Summary
Três cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída é um método útil para recapitular a arquitectura in vivo da mama benigna, e para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo da mama benigna. Importante, este sistema pode ser aplicado para estudar os carcinomas invasivos em outros tecidos.
Abstract
Carcinomas da mama invasivos são um grupo de tumores epiteliais malignos caracterizada pela invasão de tecidos adjacentes e propensão para metástase. A interação de sinais entre as células cancerosas e seu microambiente exerce uma poderosa influência sobre o crescimento do câncer de mama e comportamento biológico 1. No entanto, a maioria destes sinais a partir da matriz extracelular são perdidas ou a sua relevância é subinvestigada quando as células são cultivadas em cultura de duas dimensões (2D) como uma monocamada. Nos últimos anos, a cultura tridimensional (3D) com uma membrana basal reconstituída tem surgido como um método de escolha para recapitular a arquitectura dos tecidos de células mamárias benignas e malignas. As células cultivadas em 3D reter as pistas importantes da matriz extracelular e fornecem um sistema ex vivo 2,3 fisiologicamente relevante. De notar que há cada vez mais evidências sugerindo que as células se comportam de forma diferente quando cultivada em 3D, em comparação com 4 2D. Cultura 3Dpode ser eficazmente utilizada como um meio para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo benigna da mama e para cimentar a sinalização celular e molecular envolvida 3. Uma das características distintas de células epiteliais benignas é que eles são polarizados de modo a que o citoplasma é apical para o lúmen e o citoplasma basal repousa sobre a membrana basal. Esta polaridade apico-basal é perdida em carcinomas invasivos da mama, que são caracterizadas por desorganização celular e formação da anastomose e ramificação túbulos que esmo infiltrados do estroma circundante. Estas diferenças histopatológicas entre glândula benigna e carcinoma invasivo pode ser reproduzido em 6,7 3D. Usando os Read-outs apropriadas como a quantificação de estruturas individuais acinares redondos, ou a expressão diferencial de marcadores moleculares validados para a proliferação celular, a polaridade e a apoptose, em combinação com outras técnicas de biologia molecular e celular, cultur 3De pode fornecer uma ferramenta importante para compreender melhor as alterações celulares durante a transformação maligna e para delinear a sinalização responsável.
Introduction
Cultura tridimensional (3D) de células epiteliais de mama na membrana basal reconstituída é um importante sistema modelo para estudar o fenótipo complexo e sinalização associada da mama normal e câncer de mama 2,3. A unidade funcional de mama lobular é a unidade terminal de conduta (TDLU) que consiste de uma pequena conduta que se ramifica em ácinos. Os ácinos são estruturas altamente organizadas, compostas por duas camadas de células, células epiteliais e mioepiteliais, que estão rodeados por uma membrana basal 5. As características mais distintivas de ácinos normais são polarização celular, o apego à membrana basal subjacente e contatos célula-célula especializados. Essa organização complexa é interrompido em carcinomas invasivos. As culturas 2D amplamente utilizados, em que as células são crescidas como monocamadas, não permitem a formação de ácinos. Assim, a cultura em monocamada é falta de fornecimento de um sistema para capturar a intrincada relação entre as células epiteliaisem mama normal e sua desregulamentação em câncer de mama. Culturas epiteliais monotípicas funcionais de células da mama foram desenvolvidas em vários laboratórios de 2,3. Cultura 3D envolve o crescimento de células da mama em Matrigel, que é um extracto solubilizado derivado de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratinho e está disponível comercialmente. Outros substratos 3D como o colágeno também são usados. As células da mama podem ser cultivadas em 3D pelo ensaio incorporado 3D, em que as células são cultivadas incorporado em Matrigel 2. Alternativamente, as células podem ser cultivadas por 3D em cima ensaio, também chamado de teste de sobreposição 3D, que é rentável, pois requer menor volume de Matrigel, e facilita o monitoramento do lapso de tempo de formação de colônias por imagem de contraste de fase e é ideal para imagens em situ 2 -3. O 3D no topo ensaio tem sido utilizado para definir a correlação entre o fenótipo acinar e do perfil de expressão do gene 7.
Cultura 3D pode ser effectively usado para distinguir células normais e benignos do carcinoma invasivo. Células mamárias normais e benignos formar crescimento preso estruturas polarizadas com um lúmen bem definidas no centro em Matrigel enquanto que as células de carcinoma invasivo crescer prolífica e ao acaso, sem compensação da luz. E6/E7 imortalizada de células epiteliais mamárias humanas e uma linha celular MCF10A, que é uma linha celular imortalizada espontaneamente, isolado a partir de uma paciente de 36 anos de idade com alterações fibrocística, têm sido utilizados com sucesso para recuperar o fenótipo benigna da mama em 3D 3,8 e serviram um sistema-modelo para estudar a função supressora de tumores oncogénicos e de várias moléculas de 8,9. Estas células benignas podem ser modificados para manipular a gene (s) de interesse com a introdução de lentivírus / retrovírus. Se o gene (s) de interesse é um supressor de tumor, knockdown shRNA mediada conduzirá a uma transformação maligna que, quando o gene de interesse é uma sobre-expressão de oncogenes em células benignasdeve mostrar um fenótipo maligno. Em ambos os casos, as estruturas acinares formados em 3D pode captar a transformação maligna.
Células individuais benignos banhado em 3D começam a proliferar e formar rodada estruturas esféricas. Por dia 5-8 agregado esférico de células irá diferenciar em uma camada circundante de células polarizadas que está em contacto com o Matrigel e uma massa interna de células polarizadas menos, que carecem de contacto com o Matrigel. Nos próximos 10-15 dias, as células interiores vão começar a morrer por apoptose formando um lúmen claro. As células malignas vai crescer desordenadamente perder sua polaridade. Células altamente malignas geralmente formar estruturas de ramificação. Estas diferenças no fenótipo pode ser capturada por tempo fase lapso de imagem contraste e por in situ imunomarcação com marcadores moleculares relevantes. Os marcadores mais vulgarmente utilizados são alfa 6-integrina, um marcador de polaridade basal, em associação com o marcador da proliferação de fosfo-histona 3 e o apoptotmarcador ic caspase-3. Esta última é importante para determinar se existe a formação de lumen no centro dos ácinos, uma característica de células normais e benignas da mama. Outros polaridade e de contato célula-célula marcadores incluem GM130, laminina, ERM, E-caderina. Alternativamente as linhas de células de cancro da mama podem ser modificados para manipular o gene de interesse. Neste caso, a reversão para um crescimento mais preso fenótipo benigno pode ser usado como um lido para distinguir do fenótipo do cancro.
Cultura 3D também pode ser usada com cautela para delinear as vias de sinalização envolvidas na transformação maligna 10-11. Usando o acima mencionado limite lidos, inibidores farmacológicos, os anticorpos de bloqueio ou proteínas recombinantes podem ser usadas se localizar na sinalização molecular conduzindo a uma transformação maligna. Com esforços contínuos de vários laboratórios, é possível extrair as células de 3D para isolar RNA e também preparar lisados por immunoblotting e imunizaçãonoprecipitation. Estas estratégias são descritas em um passo a passo e forma detalhada no protocolo.
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Protocol
1. Preparação de Materiais e Meios de Cultura
- Fator de crescimento Thaw reduzida (TFG) Matrigel a 4 ° CO / N.
- Aqueça mídia completas para linha celular necessário a 37 ° C. MCF10A-ATCC especificado media; Meio F-12 de Ham-HME suplementado com 5% de soro fetal bovino, ml, 5 ug / ml de insulina, factor de 1 ug / hidrocortisona de 10 ng / mL de crescimento epidérmico, e 100 ng de toxina da cólera ml /; F-12 media de SUM149-Ham suplementado com FBS a 5%, 2 ug / ml de hidrocortisona e de 5 ug / ml de insulina; e MDA-MB-231-10% de FBS-DMEM
- Precool um slide de câmara de 8 poços no gelo.
- Prepare cultura de tecidos capô e suprimentos.
2. Três Cultura Dimensional em 8 poços Deslize Câmara
- Casaco de cada poço a 8 poços corrediça com 40 ul de GFR Matrigel. Adicionar o Matrigel no centro da lâmina e, em seguida, espalhada com uma pipeta de ponta P200. Tente espalhar o mais uniformemente possível, evitando bolhas e espalhando que pode levar aformação do menisco.
- Incubar as lâminas a 37 ° C sob 5% de CO 2. Enquanto o Matrigel está solidificando, trypsinize as células, recolher e girar a 150 xg em cultura de tecidos centrifugar por 4 min.
- Contar as células e dilui-se a 12.500 células / mL em meios completos da linha celular respectivos. Adicionar TFG Matrigel a 2% e adicionar 400 ul a cada poço de uma lâmina de câmara de pré-revestidas de Matrigel.
- Incubar as lâminas na incubadora de CO 2. Dar novas mudanças de mídia completas a cada 4 º dia até 15 dias.
- O tratamento com inibidores farmacológicos: Para estudos de inibidor de adicionar os inibidores de moléculas pequenas para o meio completo no momento do plaqueamento seguido por mudanças de meio fresco suplementado com os inibidores de três em três dias, enquanto o crescimento das células em TFG Matrigel.
- O tratamento com a proteína purificada:
- Placa as células seguintes passos 2,1-2,3. Permitir que as culturas a crescer durante 4 dias, seguido por starvati soropor 16 h.
- No dia 5, tratar as células com uma concentração apropriada de proteína purificada em 0,1% de FBS suplementado com os meios de células em jejum de soro. Dê mudança meio fresco com proteína purificada após 2 dias.
- No dia 10 de substituir a meios condicionados com a mídia HME completos. Permitir que as culturas a crescer durante mais 5 dias.
- Coloração por imunofluorescência de estruturas acinares cultivadas em Matrigel:
- Prepare a 2% de paraformaldeído, 0,5% de Triton X-100 e 100 mM de glicina em 1x PBS, pH 7,4. Preparar tampão de imunofluorescência (IF tampão), que compreende de 1 x PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino, 0,2% de triton X-100, 0,05% de Tween-20.
- Use uma pipeta de ponta P200 para aspirar cuidadosamente a meios condicionados.
- Fixar as estruturas acinares com paraformaldeído a 2% preparada de fresco, à temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
- Permeabilizar as células com 0,5% de Triton X-100 durante 10 min a 4 ° C.
- Lava-se a culturas três vezes com 100 mM glicina, 10-15 minutos para cada lavagem.
- Bloquear as células com 10% de soro de cabra em tampão IF, chamado bloco primário, durante 1 hora a RT.
- Incubar as culturas com 20 ng / ml de cabra anti-rato F (ab ') 2 em tampão fragmento bloco primário durante 30 min. Esta etapa é importante para bloquear a espécie de IgG de ratinho imunorreactivas em Matrigel.
- Incubar com anticorpo primário em que a segunda solução de bloqueio (bloco primário 20 ug / ml de cabra anti-rato F (ab ') 2 fragment) O / N a 4 ° C.
- Lavar três vezes com tampão IF por 10-15 min cada um com balanço suave.
- Incube com anticorpos secundários conjugados fluorescentes em tampão IF para 45 min.
- Lavar 3x por 10 minutos cada com tampão IF com balanço suave.
- Montar as lâminas com o reagente anti-fade contendo DAPI para visualizar os núcleos.
- Permitir que as lâminas secar O / N à temperatura ambiente.
- A aquisição de imagens: Adquirir imagens confocal nas milhas da colôniadsection de células cultivadas em cima de Matrigel. Para mais informações adquirir uma série de secções ópticas ao longo de todo o comprimento da estrutura acinar por Z empilhamento.
3. Três Cultura Dimensional em 2-bem Câmara Slides para Immunoblotting
- Precool um slide câmara de 2-bem no gelo. Siga passos 2,1-2,4 intensificação os reagentes para a câmara de 2-bem corrediça por exemplo revestimento com 160 mL de Matrigel e adicionar 1.6 ml de células / Matrigel misturar a cada poço da 2-bem corrediça.
- Colher as estruturas acinares de Matrigel, utilizando o estojo de colheita de células de cultura 3D disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante.
- Diluir a lavagem das células e colheita de células buffers para 1x e pré-resfriamento a 4 ° C. Lavar e deslocamento de Matrigel deve ser levada a cabo em gelo.
- Lavar as estruturas acinares 3x utilizando o tampão de lavagem celular.
- Recolher o ácinos em 15 ml tubos de centrífuga usando bu colheita de célulasffer seguido por 30 min de incubação num agitador rotativo a 4 ° C. Misture bem a suspensão com uma pipeta de 1 ml. Isto vai quebrar o Matrigel em pequenos pedaços e libertar a maior parte das células do tampão de colheita de células.
- Agregar as células a 200 xg numa centrifugadora de cultura. Retire a camada flutuante de hidrogel a partir de células peletizadas com uma pipeta de ponta P200.
- Ressuspender as lisados em tampão de amostra de SDS fornecidos com o kit. Tampão de lise RIPA também pode ser usado.
4. Quantificação de vs maligno Fenótipo benigna da mama
- Cultivar células em triplicatas para cada conjunto de tratamento seguindo os passos 2,1-2,4.
- Faça imagens de contraste de fase de estruturas acinares de cada poço em 5X ou 10X resolução usando um microscópio de contraste de fase ligada a um shifter de slides e um computador. Tome as imagens movendo o cursor de um quadro para outro e, assim, cobrindo todo o bem do slide compartimentado.
- Contar o número total de estruturas acinareso número de ácinos único plana redonda e do número de estruturas multiacinar ou estruturas esmo crescente falta de organização e aos processos de ramificação que dele emanam.
- Calcule a porcentagem de estruturas acinares plana redondas individuais versus estruturas malignas e enredo como gráfico de colunas. Calcula-se a significância pelo teste t de Student.
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Representative Results
Cultura 3D pode ser efetivamente usado para diferenciar fenótipo maligno das células epiteliais mamárias humanas do peito benigno. Células benignas Solteiro banhado em Matrigel crescer como estruturas esféricas organizados, que podem facilmente ser fotografada como único ácinos plana rodada em um avião usando imagens de contraste de fase. As células malignas único banhado em Matrigel crescer de forma anárquica, mostrar muito elevado índice de refração e são difíceis de imagem em um plano. Como mostrado na Figura 1, o HME benigna e células MCF10A formar ácinos olhando esféricas enquanto que as linhas de células da mama altamente metastáticas SUM149 e MDA-MB-231 crescer como ramificação estruturas tubulares com processos que emanam a partir deles. Tal desvio do fenótipo benigno pode ser usada como uma leitura para confirmar a transformação maligna e pode ser usado para definir a função de uma molécula como um supressor de tumor, ou como um promotor de tumores. Como mostrado na Figura 2, o knockdown (KD) do gene supressor de tumor CCN6 tmontadores uma transformação maligna. Células HME projetado para ter níveis de CCN6 baixo regulamentada pelo lentivírus transfecção mediada perder sua organização desde muito cedo. No dia 5, as células controle benignos foram crescendo estruturas esféricas como perfeitos enquanto as células CCN6 KD mostrar um fenótipo desorganizado. Por volta do dia 15 as células benignas de controle tornam-se crescimento preso e mostrar uma camada polarizada de células em torno de um lúmen central bem definidas enquanto as células KD crescer prolífica para formar grandes estruturas tubulares desorganizadas, que continuam a crescer se for permitido (Figura 2).
Vários marcadores moleculares podem ser utilizadas com vantagem para diferenciar entre o benigna versus maligna fenótipo da mama. A benigna da mama mostra um crescimento diferenciado preso fenótipo de dia 15 em cultura 3D. Os ácinos têm uma deposição de membrana basal, que podem ser visualizadas por imunocoloração com laminina V, como é claramente mostrado nas células de controlo na figura 3 (Figura 3).
As vias de sinalização envolvidos na transformação maligna pode ser delineado com uma combinação de inibidores farmacológicos e proteínas purificadas humanos recombinante (rh). Como mostrado na Figura 4 a malignidadest fenótipo de células CCN6 KD HME pode ser revertido a estruturas individuais acinares rodada por meio de tratamento com a proteína exógena rhCCN6. Imagem confocal na seção média das estruturas acinares DAPI manchados mostram claramente ácinos polarizada com lúmen central em células CCN6 KD tratados com rhCCN6. Da mesma forma o SUM149 invasivo e MDA-MB-231 tratadas com inibidor de p38 MAP quinase mostra a redução no fenótipo maligno (Figura 5A). A reversão para um fenótipo benigno como pode ser quantificada calculando a percentagem de estruturas individuais acinares redondas em comparação com as estruturas malignas. A especificidade dos inibidores pode ser apreciado pelo facto de que os inibidores de AKT não mostram qualquer efeito sobre as células CCN6 KD enquanto que o tratamento com o inibidor PD98059 MAP quinase mostra uma reversão notável para estruturas acinares redondas simples (Figura 5B).
Figura 1. Imagens de contraste de fase de células benignas vs malignos da mama cultivadas em Matrigel por 10 dias. As células benignas imortalizados humanos mamárias epiteliais (HME) e células MCF10A imortalizados espontaneamente crescer como única rodada ácinos apartamento desprovido de qualquer saliência. Considerando que as linhas de células da mama humanas malignas SUM149 e MDA-MB-231 altamente crescer como estruturas desorganizadas. Barra de escala representa 100 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Imagem confocal de HME-controle e células CCN6 KD cultivadas em Matrigel
Confocal imagem Figura 3. Mostra a expressão diferencial de marcadores moleculares no benign vs mama células malignas. células CCN6 KD HME mostram perda da laminina V, o que representa o rompimento da membrana basal, perda de polaridade basal marcador alfa-6-integrina, indicando perda de polaridade e perda de célula-célula contato marcador E-caderina . No entanto, as células de controlo mostram a deposição de membrana basal (laminina uma camada intacta ao redor do ácinos), expressão basal de alfa 6 de integrina, a expressão de apicais GM130 e na presença de E-caderina na junção célula-célula. Barra de escala representa 50 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4. Reversão do fenótipo maligno das células CCN6 KD HME por tratamento exógeno com o recombinante purificado humano prot CCN6ein. células KD CCN6 crescer como fortuitos, estruturas acinares invasoras na cultura 3D. No entanto, as células CCN6 KD tratados com 500 ng / ml de rhCCN6 mostram reversão a única acinar fenótipo rodada com a compensação de luz, indicando uma mais benigna como fenótipo. Barra de escala preta representa 100 mm e barra de escala amarelo representa 50 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 5. Tratamento com inibidores de moléculas pequenas reverter o fenótipo maligno de menos maligno ou benigno como fenótipo. A. O tratamento de 2 linhas de células da mama altamente metastáticas SUM149 e MDA-MB-231 com inibidores da cinase MAP p38 SB203850 (5 uM) e SB202190 (10 mM) reduz a suacomportamento maligno, como se reflete no único acinar fenótipo rodada em 3D. Células B. CCN6 KD HME tratados com inibidores da AKT LY294002 (7,5 mm), Wortamannin (2 nM) não mostra nenhum efeito, mas o tratamento com MAP quinase inibidor PD98059 (10 mM) reverte o fenótipo a única redonda organizada estruturas acinares. Clique aqui para ampliar imagem.
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Discussion
Nós descrevemos aqui a cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída e a utilidade deste sistema para diferenciar entre versus maligna fenótipo benigna da mama. Este sistema também pode ser utilizado para cultura de diferentes tipos de células de outros tecidos glandulares e tem sido relatada como tendo sido utilizados com sucesso para a cultura epitelial da próstata, do epitélio brônquico, e as células epiteliais da tiróide, para citar alguns 12-14. A importância de cultura 3D reside no facto de que é um modelo fisiologicamente relevante. Cultura 3D fornece um meio para obter insights sobre os mecanismos moleculares que levam ao rompimento da arquitetura glandular durante a transformação maligna. Ele também fornece um sistema modelo de trabalho que pode ser útil na seleção de novos alvos terapêuticos para o tratamento de câncer. Muitas drogas que são encontrados para ser eficaz na cultura 2D muitas vezes têm pouco efeito em applictai experimental e clínicaons 15. Como tal cultura em 3D pode ser uma importante ferramenta de pré-clínico para prever o efeito de compostos in vivo.
Cultura 3D é uma técnica difícil e deve ser realizada com cuidado. TFG Matrigel é o substrato mais comummente utilizado para a cultura de células em 3D. Ele pode ser descongelada a 4 ° CO / N, divididos em alíquotas e congeladas a -20 ° C para uso futuro. Repetiu descongelamento congelamento deve ser evitada. TFG Matrigel é líquido a 4 ° C, mas solidifica, a 37 ° C e pode ser extremamente difícil de manusear quando se muda de meio condicionado com meio fresco ou durante o processamento das células durante a imunocitoquímica. Por favor, não use um aspirador de pó para remover a mídia condicionado, uma vez que, invariavelmente, leva à perda de culturas acinares inteiras, juntamente com o Matrigel. Observa-se que, no caso de algumas linhas celulares de cancro agressivos como MDA-MB-231 de células que formam redes muito ramificação como estruturas Matrigel pode destacar do surenfrentar e é muitas vezes flutuantes. Cuidados devem ser tomados para sugar mídia para fora dessas culturas caso contrário, eles serão perdidos durante a remoção da mídia.
Igualmente importante é o cuidado ea passagem de células de crescimento como culturas em monocamada, especialmente para as células benignas como HME e MCF10A. Ao longo confluência ou desvio da mídia prescrito pode afetar a formação acinar em 3D.
É possível isolar as células a partir de culturas em 3D para processar para RNA ou proteína de isolamento utilizando disponível comercialmente estojo de colheita de células de cultura 3D. Alternadamente as culturas tri-dimensionais podem ser lisadas directamente com tampão de lise baseia-detergente tal como tampão RIPA (1% de Nonidet P-40, 0,2% de SDS, desoxicolato de sódio a 0,5%, cloreto de sódio 150 mM, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de fluoreto de sódio, ortovanadato de sódio 1 mM, 10 mM b-glicerofosfato, 5 ug / ml apoprotinin, 5 ug / ml de leupeptina e 100 uM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo). No entanto quantificação de proteínascação não é possível, neste caso, porque a abundância de proteínas no Matrigel. Assim, os lisados de proteína deve ser normalizada em ensaios colorimétricos utilizados para medir a actividade de enzimas citosólicas estáveis, tais como a lactose-desidrogenase (LDH), e as manchas devem ser sondado de um gene housekeeping como actina ou tubulina ou GAPDH 3.
No entanto, a colheita de células do processo de Matrigel requer a incubação de longa duração, a 4 ° C. Isto pode afectar o perfil de proteínas de superfície da célula de expressão e, como tal, em imunocoloração in situ é um método mais conveniente para analisar a expressão de proteínas da superfície celular. Para a imunocoloração anticorpos incubação num agitador suave é útil na coloração uniformemente os ácinos, mas a velocidade óptima e do tipo oscilante é crítica, uma vez que também pode levar ao desalojamento do Matrigel. A concentração de anticorpos pode precisar optimização, mas a maioria dos anticorpos foram encontrados para serem eficientes na concentração de 1:100. A more lista específica de anticorpos é fornecida na tabela. Uma lista detalhada de anticorpos com as suas especificações podem ser encontradas em Debnath et al. 2 incubação simultânea com mais do que um anticorpo primário obtido a partir de diferentes animais como rato, coelho e rato pode ser levada a cabo, mas deve ser optimizada, inicialmente, para excluir qualquer reactividade cruzada .
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01 CA107469, CA125577 R01 e U01CA154224 para CG Kleer, a Universidade do Centro de Câncer de Apoio de Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
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