Summary
Tredimensionell kultur av bröstepitelceller på ett rekonstituerat basalmembran är en användbar metod för att rekapitulera arkitekturen för benign bröst in vivo och att differentiera den maligna fenotypen från benign bröst fenotyp. Viktigare, kan detta system användas för att studera invasiva karcinom i andra vävnader.
Abstract
Invasiva bröstkarcinom är en grupp av maligna epiteliala tumörer kännetecknas av invasion av intilliggande vävnad och benägenhet att metastasera. Samspelet av signaler mellan cancerceller och deras mikromiljö utövar ett starkt inflytande på bröstcancertillväxt och biologiskt beteende 1. Men de flesta av dessa signaler från den extracellulära matrisen är förlorade eller deras relevans är understudied när celler odlas i två dimensionella kultur (2D) i form av ett monoskikt. Under de senaste åren har tredimensionella (3D) kultur på ett rekonstituerat basalmembran framträtt som en lämplig metod för att rekapitulera vävnaden arkitekturen av godartade och elakartade bröstceller. Celler odlas i 3D behålla de viktiga ledtrådar från den extracellulära matrisen och ger en fysiologiskt relevant ex vivo-system 2,3. Att notera, det finns allt fler bevis som tyder på att cellerna beter sig olika när de odlas i 3D jämfört med 2D 4. 3D kultureffektivt kan användas som ett sätt att skilja den maligna fenotypen från godartade bröst fenotyp och för att stödja den cellulära och molekylära signaler inblandade 3. Ett av de utmärkande egenskaperna hos godartade epitelceller är att de är polariserade så att den apikala cytoplasman är mot lumen och den basala cytoplasman vilar på basalmembranet. Denna apico-basal polaritet går förlorad i invasiva bröstkarcinom, som kännetecknas av cellulär desorganisation och bildning av anastomosing och förgrening tubuli som måfå infiltrerar den omgivande stroma. De histopatologiska skillnader mellan godartad körtel och invasiv cancer kan reproduceras i 3D 6,7. Med användning av lämpliga avläsningar som kvantifiering av enskilda, runda acinar strukturer, eller differentiell expression av validerade molekylära markörer för cellproliferation, polaritet och apoptos i kombination med andra biologiska tekniker molekylära och cell, 3D culture kan ge ett viktigt verktyg för att bättre förstå de cellulära förändringar under malign transformation och för avgränsning av den ansvariga signalering.
Introduction
Tredimensionell kultur (3D) av bröst epitelceller på rekonstruerad basalmembran är ett viktigt modellsystem för att studera komplexa fenotyp och tillhörande signalering av normal bröst och bröstcancer 2,3. Den funktionella enheten av bröst är terminalledningen lobulär enhet (TDLU), vilken består av en liten kanal, som grenar in i acini. Acini är mycket organiserade strukturer, som består av två cellskikt, epitelceller och myoepitelceller, som är omgivna av ett basalmembran 5. De mest utmärkande dragen i normala acini är cellulär polarisering, infästning i underliggande basalmembranet och specialiserad cell-cellkontakter. Denna invecklade organisation störs i invasiva carcinom. De allmänt använda 2D kulturer, där cellerna odlas som monoskikt, inte tillåter bildandet av acini. Således är monolagerkultur saknas i att tillhandahålla ett system för att fånga den intrikata relationen mellan epitelcelleri normalt bröst och deras avreglering i bröstcancer. Funktionella monotypic epitelceller kulturer av bröstceller har utvecklats i flera laboratorier 2,3. 3D kultur involverar tillväxt av bröstceller på Matrigel, som är ett solubiliserat extrakt härlett från Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller och är tillgängliga kommersiellt. Andra 3D-substrat som kollagen jag används också. De bröstceller kan odlas i 3D genom 3D inbäddade assay, där celler odlas inbäddade i Matrigel 2. Alternativt kan celler odlas av 3D överst analys, även kallad 3D-overlay-analys, som är kostnadseffektiv eftersom den kräver mindre volym Matrigel, och underlättar tid förfaller övervakning av kolonibildning genom faskontrast avbildning och är idealisk för in situ avbildning 2 -3. 3D överst analys har använts för att fastställa sambandet mellan acinar fenotyp och genuttryck profil 7.
3D kultur kan effektiv attely används för att skilja normala och benigna celler från invasiv cancer. Normala och godartade bröstceller bildar tillväxt greps polariserade strukturer med väl definierade lumen i mitten på Matrigel medan invasiva cancerceller växer prolifically och på måfå utan röjning av lumen. E6/E7 förevigat mänskliga bröst epitelceller och MCF10A cellinje, vilket är ett spontant förevigat cellinje isolerad från en 36-årig patient med fibrocystiska förändringar, har med framgång använts för att återta den godartade bröst fenotyp i 3D 3,8 och har tjänstgjort som ett modellsystem för att studera den onkogena och tumörsuppressorfunktion av flera molekyler 8,9. Dessa godartade celler kan vara konstruerad för att manipulera gen (er) av intresse genom införandet av lentivirus / retrovirus. Om den gen (er) av intresse är en tumörsuppressor kommer shRNA förmedlad knockdown leda till en malign transformation medan om genen av intresse är en onkogen-överexpression i benigna cellerska visa en malign fenotyp. I båda fallen är acinar strukturer som bildas i 3D kan fånga malign transformation.
Godartad enstaka celler pläterade i 3D börjar föröka sig och bilda runda sfäriska strukturer. Vid dag 5-8 denna sfäriska aggregat av celler kommer att differentieras till ett omgivande polariserat skikt av celler som är i kontakt med Matrigel, och en inre massa på mindre polariserade celler, som saknar kontakt med Matrigel. Under de närmaste 10-15 dagarna de inre cellerna börjar dö genom apoptos bildar en tydlig lumen. De maligna celler växer måfå förlora sin polaritet. Mycket maligna celler bildar normalt förgrenade strukturer. Dessa skillnader i fenotyp kan fångas upp av tidsförlopp faskontrast avbildning och med in situ immunfärgning med relevanta molekylära markörer. De vanligast använda markörerna är alfa 6-integrin, en basal polaritet markör, i kombination med spridningen markör fosfo-histon 3 och apoptotic markör kluvna caspase-3. Det senare är viktigt för att avgöra om det finns ljusbildning i mitten av acini, en funktion i normala och benigna bröstceller. Andra polariteten och cell-cellkontakt markörer inkluderar GM130, laminin, ERM, E-cadherin. Alternativt bröstcancercellinjer kan vara konstruerad för att manipulera den intressanta genen. I detta fall är en återgång till en mer tillväxt arrested benign fenotyp kan användas som en utläses att skilja från den cancer-fenotyp.
3D-kulturen kan också noga för att avgränsa de signalvägar som är involverade i malign transformation 10-11. Med hjälp av ovan nämnda avläsningar, farmakologiska hämmare, blockerar antikroppar eller rekombinanta proteiner kan användas för att peka på molekylär signalering som leder till malign transformation. Med fortsatta insatser från olika laboratorier är det möjligt att utvinna celler från 3D för att isolera RNA och även förbereda lysates för immunoblotting och immunitetnoprecipitation. Dessa strategier beskrivs i en stegvis och detaljerat sätt i protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av material och Kultur Media
- Tina tillväxtfaktor minskas (GFR) Matrigel vid 4 ° CO / N.
- Värm upp kompletta medier för krävs cellinje vid 37 ° C. MCF10A-ATCC specificerade media; HME-Hams F-12-medium kompletterat med 5% fetalt bovint serum, 1 | ig / ml hydrokortison, 5 ng / ml insulin, 10 ng / ml epidermal tillväxtfaktor, och 100 ng / ml koleratoxin; SUM149-Hams F-12-medium kompletterat med 5% FBS, 2 | ig / ml hydrokortison och 5 ^ g / ml insulin; och MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
- Förkyla en 8-brunnars kammare bild på is.
- Förbered vävnadsodling huva och förnödenheter.
2. Tredimensionell Kultur i 8-väl Chamber Slide
- Coat varje brunn i 8-brunnars objektglas med 40 pl av GFR Matrigel. Lägg till Matrigel i mitten av bilden och sedan sprida med hjälp av en P200 pipettspetsen. Försök att spridas så jämnt som möjligt, för att undvika bubblor och overspreading vilket kan leda tillmeniskbildning.
- Inkubera objektglasen vid 37 ° C under 5% CO2. Medan Matrigel är stelnar, trypsinize cellerna, samla in och snurra vid 150 xg i vävnadskultur centrifug för 4 min.
- Räkna celler och späd till 12500 celler / ml i komplett medium av respektive cellinje. Lägg GFR Matrigel till 2% och tillsätt 400 | il till varje brunn i en Matrigel förbelagda kammarobjektglas.
- Inkubera objektglasen i CO2 inkubator. Ge färska kompletta medie förändringar varje 4: e dagen fram till 15 dagar.
- Behandling med farmakologiska hämmare: För studier hämmare lägga småmolekylinhibitorer till komplett media vid tidpunkten för plätering följt av färska medie förändringar kompletterat med hämmare var tredje dag under uppväxten cellerna på GFR Matrigel.
- Behandling med renat protein:
- Plate cellerna efter steg 2,1-2,3. Låt kulturerna att växa i 4 dagar följt av serum starvatiom under 16 timmar.
- Vid dag 5, behandla cellerna med lämplig koncentration av renat protein i 0,1% FBS kompletterat media till serum svalt cellerna. Ge färskt medium förändring med renat protein efter 2 dagar.
- Vid dag 10 ersätta den rade media med komplett HME media. Låt kulturerna växa i ytterligare fem dagar.
- Immunofluorescensfärgning av acinar strukturer odlas på Matrigel:
- Bered 2% paraformaldehyd, 0,5% Triton X-100 och 100 mM glycin i 1 x PBS, pH 7,4. Förbered immunofluorescens buffert (IF-buffert) som består av 1 x PBS innehållande 0,1% bovint serumalbumin, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20.
- Använd en P200 pipett försiktigt aspirera rade media.
- Fäst acinära strukturer med 2% nygjord paraformaldehyd vid rumstemperatur (RT) i 20 min.
- Permeabilisering av cellerna med 0,5% Triton X-100 i 10 min vid 4 ° C.
- Tvätta odlingens tre gånger med 100 mM glycin, 10-15 min för varje tvätt.
- Blockera cellerna med 10% getserum i IF-buffert, som kallas primärblocket, till en timme vid RT.
- Inkubera kulturerna med en 20 | ig / ml av get-anti-mus F (ab ') 2-fragmentet i primär blockbuffert under 30 min. Detta steg är viktigt för att blockera immunreaktiva mus IgG arter i Matrigel.
- Inkubera med primär antikropp i det andra blockeringslösning (Primary blocket 20 ug / ml get-anti-mus F (ab ') 2-fragment) O / N vid 4 ° C.
- Tvätta tre gånger med IF-buffert under 10-15 min vardera med försiktig skakning.
- Inkubera med fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar i IF-buffert under 45 min.
- Tvätta 3x under 10 min vardera med IF-buffert med försiktig skakning.
- Montera bilderna med anti-fade reagens innehållande DAPI att visualisera kärnor.
- Låt objektglasen torka O / N vid RT.
- Bild förvärv: Förvärva konfokala bilder vid koloni mildsection av celler odlade på toppen av Matrigel. För mer information förvärva en serie av optiska snitt genom hela längden av acinar strukturen genom Z stapling.
3. Tredimensionell Kultur i 2-väl kammare diabilder för Immunoblotting
- Förkyla en 2-väl kammare bild på is. Följ steg 2,1-2,4 skala upp reagenser för 2-väl kammare bild t.ex. rock med 160 l av Matrigel och tillsätt 1,6 ml cell / Matrigel mix till varje brunn på 2-bra bild.
- Skörda acinar strukturer från Matrigel med hjälp av kommersiellt tillgängliga 3D kultur cellskörd kit efter tillverkarens instruktioner.
- Späd celltvätt och cell skörd buffertar till 1x och förkyla till 4 ° C. Tvättning och rubbas Matrigel bör utföras på is.
- Tvätta körtelstrukturerna 3x använda celltvättbuffert.
- Samla acini i 15 ml centrifugrör med cell skörd buffer följt av 30 min inkubation på en rocker vid 4 ° C. Blanda fjädring väl med en 1 ml pipett. Detta kommer att bryta den Matrigel i små bitar och släppa de flesta av cellerna i cellskörd buffert.
- Pelletera cellerna vid 200 x g i en kultur centrifug. Ta det flytande lagret av hydrogel från de pelleterade cellerna med en P200 pipettspetsen.
- Resuspendera lysaten i SDS provbuffert som medföljer satsen. RIPA-lys-buffert kan även användas.
4. Kvantifiering av malignt vs Benign bröst Phenotype
- Väx celler i tre exemplar för varje behandling angavs som ett steg från 2,1 till 2,4.
- Ta fas kontrast bilder av acinar strukturer från varje brunn vid 5X eller 10X upplösning med hjälp av ett faskontrastmikroskop bifogas en bild shifter och en dator. Ta bilderna genom att föra från en ram till en annan och på så sätt täcker hela väl i chambered slide.
- Räkna det totala antalet körtelstrukturer,Antalet enda runda platta acini och antalet multiacinar strukturer eller måfå växande strukturer som saknar organisation och med förgreningsprocesser som utgår från det.
- Beräkna andelen ensamstående runda platta acinära strukturer kontra maligna strukturer och tomt som kolumn grafen. Beräkna betydelse med Students t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D-kulturen effektivt kan användas för att skilja maligna fenotypen av humana bröst epitelceller från godartade bröst. Enstaka godartade celler pläterade på Matrigel växa som organiserade sfäriska strukturer som lätt kan avbildas som enda runda platta acini i ett plan med hjälp av faskontrast avbildning. De enstaka maligna celler pläterade på Matrigel växer måfå, visar mycket högt brytningsindex och är svåra att bilden i ett plan. Såsom visas i figur 1, den godartade HME och MCF10A celler bildar sfäriska söker acini medan starkt metastatiska bröstcancercellinjer SUM149 och MDA-MB-231 växa som förgrening rörformiga strukturer med processer som utgår från dem. En sådan avvikelse från benign fenotyp kan användas som en läsa upp för att bekräfta malign transformation och kan användas för att definiera funktionen av en molekyl som en tumörsuppressor eller som en tumörpromotor. Såsom visas i figur 2, den knockdown (KD) av tumörsuppressorgen CCN6 tRIGGERS en malign transformation. HME celler konstruerade att ha ner reglerade nivåer av CCN6 av lentivirus medierad transfektion förlorar sin organisation från mycket tidigt. Vid dag 5 de godartade kontrollcellerna växte så perfekt sfäriska strukturer medan CCN6 KD cellerna visar en oorganiserad fenotyp. Vid dag 15 de godartade kontrollceller blir tillväxten greps och visa en polariserad lager av celler som omger en väldefinierade centrala lumen medan KD celler växer prolifically bildar oorganiserade stora rörformiga strukturer som fortsätter att växa om det tillåts (Figur 2).
Flera molekylära markörer kan med fördel användas för att skilja mellan godartade vs maligna bröst fenotyp. Den godartad bröstcancer visar en differentierad tillväxt greps fenotyp efter dag 15 i 3D-kulturen. Acini har en avlagring av basalmembran som kan visualiseras genom immunfärgning med laminin V såsom visas tydligt i kontrollceller i figur 3 (Figur 3).
De signalvägar som är involverade i den maligna omvandling kan avgränsas med hjälp av en kombination av farmakologiska hämmare och renat rekombinant humant (rh) proteiner. Såsom visas i figur 4 den malignant fenotyp av CCN6 KD HME celler kan återställas till enkla runda acinära strukturer genom exogen behandling med rhCCN6 protein. Confocal avbildning på den mellersta delen av DAPI färgade acinära strukturer visar tydligt polarise acini med centrala lumen i CCN6 KD celler som behandlats med rhCCN6. Likaså den invasiva SUM149 och MDA-MB-231 celler behandlade med p38 MAP-kinas-hämmare visar reduktionen i den maligna fenotypen (Figur 5A). Återgången till en godartad liknande fenotyp kan kvantifieras genom att beräkna den procentuella andelen av enskilda, runda acinar strukturer jämfört med de maligna strukturer. Specificiteten av hämmare kan förstås av det faktum att AKT-hämmare inte visar någon effekt på CCN6 KD-celler, medan behandling med MAP-kinashämmare PD98059 det visar en anmärkningsvärd återgång till enkla runda acinära strukturer (Figur 5B).
Figur 1. Fas kontrastbilder av godartad vs elakartade bröstceller odlade på Matrigel i 10 dagar. De godartade förevigade mänskliga bröst epitelceller (HME) och spontant förevigat MCF10A celler växer som enda runda platta acini saknar utstick. De maligna humana bröstcellinjer SUM149 och MDA-MB-231 växa som starkt desorganiserat strukturer. Skala stapel representerar 100 ìm. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Confocal avbildning av HME-kontroll och CCN6 KD-celler odlas på Matrigel
Figur 3. Confocal avbildning visar differentiellt uttryck av molekylära markörer i benign vs elakartade bröstceller. CCN6 KD HME celler visar förlust av laminin V, som representerar störningar i basalmembranet, förlust av basal polaritet markören alfa-6-integrin, vilket indikerar förlust av polaritet och förlust av cell-cellkontakt markör E-cadherin . Men kontrollcellerna visar nedfallet av basalmembran (en intakt laminin lager runt acini), basala uttryck av alfa 6 grin, apikal uttryck för GM130 och förekomst av E-cadherin i cell-cell korsning. Skala stapel representerar 50 pm. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Återföring av den maligna fenotypen av CCN6 KD HME celler genom exogen behandling med renat rekombinant humant CCN6 protein. CCN6 KD celler växer så slumpartat, invasiva acinära strukturer i 3D-kulturen. Emellertid CCN6 KD celler behandlade med 500 ng / ml av rhCCN6 show återgång till omgång acinar fenotyp med clearing av lumen, vilket indikerar en mer godartad liknande fenotyp. Svart skala stapel representerar 100 nm och gul skala stapel representerar 50 pm. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 5. Behandling med småmolekylinhibitorer återgår den maligna fenotypen till mindre elakartad eller godartad liknande fenotyp. A. Behandling av två starkt metastatiska bröstcellinjer SUM149 och MDA-MB-231 med p38 MAP-kinas-hämmare SB203850 (5 pM) och SB202190 (10 ^ M) minskar derasmalignt beteende som avspeglas i den enda runda acinar fenotyp på 3D. B. CCN6 KD HME celler som behandlats med AKT-hämmare LY294002 (7,5 ^ M), Wortamannin (2 nM) visar ingen effekt, men behandlingen med MAP-kinashämmare PD98059 (10 M) återgår fenotypen till enda runda organiserat acinar strukturer. Klicka här för att visa en större image.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit här den tredimensionella kultur av bröst epitelceller på en rekonstruerad basalmembran och nyttan av detta system för att skilja mellan maligna vs godartad bröst fenotyp. Systemet kan också användas för att kultur olika celltyper från andra glandular vävnader och har rapporterats har med framgång använts till kultur prostata epitelceller, bronkial epitel, och sköldkörtel epitelceller, för att nämna några 12-14. Vikten av 3D-kulturen ligger i det faktum att det är ett fysiologiskt relevant modell. 3D-kultur ger en möjlighet att få insikt i de molekylära mekanismer som leder till störningar av körtel arkitekturen under malign transformation. Det ger också en arbetsmodell system som kan vara till hjälp för screening nya terapeutiska mål för behandling av cancer. Många läkemedel som visat sig vara effektiva i 2D kultur ofta har liten effekt i experimentell och klinisk applictaions 15. Som sådan 3D-kulturen kan ge en viktig preklinisk verktyg för att förutsäga effekten av föreningar in vivo.
3D-kulturen är en utmanande teknik och bör utföras noggrant. GFR Matrigel är den vanligast använda substrat för odling av celler i 3D. Den kan tinas vid 4 ° CO / N, alikvoterades och frystes vid -20 ° C för framtida användning. Upprepad frysning upptining bör undvikas. GFR Matrigel är flytande vid 4 ° C, men stelnar vid 37 ° C och kan vara mycket svåra att hantera vid byte konditionerat medium med färska medium eller vid bearbetning av cellerna för immuncytokemi. Använd inte en vakuumsug för att ta bort rade media eftersom det leder alltid till förlust av hela acinära kulturer tillsammans med Matrigel. Det har konstaterats att i händelse av vissa aggressiva cancercellinjer som MDA-MB-231 celler som bildar mycket förgrenings nätverk liknande strukturer Matrigel kan lossna från suransikte och är ofta gånger flytande. Försiktighet bör vidtas för att suga medier ur dessa kulturer annars går förlorade när du tar bort media.
Lika viktigt är det vård och passage av celler som växer som monolagerkulturer i synnerhet för de godartade celler som HME och MCF10A. Under sammanflödet eller avvikelse från den föreskrivna media kan påverka acinar bildningen i 3D.
Det är möjligt att isolera celler från 3D-kulturer för att bearbeta för RNA eller protein isolering med användning av kommersiellt tillgängliga 3D kultur cellskörd kit. Växelvis tredimensionella kulturer direkt kan lyseras med användning av tvättmedel baserad-lysbuffert såsom RIPA-buffert (1% Nonidet P-40, 0,2% SDS, 0,5% natriumdeoxicholat, 150 mM natriumklorid, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM natriumfluorid, 1 mM natriumortovanadat, 10 mM b-glycerofosfat, 5 | ig / ml apoprotinin, 5 | ig / ml leupeptin, och 100 pM fenylmetylsulfonylfluorid). Emellertid protein kvantifieringning är inte möjligt i detta fall på grund av protein överflöd i Matrigel. Således proteinlysat bör normaliseras med kolorimetriska analyser som används för att mäta aktiviteten av stabila cytosoliska enzymer, såsom laktos (LDH) och blottarna bör reprobed för en housekeeping-genen som aktin eller tubulin eller GAPDH 3.
Men cellskörd från Matrigel processen kräver långvarig inkubation vid 4 ° C. Detta kan påverka uttrycksprofilen för de cellyteproteiner och som sådan in situ immunfärgning är en lämpligare metod för att analysera uttrycket av cellyteproteiner. För immunfärgning antikropp inkubation på en liten rocker är till hjälp i jämnt färgning acini men optimal hastighet och rocker typ är viktigt eftersom det också kan leda till att rubbas Matrigel. Antikroppskoncentrationen kan behöva optimering men de flesta antikroppar befanns vara effektiv vid 1:100 koncentration. En more specifik lista av antikroppar finns i tabellen. En detaljerad lista över antikroppar med sina specifikationer finns i Debnath et al. 2 Samtidig inkubation med mer än en primär antikropp som erhållits från olika djur som råtta, kanin och mus kan utföras utan bör optimeras till en början för att utesluta någon korsreaktivitet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01 CA107469, R01 CA125577 och U01CA154224 till CG Kleer, University of Michigans Cancer Center Support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
- Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
- Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
- Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
- Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
- Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).
