsættes 1,6 ml celler / Matrigel blandes til hver brønd i 2 brønde slide.
- Høste acinære strukturer fra Matrigel ved hjælp af kommercielt tilgængelige 3D kultur cellehøst kit ifølge producentens anvisninger.
- Fortynde cellevask og cellehøst buffere til 1x og forkøling til 4 ° C. Vask og løsner Matrigel bør udføres på is.
- Vask acinære strukturer 3x hjælp cellen vaskebuffer.
- Saml acini i 15 ml centrifugerør hjælp cellehøst buffer efterfulgt af 30 min inkubation på en rocker ved 4 ° C. Bland suspensionen godt med en 1 ml pipette. Dette vil bryde Matrigel i små stykker og frigive de fleste af cellerne i cellehøst buffer.
- Pelletere cellerne ved 200 x g i en kultur centrifuge. Tag den flydende lag af hydrogel fra de pelleterede celler med et P200 pipettespids.
- Resuspender lysaterne i SDS-prøvebuffer, der følger med kittet. RIPA lysis buffer kan anvendes.
4.. Kvantificering af malignt vs Benign Breast Fænotype
- Grow celler i tre eksemplarer for hver behandling sæt følge trin 2,1-2,4.
- Tag fasekontrast billeder af acinære strukturer fra hver brønd på 5X eller 10X opløsning ved hjælp af et fasekontrastmikroskop fastgjort til en Skifteren og en computer. Tag billederne ved at flytte dias fra en ramme til en anden, og dermed dækker hele godt af kamre dias.
- Tæl det samlede antal acinare strukturerantallet af enkelt rund flad acini og antallet af multiacinar strukturer eller tilfældigt voksende strukturer mangler organisation og branching processer stammer fra det.
- Procentdelen af enkelt runde flad acinare strukturer vs maligne strukturer og plot som kolonne graf. Beregn betydningen af Students t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D kultur effektivt kan bruges til at skelne maligne fænotype af humane bryst epitelceller fra godartede bryst. Enkelte godartede celler udpladet på Matrigel vokse som organiserede sfæriske strukturer, der nemt kan afbildes som enkelt runde flad acini i et plan ved hjælp af fasekontrast billeddannelse. De enkelte maligne celler udpladet på Matrigel vokse tilfældigt, viser meget højt brydningsindeks og er vanskelige at billedet i et plan. Som vist i figur 1, godartet HME MCF10A celler danner sfæriske søger acini mens stærkt metastatiske bryst cellelinier SUM149 og MDA-MB-231 vokse som forgrening rørformede strukturer med processer, der udgår fra dem. En sådan afvigelse fra godartede fænotype kan anvendes som en udlæsning for at bekræfte malign transformation og kan bruges til at definere funktionen af et molekyle som en tumor suppressor eller som en tumor promotor. Som vist i figur 2 knockdown (KD) af tumorsuppressorgen CCN6 triggere en malign transformation. HME celler manipuleret til at have nedreguleret niveauer af CCN6 ved lentivirus medieret transfektion miste deres organisation fra meget tidligt. På dag 5 godartet kontrol cellerne voksede som perfekte sfæriske strukturer mens CCN6 KD celler viser en uorganiseret fænotype. Ved dag 15 godartet kontrol celler bliver vækst arresteret og viser en polariseret lag af celler, der omgiver en veldefinerede centrale lumen mens KD celler vokser frodigst at danne uorganiserede store rørformede strukturer, som fortsætter med at vokse, hvis tilladt (figur 2).
Adskillige molekylære markører kan med fordel anvendes til at skelne mellem godartede vs maligne bryst fænotype. Den godartet bryst viser en differentieret vækst anholdt fænotype ved dag 15 i 3D kultur. De acini har en aflejring af basalmembran, der kan visualiseres ved immunfarvning med laminin V, som er tydeligt vist i kontrolceller i figur 3 (Figur 3).
De signalveje, der er involveret i den maligne transformation kan afgrænses ved hjælp af en kombination af farmakologiske hæmmere og oprenset rekombinant human (rh) proteiner. Som vist i figur 4 er malignant fænotype af CCN6 KD HME celler kan gendannes til enkelt runde acinare strukturer ved eksogen behandling med rhCCN6 protein. Konfokal billedbehandling på den midterste del af DAPI farvede acinar strukturer viser tydeligt polariseret acini med centrale lumen i CCN6 KD celler behandlet med rhCCN6. Tilsvarende invasiv SUM149 og MDA-MB-231-celler behandlet med P38 MAP-kinase-inhibitor viser reduktionen i den maligne fænotype (figur 5A). Reversion til en godartet lignende fænotype kan kvantificeres ved at beregne procentdelen af enkelt runde acinære strukturer i forhold til de maligne strukturer. Specificiteten af inhibitorer kan blive værdsat af det faktum, at AKT-hæmmere ikke viser nogen effekt på CCN6 KD celler, mens behandling med MAP kinase inhibitor PD98059 viser en bemærkelsesværdig tilbagevenden til enkelt runde acinare strukturer (figur 5B).
Figur 1. Fasekontrast billeder af benign versus maligne bryst celler dyrket på Matrigel i 10 dage. De godartede udødeliggjorte humane mammae epitelceller (HME) og spontant immortaliserede MCF10A celler vokser som enkelt runde flade acini blottet for eventuelle fremspring. Mens de maligne humane bryst-cellelinjer SUM149 og MDA-MB-231 vokse så meget uorganiseret strukturer. Målestokken repræsenterer 100 um. Klik her for at se større billede.
Figur 2.. Konfokal billeddannelse af HME-kontrol og CCN6 KD celler dyrket på Matrigel
Figur 3.. Confocal imaging viser differentieret ekspression af molekylære markører i Benign vs maligne bryst celler. CCN6 KD HME celler viser tab af laminin V, der repræsenterer afbrydelse af basalmembranen, tab af basal polaritet markør alpha-6-integrin, hvilket indikerer tab af polaritet og tab af celle-celle kontakt markør E-cadherin . Men kontrol cellerne viser aflejring af basalmembran (en intakt laminin lag omkring acini) basal ekspression af alpha 6 integrin apikale ekspression af GM130 og tilstedeværelse af E-cadherin på celle-celle krydset. Målestokken repræsenterer 50 um. Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Tilbageførsel af den maligne fænotype af CCN6 KD HME celler ved eksogen behandling med oprenset rekombinant humant CCN6 protein. CCN6 KD celler vokser så tilfældig, invasive acinare strukturer i 3D kultur. Men CCN6 KD-celler behandlet med 500 ng / ml rhCCN6 viser reversion til enkelt runde acinar fænotype med clearing lumen, hvilket indikerer en mere godartet lignende fænotype. Sort Målestokken repræsenterer 100 um og gul skala bar udgør 50 mM. Klik her for at se større billede.
Fig. 5. Behandling med småmolekyleinhibitorer vende den maligne fænotype til mindre ondartede eller godartede lignende fænotype. A. Behandling af 2 meget metastatisk brystkræft cellelinier SUM149 og MDA-MB-231 med P38 MAP kinase hæmmere SB203850 (5 uM) og SB202190 (10 uM) reducerer deresondartet adfærd som er afspejlet i den enkelt runde acinært fænotype på 3D. B. CCN6 KD HME celler behandlet med AKT-hæmmere LY294002 (7,5 uM), Wortamannin (2 nM) viser ingen effekt, men behandling med MAP kinase inhibitor PD98059 (10 uM) vender fænotype til enkelt runde organiseret acinar strukturer. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet her den tredimensionelle kultur bryst epitelceller på en rekonstitueret basalmembran og nytten af dette system til at skelne mellem ondartet vs godartet bryst fænotype. Dette system kan også anvendes til dyrkning af forskellige celletyper fra andre glandulær væv og er blevet rapporteret at være blevet anvendt med succes til kultur prostata epitel, bronkial epitel, og thyroide epitelceller, for at nævne et par 12-14. Betydningen af 3D kultur ligger i det faktum, at det er en fysiologisk relevant model. 3D kultur giver mulighed for at få indsigt i de molekylære mekanismer, der fører til afbrydelse af kirtel arkitektur under malign transformation. Det giver også en arbejdsmodel, der kan være nyttige i screening nye terapeutiske mål for behandling af kræftsygdomme. Mange lægemidler, der er fundet at være effektiv i 2D kultur ofte har ringe effekt i eksperimentel og klinisk applictaions 15. Som sådan 3D kultur kan give et vigtigt præklinisk redskab til at forudsige virkningen af forbindelser in vivo.
3D kultur er en udfordrende teknik og bør udføres omhyggeligt. GFR Matrigel er den mest almindeligt anvendte substrater til dyrkning af celler i 3D. Det kan optøs ved 4 ° CO / N alikvoter og frosset ved -20 ° C til fremtidig brug. Gentagne fryse og optøning bør undgås. GFR Matrigel er flydende ved 4 ° C, men størkner ved 37 ° C og kan være yderst vanskeligt at håndtere, når skiftende konditionerede medier med frisk medie eller under behandling af celler til immuncytokemi. Undlad venligst at bruge et vakuum sug til at fjerne de konditionerede medier, som det uvægerligt fører til tab af hele acinare kulturer sammen med Matrigel. Det bemærkes, at i tilfælde af nogle aggressive cancercellelinier som MDA-MB-231-celler, der danner meget forgrening netværk strukturer Matrigel kan løsne sig fra suransigt og er ofte gange flydende. Der bør udvises omhu for at suge medier ud af disse kulturer ellers vil de blive tabt, mens du tager mediet.
Lige så vigtigt er pleje og passage af celler, der vokser som monolagskulturer især for godartede celler som HME og MCF10A. Over sammenløb eller afvigelse fra den foreskrevne medier kan påvirke acinært dannelse i 3D.
Det er muligt at isolere celler fra 3D-kulturer til at behandle for RNA eller protein isolation under anvendelse af kommercielt tilgængelige 3D kultur cellehøst kit. Skiftevis tre-dimensionelle kulturer direkte kan lyseres ved hjælp af vaskemiddel baseret-lysisbuffer såsom RIPA-buffer (1% Nonidet P-40, 0,2% SDS, 0,5% natriumdeoxycholat, 150 mM natriumchlorid, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM natriumfluorid, 1 mM natriumorthovanadat, 10 mM b-glycerophosphat, 5 ug / ml apoprotinin, 5 ug / ml leupeptin og 100 uM phenylmethylsulfonylfluorid). Men protein kvantifikation er ikke muligt i dette tilfælde på grund af protein overflod i Matrigel. Således proteinlysater skal normaliseres kolorimetriske assays anvendes til at måle aktiviteten af stabile cytosoliske enzymer, såsom lactose-dehydrogenase (LDH) og blots bør testet igen for en husholdning gen som actin eller tubulin eller GAPDH 3.
Men cellehøst fra Matrigel kræver langvarig inkubation ved 4 ° C. Dette kan påvirke ekspressionen profil af celleoverfladeproteiner og som sådan in situ-immunfarvning er en mere hensigtsmæssig metode til at analysere ekspressionen af celleoverfladeproteiner. For immunfarvning antistof inkubation på en blid rocker er nyttigt i jævnt farvning acini men optimal hastighed og rocker slags er kritisk, da det også kan føre til løsnen af Matrigel. Antistofkoncentrationen muligvis optimering, men de fleste antistoffer blev fundet at være effektive til 1:100 koncentration. En more specifik liste af antistoffer er fastsat i tabellen. En detaljeret liste over antistoffer med deres specifikationer kan findes i Debnath et al. Kan 2 Samtidig inkubation med mere end én primær antistof opnået fra forskellige dyr som rotter, kaniner og mus skal udføres, men skal optimeres i første omgang at udelukke enhver krydsreaktivitet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH R01 CA107469, R01 CA125577 og U01CA154224 til CG Kleer, University of Michigan Cancer Center Support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
- Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
- Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
- Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
- Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
- Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).
