Summary
Nanopodia er tynde, men skrøbelige membran-kanaler, der når op til 100 um fra en celle førende forreste eller bageste bagfra og fornemmer det cellulære miljø. Direkte fiksering ved 37 ° C, blid vask, og undgåelse af organiske opløsningsmidler som ethanol, methanol eller acetone og af højere Triton X-100-koncentrationer er forpligtet til at overholde disse cellulære strukturer.
Abstract
Adhærente celler i kultur opretholde en polariseret tilstand til at understøtte bevægelse og intercellulære interaktioner. Nanopodia er tynde, aflange, hovedsagelig F-actin-negative prognoser membran i endotel-og kræftceller, der kan visualiseres gennem TM4SF1 (transmembrane-4-L-seks-familie-1) immunofluorescensfarvning. TM4SF1 klynger i 100-300 um diameter TMED (TM 4SF1 e nriched Mikro D omains) indeholdende 3 til så mange som 14 individuelle TM4SF1 molekyler. TMED er arrangeret med mellemrum langs nanopodia på en regelmæssig afstand på 1 til 3 Tmed pr μ m og forankre nanopodia til matrix. Dette gør det muligt nanopodia at udvide mere end 100 μ m fra førende forreste eller bageste bagsiden af polariserede endotel eller tumorceller, og forårsager rester membran at blive efterladt på matrix når cellen bevæger sig væk. TMED og nanopodia er blevet overset på grund af deres ekstreme skrøbelighed og følsomhed over for temperatur. Rutinemæssig vask og fiksering forstyrre strukturen. Nanopodia bevares ved direkte fiksering i paraformaldehyd (PFA) ved 37 ° C, efterfulgt af kortvarig eksponering til 0,01% Triton X-100 før farvning. Nanopodia åbne nye perspektiver i cellebiologi: de lover at omforme vores forståelse af, hvordan celler fornemmer deres omgivelser, opdage og identificere andre celler på afstand, indlede intercellulære interaktioner ved tæt kontakt, og signalsystemerne mekanismer involveret i bevægelsen, proliferation og celle -celle kommunikation. De metoder, der er udviklet for at studere TM4SF1-afledt nanopodia kan være nyttigt for studier af nanopodia, der danner i andre celletyper gennem formidlingen af klassiske tetraspanins, navnlig allestedsnærværende udtrykt CD9, CD81 og CD151.
Introduction
Under polarisering bevægelse, dyreceller udvide en række dynamiske, membran fremspring fra deres overflader, herunder filopodia, lamellipodia, retraktionsindstillingen fibre og flæser 1. For nylig føjet til denne liste var nanopodia, en nyligt anerkendt type tynde (100-300 um i diameter), aflang (op til 50-100 um lange) membran projektion, der giver membran kanaler til udvidelse af F-actin strukturer såsom filopodia og tilbagetrækning fiber, og at pletten positivt med TM4SF1 (transmembrane-4-L-seks-familie-1) i dyrkede endotel og tumorceller 2,3.
TM4SF1 er et protein med tetraspanin-lignende topologi, der oprindeligt var kendt som en tumorcelleantigen 4 inden opdagelsen af, at molekylet er et endotelcelle biomarkør, der spiller en væsentlig rolle i endotelcelleproliferation og migration 2,3. Immunfluorescensfarvning viste, at TM4SF1 er lokaliseret til perinucLear vesikler og til plasmamembranen, og er beriget i TM 4SF1 e nriched Mikro D omains (Tmed). TMED anker nanopodia til matrix og til stede i en regelmæssige mellemrum stribet mønster på 1-3 TMED / mM længde nanopodia. Nanopodia strækker sig typisk fra en celle førende forreste og bageste bag under cellepolarisering bevægelse. På grund af den fast adhærerende art TMED, nanopodia er i stand til at trække tilbage i cellen, da det bevæger sig væk; forladte nanopodia rester dermed spore stien cellulære bevægelse. Nanopodia give membran kanaler til F-actin udskudssekvens, og er steder af intercellulære interaktioner og kommunikation 2,3. Disse egenskaber betyder, at nanopodia giver en unik mulighed for at studere de mekanismer, der ligger til grund F-actin samling under cellulært polarisering, cellulær sansning af miljøet, bestemmelse af stien og retning af celle bevægelse, og intercellulære interaktioner ennd kommunikation.
På grund af den meget hydrofobe natur TMED og den tynde og skrøbelige membranøs natur nanopodia, der skal tages for at bevare TMED og nanopodia særlig pleje. Ødelæggelsen af nanopodia og fjernelse af TMED af fælles laboratoriemetoder er en mulig årsag til, at der kun treogtres publikationer har optrådt på TM4SF1 siden sin første opdagelse i 1986 1, og for den fuldstændige mangel på viden om TM4SF1 berigelse i 100-300 um mikrodomæner på celleoverfladen indtil rapporten fra TM4SF1 i endotelceller i 2009 2.
Konventionelle immunfarvning metoder almindeligt brug organiske opløsningsmidler som ethanol, methanol, acetone eller lignende til løse celler og bruge 0,1% eller højere Triton X-100 koncentrationen permeabilisere celler 5.. Studier beskrevet her gennemført tre større ændringer i den konventionelle metode til at afsløre TMED og nanopodia: (i) at anvende 37 ° C 4% PFA og løse celler i et 3776; C inkubator, (ii) anvende blid stuetemperatur PBS vask, og (iii) at anvende mindre end 0,03% Triton X-100 kun kortvarigt at permeabilisere celler før tilsætning af primært antistof, Triton X-100 er højere end 0,03%, vil udtrække TM4SF1.
Alle tetraspanins danner mikrodomæner på cellemembranen 6 og nogle colocalize med TMED i endotelceller og tumorceller 2,3. Som tetraspanins som CD9, CD81 og CD151 allestedsnærværende er udtrykt, kan farvningsprotokol beskrevet her udvides til mange forskellige celletyper, der mangler TM4SF1 for studier af nanopodia funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Cell Culture på Kollagen Coated Glass Disk
- Placer glas diske (12 mm i diameter) i en glaskrukke (4 oz) og autoklaver til at sterilisere diskene.
- Anbring 25 ml 70% ethanol i et 50 ml Falcon rør og placere den i en cellekultur hætte. Denne opløsning kan genbruges flere gange, indtil niveauet af opløsningen falder til 20 ml.
- Placer en skarp pincet med en ekstra fin spids i 70% ethanol i 5 min før du bruger den til at håndtere glasset disk.
- Fjern forsigtigt pincet ud af røret og luk hætten derefter forsigtigt placere ethanol behandles pincet på toppen af røret at lufttørre i 2 min. Lad ikke spidsen af pincet til at røre noget i hætten.
- Brug steril pincet til at få fat i en steril glas skive ud af glaskrukke og læg den i en brønd i 24-brønds cellekultur plade. Gentag, indtil det ønskede antal brønde er blevet befolket med diske.
- Sæt 500 pi bovint collagen-opløsning (50 ng / ml) i hver brønd, der indeholder en glasplade og placere den i et 37 ° C, 5% CO 2 cellekultur inkubator i mindst 30 minutter. Der er ingen skade i en længere inkubationstid.
- Harvest HUVEC (human navleveneendotelceller) eller PC3 (prostata-tumorceller), som allerede var dyrket i 150 mm celledyrkningsplade via trypsinbehandling og blokerer trypsin aktiviteten ved sin fuldstændige dyrkningsmedium. Saml celler i et 15 ml Falcon-rør.
- Tæl celle nummer, og sørg levedygtighed er større end 90%.
- Pelletere cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes.
- Brug dyrkningsmediet at fortynde cellerne til 10 5 celler / ml. Placer celler på is.
- Aspirer kollagen i cellekultur hætte og anbring forsigtigt 500 pi cellesuspension til hver brønd, hvori glas skiver blev belagt med kollagen. 5 x 10 4 celler / brønd i 24-brønds plade vil give 60% confluency for HUVEC og 30% konfluens til PC3-celler. Bemærk: tilføje flere cellesuspension efter højere celletæthed.
- Kultur cellerne i et 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, eller 24 timer til at spore nanopodia aktiviteter og celle passage. Typisk vil celler tillægger glas disk i de første 30 min, og derefter begynde at polarisere og migrere i den første time, og udføre intercellulære interaktioner og celledeling i de følgende timer.
2. Cell Fiksering
- Hver brønd skal bruge 500 pi 4% PFA (paraformaldehyd) fastsætte cellerne. Enten kommercielt fremstillet eller frisklavet 4% PFA kan anvendes. Beregn mængden af PFA behov baseret på antallet af brønde forberedt, og placere PFA i en 15 ml Falcon-rør. ADVARSEL: paraformaldehyd er et mistænkt carcinogen.
- Sæt falk røret i en Styrofoam stand, der allerede var på plads i en 37 ° C inkubator. Lad slangen i inkubatoren i 30 min til krigm op PFA til 37 ° C.
- Placer en varmepude i kulturen hætte og tænde den.
- Tag 24-brønds cellekultur plade og forvarmet PFA ud af kuvøsen og placere den på toppen af varmepude.
- Brug den ene hånd at aspirere mediet fra en brønd, og umiddelbart efter du bruge den anden hånd til forsigtigt at glide 500 ul PFA i brønden gennem brønden kant. For at lette aspiration, vippe kultur plade på omkring 45 °, lænet den mod Styrofoam stativet, så det er stabilt på denne vinkel. Dette vil lette aspiration og tilføje PFA løsning til brønden uden at forstyrre cellerne i kultur. Dette er den mest afgørende skridt til at bevare den oprindelige cellestruktur celle aktiviteter.
- Gentag processen, indtil alle brønde med en glas-disk har fået PFA. Bemærk: alle skridt, der skal til at ændre allerede eksisterende løsning fra brønden vil anvende samme aspiration procedurer.
- Pladen anbringes i 37 ° C i 5 min. Tag plade tilbage til kulturen hætte og vippe mod Styrofoam som beskrevet i trin 2.5. Brug den ene hånd til forsigtigt at overføre PFA fra brønden ind i en samling rør; bruge den anden hånd til umiddelbart bagefter placere mindst 500 pi stuetemperatur PBS i brønden. Efter alle brønde er blevet vasket, vende tilbage og gentage PBS vask en gang mere i hver brønd. Tøm indsamlede PFA i en farlig beholder affald.
- Forbered ICC blokeringspuffer ved tilsætning af 2% kalvefosterserum til PBS. 0,04% natriumazid (fortyndes fra 20% stamopløsning) tilsættes som konserveringsmiddel. ADVARSEL: natriumazid er et giftigt stof. Bufferen kan opbevares i 4 ° C i en længere periode uden bakteriel forurening.
- Med kultur pladen stadig vippet mod et stativ igen cykle gennem hver godt sugning at fjerne PBS og umiddelbart bagefter tilsætte 500 pi ICC blokerende buffer. Celler er nu klar til immunfluorescensfarvning. Hvis det er nødvendigt, atfikserede celler kan opbevares i et 4 ° C køleskab til en uge uden signifikant tab af TM4SF1 protein.
3. TM4SF1 immunfluorescensfarvning af Nanopodia
- I hver brønd erstatte 500 pi ICC blokerende buffer med en ny blokeringspuffer indeholdende 0,01% Triton X-100, og lad det stå ved stuetemperatur i 1 time. Brug ikke højere end 0,03% Triton X-100, da det vil fjerne TM4SF1 fra cellemembraner. PBS vaskede celler fra trin 2.10 umiddelbart kan flyttes til den blokerende buffer indeholdende Triton hvis farvningen er klar til at blive startet højre væk.
- Fortyndet primære anti-TM4SF1 (eller anti-CD9)-antistof til 0,5 ug / ml i ICC blokeringsbuffer.
- I hver brønd, fjernes ICC/0.01% Triton buffer og erstatte det med 300 pi anti-TM4SF1-antistof-løsning. Inkuber 2 timer ved stuetemperatur eller forlade natten over ved 4 ° C.
- Vask hver brønd med ikke mindre end 500 pi PBS. Gentag 3x; hver gang giver på least 5 min inkubationstid.
- Forbered et sekundært antistof og phalloidin opløsning i ICC blokerende buffer under anvendelse af en 1.000 gange fortynding af Alexa 488 mærket æsel-anti-muse-sekundært antistof (2 ug / ml slutkoncentration) og 1000 x fortynding af phalloidin (50 ng / ml slutkoncentration).
- Fjern PBS og tilsættes 300 pi det sekundære antistof og phalloidin løsning til hver brønd og inkuberes i 2 timer, eller lade det natten over ved 4 ° C.
- Gentag PBS vasketrin med mindst en 5 min inkubation per vask. I den sidste vask lade hver brønd i PBS i 1 time.
- Drop en enkelt dråbe (~ 10 ul) af anti-fade montering medier på en glasplade.
- Bøj spidsen af en 19 G 1 ½ i kanylen 90 ° ved at trykke forsigtigt på en hård overflade. Brug én hånd til at holde bøjet nål og forsigtigt løfte et glas disk fra brønden, og brug den anden hånd til at tage fat i disken ved hjælp af skarpe pincet.
- Vend glasset disk &# 160; nedad lade cellen sidekontakt montering medier på objektglas. Anbring forsigtigt glasset disk og lad det tørre natten over i et mørkt sted ved stuetemperatur.
- Fortsæt til billedet immunfluorescens farves nanopodia eller opbevare dias i et dias kasse ved -20 ° C. De slides vil forblive synlige for et par måneder i -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For Trin 1:
Hvis celler (såsom HUVEC og PC3 anvendt i denne undersøgelse) er i stand til at vokse normalt, vil celler tillægger kollagen-belagt skive inden for 30 min efter at de er seedet, polarisere og blive mobile snart bagefter, og udvide nanopodia foran deres sti bevægelighed. 1A og 1B viser en polariseret og prolifererende HUVEC. Figur 2A viser polariserede PC3-celler i en mobil tilstand.
For Trin 2:
Med foropvarmning 4% PFA til 37 ° C, fastsættelse celler ved 37 ° C i 20 min, og blid vask med stuetemperatur PBS cellulære tilstande bør velbevaret. Generelt isoleret individ HUVEC (figur 1A, 1), eller PC3 (figur 2A) celler viser en polariseret morfologi, medmindre cellerne er i tilstanden af celledeling (figur 1B, 1). Intercellulære interaktionerfører til celle krydset dannelse (figur 1C, 1) er også almindeligt forekommende. Nanopodia skal vises på cellen periferien og F-actin vil ofte være til stede i dele af nanopodia proximalt til cellen. Kolde temperaturer forårsager F-actin til at trække tilbage i celler forlader bag nanopodia membran kanaler. Suboptimal temperatur som vist i eksemplerne ved anvendelse af 4 ° C PFA fiksering og kold PBS vask, vil forstyrre og ødelægge nanopodia struktur polariserede celler (figur 1A, 2), prolifererende celler (Figur 1B, 2), kunstigt producere huller i intercellulære junctions (figur 1C, 2).
For Trin 3:
Mange membranbundne proteiner, herunder TM4SF1 er meget følsomme over for Triton X-100 og vil blive fjernet fra celleoverfladen, hvis koncentration er højere end 0,03% anvendes 2,3. For at bevare de fleste af celleoverfladen TM4SF1 PFaste FA celler bør kun behandles med 0,01% Triton X-100 indeholdende blokerende buffer i en time før der skiftes til anti-TM4SF1 primært antistof, der er blevet fortyndet i en regelmæssig blokeringspuffer, der ikke indeholder Triton X-100. Da nanopodia er tynde og lange membran fremskrivninger og vedhæfte til matrix gennem TMED vil TMED intensitet sandsynligvis nødt til at blive styrket gennem lysstyrke og kontrast funktioner i billedbehandling software som Photoshop for at afsløre og spore stien celle bevægelse gennem nanopodia rester (figur 1, 2 mellemværker).
Figur 1. Nanopodia fremskrivninger under endothelcelle bevægelse, celledeling, og krydset dannelse. HUVEC var frisk dyrket i 6 timer after udpladning ved 60% konfluens på collagen-coatede glasplade. Cellerne blev fikseret ved hjælp af (1) den modificerede metode, hvor celler blev fikseret i 37 ° C 4% PFA direkte uden forvask i PBS og anbragt i et 37 ° C inkubator i 20 min fiksering tid, eller (2) en konventionel farvningsprocedure metode hvor cellerne blev vasket med stuetemperatur PBS to gange og fikseret i 4% PFA i 20 minutter ved stuetemperatur. Nanopodia tynde og lange membran udvidelser, der er markeret med en intermitterende, stribede mønster af TMED (hvide pile), og som ofte omgiver phalloidin-farvede F-actin (lyserøde pile) i portioner proximalt til cellen, blev immunfluorescens farvet under anvendelse anti-TM4SF1 Ab. Tre repræsentative HUVEC billeder blev taget til fange for at vise udseendet af nanopodia under (A) polarisering, (B) celledeling, og (C) intercellulære krydset dannelse. Indsatsbokse viser højere forstørrelser af nanopodia. Under polariseret (A) eller retracted cellulære stater (B, C) blev nanopodia fremskrivninger konserveret ved direkte fastsættelse celler i 37 ° C PFA, mens de strukturer i vid udstrækning blev fjernet ved vask og fastsættelse af cellerne i stuetemperatur PBS og PFA. (C) 37 ° C PFA fiksering bevarer intercellulære junctions (blå pile), mens kryds bliver forstyrret af koldere temperaturer, der forårsager celler til at trække, hvilket skaber en kløft mellem celler bro ved nanopodia, hvoraf de fleste indeholder F-actin (pink pile) og nogle ikke (hvide pile) Klik her for at se større billede.
Figur 2. Nanopodia påvise retning PC3 tumorcelle bevægelse. (A)PC3-tumorceller blev frisk dyrket i 6 timer efter udpladning ved 60% konfluens på collagen-coatede glasplade. Celler blev fikseret direkte på 37 ° C 4% PFA og anbragt i et 37 ° C inkubator i 20 min for at bevare nanopodia. Nanopodia (hvide pile) og F-actin (lyserøde pile) var immunfluorescens farves ved hjælp af anti-TM4SF1 Ab og phalloidin hhv. Det indsatte boks viser nanopodia ved højere forstørrelse. Denne repræsentant billede viser, at TM4SF1 udtryk i PC3-celler er heterogene; et PC3 celle med stærke TM4SF1 farvning (gul pil), der produceres lange nanopodia og er omgivet af to svagt TM4SF1-farvede PC3-celler (røde pile). Nanopodia rester på bagkanten (IB) angiver retningen af PC3 celle bevægelse under 6 timer cellekultur periode. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Visualisering af nanopodia gennem tetraspanin CD9. (A) HUVEC var frisk dyrket i 6 timer efter udpladning ved 60% konfluens på en collagen-coatede glasplade. Cellerne blev fikseret i 37 ° C 4% PFA og nanopodia (hvide pile), blev åbenbaret gennem anti-CD9 Ab. F-actin (lyserøde pile) blev farves med phalloidin. Denne repræsentant billede viser, at CD9 også lokaliseres nanopodia. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopodia er tynde cellulære membran kanaler, der fast lægger til matrix gennem TMED og kan strække sig mere end 100 um fra et polariseret mobil celle til at fornemme miljøet og mægle intercellulære interaktioner 2,3. Nanopodia overholde matrix så fast, at rester efterladt som celle bevæger sig væk (fig. 1 og 2). Nanopodia derfor tillade os at studere, hvordan celler fornemmer deres omgivelser og bestemme stien celle bevægelse, og hvordan genekspression eller narkotikabehandling ændringer bevægelse. På grund af skrøbelighed disse tynde (100-300 um bredde) membranstrukturer, skal forsigtighed dog skal tages med henblik på at bevare dem.
For at trofast optage cellulære aktiviteter uden at forstyrre nanopodia, og at undersøge, hvordan eksperimentelle betingelser påvirker nanopodia aktiviteter og stien til celle bevægelse, skal man først kontrollere, at cellerne vokser effektivt i komplet medium før puuing eksperimentet. Normale sunde primære endotelceller, såsom HUVEC, vil frisk EGM2-MV komplet dyrkningsmedium normalt opdele cirka hver 18 timer i løbet af deres log-fase af vækst inden for seks passager af deres kultur. Man bør undgå brugen af HUVEC der er større end passage-6 da et større antal passage vil føre til øget antal af ældede eller binuclear celler i kultur 7 og vil påvirke cellernes evne til at polarisere og producere nanopodia 2.. PC3 prostata tumorceller er mere stabile til kulturer (upubliceret observation), men man bør stadig undgå brug af celler mere end ti passager fra deres fjernelse fra frossen tilstand.
Sunde adhærente celler vil typisk tillægger collagenovertrukne diske inden for de første 30 minutter efter de er seedet, fulgte snart bagefter ved celle polarisering. Således bør man forvente at se de fleste endotelceller i polariserede tilstand ved udgangen af den første times inkubation. Hvis enStørstedelen af endotelceller ikke tillægger glasoverfladen, og derefter kontrollere, om (a) collagen har passeret udløbsdatoen, (b) trypsinisering under cellehøst var for strenge, eller (c) celler er usundt. PC3-celler polarisere langsommere end endotelceller, men bør udvise en polariseret morfologi indenfor 2 timer efter såning. Hvis der opstår forurening i kultur, derefter undersøge, om glas diske eller tang var korrekt steriliseret. Alternativt kan man overveje at bruge kammer dias; protokollen beskrevet her foreslår anvendelsen af glas-diske i 24-brønds dyrkningsplader med henblik på at spare omkostninger og lettere at håndtere et stort antal af prøver.
Konventionelle immunfarvning metoder, brug af PBS for at vaske cellerne, før du tilføjer stuetemperatur fiksativ, let forstyrre fine cellulære strukturer som nanopodia og vil ødelægge dem under farvning processen. Dette skyldes i høj grad det faktum, at fysiske belastninger som temperatursvingninger under celle fixatipå eller streng PBS vask under farvning processen er de vigtigste årsager til fragmentering eller fjernelse af nanopodial strukturer. Med tre enkle metodologiske ændringer - (i) ikke forstyrrer cellepolarisering tilstand ved vask med PBS før fiksering, (ii) løse celler direkte i 37 ° C forvarmet PFA og inkuberes cellerne ved 37 ° C under fiksering, og (ii) forsigtigt vaske celler i stuetemperatur PBS - nanopodia er stort set bevaret Figur 1 viser, hvordan PFA og PBS temperaturer påvirker bevarelse af nanopodia i dyrkede endotelceller, Figur 2A viser, at TM4SF1 udtryk er heterogen i PC3-celler, og at celler med det stærkeste TM4SF1 farvning vise længst. nanopodia. Temperaturen er kendt for at påvirke F-actin aktiviteter og tubulin integritet 8,9. Således fastsættelse celler ved samme temperatur, hvor cellerne blev dyrket (det er 37 ° C i protokollen beskrevet her) vil sandsynligvis bedre kunne fastholde den polariserede cellulære tilstand (
PFA er ikke det eneste reagens, der anvendes i fiksering; organiske opløsningsmidler, såsom methanol, ethanol og acetone anvendes også ofte i cellefiksering til immunfarvning 10.Den bedste fixativ ofte besluttet af epitop placeringen af et specifikt antistof, der anvendes i farvning (upublicerede data). For anti-humant muse TM4SF1 antistof, der genkender ekstracellulære domæner af TM4SF1 (Millipore, anvendt i denne undersøgelse), PFA er den eneste fikseringsmiddel som afslører TMED i immun-farvning, hvilket indikerer, at andre organiske opløsningsmidler ødelægger epitopen. I modsætning hertil, kanin-anti-humant TM4SF1 polyklonalt antistof fra Acris (data ikke vist), hvis epitopen ligger i atten aminosyrer nær den N-terminale region, virker også med ethanol fikserede celler. Imidlertid betyder Acris antistof ikke give god TM4SF1 farvning, sandsynligvis fordi den N-terminale epitop optaget af TM4SF1 interaktioner med cytosolisk molekyle (r), som delvis dækker epitop.
Triton X-100 er et ikke-ionisk overfladeaktivt middel og er ofte anvendt i immun-farvning med henblik på permeabilisering cellemembranen og reducere overfladespændingen af vandige opløsninger 11,12. However, denne evne bringer også risikoen for solubilisering membranproteiner. TM4SF1 er fjernet fra celleoverfladen af Triton X-100-koncentrationer over 0,05% 2,3. Af denne grund er der kun en 1-timers behandling med 0,01% Triton X-100 før tilsætning af primært antistof, der anvendes i den her beskrevne fremgangsmåde. Denne behandling permeabiliserer membranen nok til, at peri-nuklear TM4SF1 at være godt vurderes af antistoffer, og samtidig bevare de TM4SF1 på cellemembranen. For dobbelt farvning af TM4SF1 med proteiner placeret i kernen, bruge 0,03% Triton X-100 i præinkubation tidspunkt, hvis 0,01% ikke Triton ikke. Dette vil lette Triton X-100 punktering af kernemembranen.
TM4SF1 er meget specifikke for endotelceller og tumorceller; de fleste andre celletyper enten ikke udtrykker TM4SF1 eller udtrykke det på et meget lavt niveau 2,3. Men, klassiske tetraspanins - en familie, der omfatter treogtredive medlemmer including CD9, CD81 og CD151 - er ubikvitært udtrykt 6, og kan også findes i membran domæner nanopodia 2,3 (figur 3A). Således kan farvning klassiske tetraspanins gennem samme immun-farvning metode til TM4SF1 muliggøre undersøgelser af nanopodia i celletyper, som ikke udtrykker TM4SF1. PC3 tumorceller, der udtrykker TM4SF1 stærkt tendens til at bevæge kontinuerligt i en enkelt retning, mens PC3 celler, der svagt udtrykker TM4SF1 ikke har en klart defineret retning af bevægelse (figur 2A og upublicerede data). TM4SF1 udtryk niveau i tumorceller er kendt for at være korreleret med deres metastatiske potentiale 13, og undersøgelser er i øjeblikket i gang forbinder tumorceller evne til at udtrykke TM4SF1 og producere nanopodia til deres metastatiske potentiale.
Sammenfattende beherskelse af effektive metoder til farvning nanopodia giver efterforskerne at spore vej celle bevægelse gennem nanopodia residues, studere, hvordan celler fornemmer deres omgivelser bevægelse, hvordan celle bevægelse er modificeret ved ændring af ekspressionsniveauerne af gener (enten overekspression eller knockdown af gener af interesse) for. Nanopodia repræsentere et nyt værktøj til undersøgelse af celle polarisering og celle bevægelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi anerkender Dr. Harold Dvorak for nyttige drøftelser, herunder forslaget om at prøve fiksering i 37 ° C PFA. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud P01 CA92644 og af en kontrakt fra National Foundation for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E.
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
