Summary
Nanopodia sind dünn, aber empfindlichen Membrankanäle, die sich bis 100 um von führenden Vorder-oder Hinter Rückseite einer Zelle und spüren die zelluläre Umgebung. Direktbefestigung auf 37 ° C, sanftes Waschen und Vermeidung von organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol oder Aceton und höherer Triton X-100-Konzentrationen sind erforderlich, um diese Zellstrukturen zu beobachten.
Abstract
Adhärenten Zellen in Kultur pflegen einen Polarisationszustand, um Bewegung und interzellulären Interaktionen unterstützen. Nanopodia sind dünne, längliche, weitgehend F-Actin-negative Membran Projektionen in Endothel-und Krebszellen, die durch TM4SF1 (Transmembrane-4-L-Sechsfamilien-1) Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden kann. TM4SF1 Cluster in 100-300 &mgr; m Durchmesser TMED (TM 4SF1 e nriched Mikro omains d), die 3 bis zu 14 einzelne TM4SF1 Molekülen. TMED intermittierend entlang nanopodia in einem regelmäßigen Abstand von 1 bis 3 μ m pro TMED und fest zu verankern, um nanopodia Matrix angeordnet sind. Dies ermöglicht nanopodia mehr als 100 μ m von der Vorderfront oder Nachlauf polarisierten Endothelzellen oder Tumorzellen erstrecken, und bewirkt Membranreste hinter auf matr überlassenix, wenn die Zelle sich bewegt. TMED nanopodia und wurden aufgrund ihrer extremen Zerbrechlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Temperaturübersehen worden. Routine Waschen und Fixierung stören die Struktur. Nanopodia durch direkte Fixierung in Paraformaldehyd (PFA) bei 37 º C aufbewahrt, gefolgt durch kurze Exposition gegenüber 0,01% Triton X-100 vor der Färbung. Nanopodia neue Perspektiven zu öffnen in der Zellbiologie: sie versprechen, unser Verständnis, wie Zellen ihre Umwelt wahr neu zu gestalten, zu erkennen und zu identifizieren anderen Zellen in einem Abstand, initiieren interzellulären Wechselwirkungen an engen Kontakt, und der Signalmechanismen in Bewegung, Proliferation und Zell -Zell-Kommunikation. Die, die für das Studium TM4SF1 abgeleitete nanopodia entwickelt werden Verfahren kann für die Studien von nanopodia, die in anderen Zelltypen durch die Vermittlung von klassischen Tetraspaninen, insbesondere des ubiquitär exprimiert CD9, CD81 und CD151 zu bilden.
Introduction
Während Polarisation für Bewegung, Tierzellen erstrecken sich über eine Vielzahl von dynamischen, Membran Vorsprünge von ihren Oberflächen, einschließlich Filopodien, Lamellipodien, Rückzug Fasern und Rüschen ein. Kürzlich zu dieser Liste hinzugefügt nanopodia eine neu erkannte Art von dünnen (100-300 um Durchmesser), längliche (bis zu 50-100 um lang) Membran Projektion, die Membrankanäle für die Erweiterung der F-Aktin Strukturen wie Filopodien stellen waren und Zurückziehen Faser, und das Flecken positiv mit TM4SF1 (Transmembran-4-L-sechs-Familie-1) in kultivierten Endothelzellen und Tumorzellen 2,3.
TM4SF1 ist ein Protein mit tetraspanin artige Topologie, das ursprünglich als ein Tumorzellantigen 4 vor der Entdeckung, dass das Molekül ein Endothelzellen-Biomarker, die eine wesentliche Rolle bei der Endothelzellenproliferation und-migration 2,3 spielt bekannt war. Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass TM4SF1 wird lokalisiert, um perinucLear Vesikel mit der Plasmamembran und in TM 4SF1 e nriched Mikro d omains (TMED) angereichert. TMED Anker nanopodia zu Matrix und in regelmäßigen Abständen von 1-3 gebändert Muster TMED / um Länge nanopodia vorhanden. Nanopodia erstrecken sich typischerweise von führenden vor einer Zelle und Nachlauf während der Zellpolarisation für Bewegung. Aufgrund der Natur der Firma haft TMED sind nanopodia nicht wieder in die Zelle zurückziehen, wie es sich bewegt; aufgegeben nanopodia Rückstände so verfolgen den Weg der Zellbewegung. Nanopodia Membrankanäle für die F-Aktin-und Ausfahren zu schaffen, und sind Websites der interzellulären Interaktion und Kommunikation 2,3. Diese Eigenschaften bedeuten, dass nanopodia eine einzigartige Gelegenheit, um die Mechanismen F-Actin-Montage während der Zellpolarisation, Zellerkundung der Umwelt, die Bestimmung der Weg und die Richtung der Zellbewegung und interzellulären Interaktionen zugrunde liegenden Studie liefern einnd-Kommunikation.
Aufgrund der stark hydrophoben Natur TMED und der dünnen und zerbrechlichen Natur des häutigen nanopodia, braucht besondere Pflege, um TMED und nanopodia bewahren genommen werden. Die Zerstörung und Entfernung von nanopodia TMED durch gemeinsame Labormethoden ist ein möglicher Grund, warum nur dreiundsechzig Publikationen auf TM4SF1 seit seiner ersten Entdeckung im Jahr 1986 ein und für den kompletten Mangel an Wissen über TM4SF1 Bereicherung in 100-300 um auf Mikrodomänen erschienen der Zelloberfläche, bis der Bericht der TM4SF1 in Endothelzellen in 2009 2.
Konventionelle Methoden verwenden Immunfärbung häufig organische Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol oder Aceton, um Zellen zu reparieren und zu verwenden 0,1% oder höher Triton X-100-Konzentration auf Zellen permeabilisieren 5. Hier beschriebenen Studien implementiert drei wichtige Änderungen der herkömmlichen Methode zu zeigen, TMED und nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA und fixieren Zellen in einer 3776, C-Inkubator, (ii) gelten sanfte Raumtemperatur PBS waschen, und (iii) weniger als 0,03% Triton X-100 nur kurz, um Zellen permeabilisieren vor der Zugabe des primären Antikörpers, wie Triton X-100 höher als 0,03% wird extrahiert TM4SF1.
Alle Tetraspaninen bilden Mikrodomänen auf der Zellmembran 6 und einige kolokalisiert mit TMED in Endothelzellen und Tumorzellen 2,3. Wie Tetraspaninen wie CD9, CD81 und CD151 sind ubiquitär exprimiert, kann die hier beschriebenen Färbungsprotokoll zu vielen verschiedenen Zelltypen, die TM4SF1 fehlt für die Studien von nanopodia Funktion erweitert werden.
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Protocol
1. Zellkultur auf Collagen Beschichtete Glasplatten
- Platz Glasplatten (12 mm Durchmesser) in einem Glas (4 oz) und Autoklav, um die Scheiben zu sterilisieren.
- Setzen Sie 25 ml 70% Ethanol in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und legen Sie sie in einer Zellkultur Kapuze. Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden, bis der Pegel der Lösung auf 20 ml sinkt.
- Legen Sie ein scharfe Zange mit einer extra feinen Spitze in der 70% Ethanol für 5 Minuten, bevor Sie es auf die Glasscheibe zu behandeln.
- Entfernen Sie vorsichtig die Zange aus dem Rohr, und schließen Sie den Deckel, dann vorsichtig platzieren Sie die Ethanol behandelt Zange auf dem Rohr an der Luft trocknen für 2 min. Lassen Sie die Spitze der Zange, um alles in der Haube berühren.
- Mit den sterilen Pinzette einem sterilen Glasplatte aus dem Glas zu greifen und es in eine Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte. Wiederholen, bis die gewünschte Anzahl von Vertiefungen hat, mit Scheiben besiedelt.
- Geben Sie 500 ul Rinderkollagenlösung (50 ng / ml) in jede Vertiefung, die eine Glasplatte enthält und es in einem 37 ° C, 5% CO 2 Zellkulturbrutschrank für mindestens 30 min. Es schadet nicht, in einer längeren Inkubationszeit.
- Ernte HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) oder PC3 (Prostata-Tumorzellen), die bereits in 150 mm-Zellkulturplatte durch Trypsinierung angebaut wurden, und blockieren die Trypsin-Aktivität mit seiner kompletten Kulturmedium. Sammeln Sie Zellen in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen.
- Zählen Sie die Anzahl von Zellen und sicherzustellen, dass die Überlebensfähigkeit von mehr als 90% ist.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
- Verwenden des Kulturmediums, um die Zellen zu 10 5 Zellen / ml zu verdünnen. Zeigen Zellen auf Eis.
- Absaugen Kollagen in Zellkulturhaube und sanft Ort 500 ul Zellsuspension zu jeder Vertiefung, in der Glasscheiben wurden mit Kollagen vorbeschichtet ist. 5 x 10 4 Zellen / Well in 24-Well-Platte geben wird, 60% confluency für HUVEC und 30% Konfluenz für PC3-Zellen. Hinweis: fügen Sie mehr Zellsuspension für höhere Zelldichte.
- Kultur die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 1 h, 2 h, 4 h, 6 h oder 24 h bis nanopodia Aktivitäten und Zellpassage zu verfolgen. Typischerweise werden die Zellen auf die Glasscheibe in der ersten 30 Minuten anzubringen, dann anfangen zu polarisieren und wandern in der ersten Stunde, und durchzuführen, die interzelluläre Wechselwirkungen und die Zellteilung in den folgenden Stunden.
2. Zellfixierung
- Jedes der gut brauchen 500 ul 4% PFA (Paraformaldehyd), um die Zellen zu fixieren. Entweder kommerziell hergestellt oder frisch zubereiteten 4% PFA verwendet werden. Berechnen der Menge des PFA bezogen auf die Anzahl von Vertiefungen hergestellt benötigt, und legen PFA in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen. ACHTUNG: Para steht im Verdacht, krebserregend.
- Setzen Sie die Falcon-Röhrchen in einem Styropor-Stand, der bereits in einem 37 ° C-Inkubator war. Lassen Sie das Rohr in den Brutschrank für 30 Minuten in den Kriegm die PFA bis 37 ° C
- Legen Sie ein Heizkissen in der Kultur Haube und schalten Sie ihn ein.
- Nehmen Sie die 24-Loch-Zellkulturplatte und den vorgewärmten PFA aus dem Inkubator und legen Sie es auf dem Heizkissen.
- Mit einer Hand das Medium von einem gut absaugen, und sofort nach der mit der anderen Hand sanft gleiten PFA 500 ul in die gut durch die Wannenkante. Zur leichteren Absaugen, kippen Sie die Kulturplatte bei etwa 45 °, lehnte sie gegen die Styropor-Stand, so dass es in diesem Winkel stabil. Dadurch wird das Absaugen und Zugabe von PFA Lösung der gut ohne die Zellen in Kultur zu stören erleichtern. Dies ist der wichtigste Schritt die ursprüngliche Zellstruktur Zellaktivitäten zu erhalten.
- Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Vertiefungen mit einer Glasscheibe haben PFA erhalten. Hinweis: Alle Schritte, die zu bereits bestehenden Lösung aus der auch ändern müssen, ist selbe Streben Verfahren anzuwenden.
- Die Platte wird in 37 ° C für 5 min. Nehmen Sie die Platte zurück in die Kultur Kapuze und kippen gegen Styropor, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Mit einer Hand sanft überweisen Sie den PFA aus dem Brunnen in ein Sammelrohr; mit der anderen Hand, um gleich darauf legen mindestens 500 ul PBS Raumtemperatur in den Brunnen. Nachdem alle Brunnen gewaschen wurden, zurück und wiederholen den PBS-Wasch noch einmal in jeden gut. Leeren Sie die gesammelten PFA in eine gefährliche Abfallbehälter.
- Vorbereitung ICC Blockierungspuffer durch Zugabe von 2% fötalem Rinderserum zu PBS. 0,04% Natriumazid (von 20% Stammlösung verdünnt) als Konservierungsmittel zugesetzt. ACHTUNG: Natriumazid ist eine giftige Verbindung. Der Puffer kann in 4 ° C für eine lange Zeitdauer ohne bakterielle Kontamination gespeichert werden.
- Mit der Kulturplatte noch vor einem Stand durch jeden gut zu PBS Absaugen entfernen und sofort danach Zugabe von 500 ul von ICC-Blockierungspuffer gekippt, wieder Zyklus. Die Zellen sind nun bereit für Immunfluoreszenzfärbung. Falls erforderlich, diefixierten Zellen in einem 4 ° C Kühlraum für eine Woche ohne wesentlichen Verlust an Protein TM4SF1 gespeichert werden.
3. TM4SF1 Immunfluoreszenz-Färbung von Nanopodia
- In jede Vertiefung, ersetzen Sie das ICC 500 ul Blockierungspuffer mit einem neuen Blockierungspuffer mit 0,01% Triton X-100 und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 1 Stunde sitzen. Verwenden Sie nicht mehr als 0,03% Triton X-100, wie es TM4SF1 aus Zellmembranen zu entfernen. PBS gewaschenen Zellen aus Schritt 2.10 kann direkt auf die Blockierungspuffer Triton bewegt werden, wenn die Färbung bereit, sofort gestartet werden.
- Verdünnte Primäranti TM4SF1 (oder Anti-CD9) Antikörper bis 0,5 ug / ml in Blockierungspuffer ICC.
- In jede Vertiefung, entfernen Sie die ICC/0.01% Triton-Puffer und ersetzen Sie es mit 300 ul der Anti-TM4SF1-Antikörperlösung. Inkubation 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht verlassen bei 4 ° C
- Waschen Sie jede Vertiefung mit nicht weniger als 500 ul PBS. 3x wiederholen; jedes Mal geben bei least 5 min Inkubationszeit.
- Vorbereitung eines sekundären Antikörpers und Phalloidin-Lösung in ICC Blockierungspuffer unter Verwendung einer 1000-fachen Verdünnung von Alexa 488 markierten Esel-anti-Maus-Sekundär-Antikörper (2 &mgr; g / ml Endkonzentration) und 1000 x Verdünnung Phalloidin (50 ng / ml Endkonzentration).
- Entfernen PBS und 300 ul des sekundären Antikörpers und Phalloidin Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 2 Stunden oder lassen Sie es über Nacht bei 4 ° C
- Wiederholen PBS Waschschritten mit mindestens 5 min Inkubation pro Waschgang. In der letzten Waschung, lassen jede Vertiefung in PBS für 1 Stunde.
- Werfen Sie einen einzigen Tropfen (~ 10 ul) von Anti-Fade-Montagetechnik auf einem Glasträger.
- Biegen Sie die Spitze einer 19 G 1 ½ Spritzennadel in 90 °, indem Sie sanft auf eine harte Oberfläche. Mit einer Hand gebogenen Nadel zu halten und heben eine Glasscheibe aus dem Brunnen, und mit der anderen Hand, um die Scheibe zu erfassen mit den scharfen Pinzette.
- Drehen Sie die Glasscheibe &# 160; Gesicht nach unten lassen die Seitenkontaktzelle die Montagetechnik auf dem Objektträger. Legen Sie vorsichtig die Glasscheibe und lassen Sie es über Nacht trocknen an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur.
- Fahren Sie mit dem Bild Immunfluoreszenz gefärbt nanopodia oder die Folien in einer Dia-Box bei -20 ° C Die Bilder werden sichtbar für ein paar Monate in -20 ° C bleiben
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Representative Results
Für Schritt 1:
Wenn Zellen (wie HUVEC und PC3 in dieser Studie verwendet) sind in der Lage, normal zu wachsen, werden Zellen, die mit Kollagen beschichteten Platte innerhalb von 30 min zu befestigen, nachdem sie ausgesät sind, zu polarisieren und zu mobilen bald danach, und erstrecken sich nanopodia vor ihrem Weg Bewegungs. Fig. 1A und 1B jeweils eine polarisierte oder proliferierende HUVEC. 2A zeigt polarisierten PC3-Zellen in einem mobilen Zustand.
Für Schritt 2:
Vorwärmung mit 4% PFA bis 37 ° C, Fixierung von Zellen bei 37 ° C für 20 min und vorsichtiges Waschen mit PBS, Raumtemperatur, zelluläre Zustände sollten gut konserviert werden. Generell isolierten Einzel HUVEC (Abbildung 1A, 1) oder PC3 (2A)-Zellen wird eine polarisierte Morphologie zeigen, es sei denn Zellen sind im Zustand der Zellteilung (1B, 1). Die interzelluläre Wechselwirkungenwas zu Zell Übergang Bildung (1C, 1) sind ebenfalls häufig beobachtet. Nanopodia sollte auf der Zellperipherie auftreten, und F-Actin oft in Abschnitten des nanopodia proximal der Zelle vorhanden sein. Kalte Temperaturen führen zu F-Actin, um wieder in Zellen hinter nanopodia Membrankanäle zurückzuziehen. Suboptimale Temperatur, wie in den Beispielen 4 ° C mit PFA-Fixierung und kaltem PBS Wasch gezeigt wird stören und zerstören nanopodia Struktur in polarisierten Zellen (Abbildung 1A, 2), wuchernden Zellen (Abbildung 1B, 2) und künstlich Lücken an interzellulären Verbindungen erzeugen (Fig. 1C, 2).
Für Schritt 3:
Viele Membran-gebundene Proteine, einschließlich TM4SF1 sehr empfindlich auf Triton X-100 und wird von der Zelloberfläche entfernt werden, wenn Konzentrationen von mehr als 0,03% verwendet werden 2,3. Um die meisten der Zelloberfläche TM4SF1, P bewahrenFA fixierten Zellen nur mit 0,01% Triton X-100 enthaltenden Blockierungspuffer für eine Stunde vor dem Wechsel zum Anti TM4SF1 primären Antikörper, der in einem regulären Blockierungspuffer, der Triton X-100 nicht enthält, verdünnt wurde, behandelt werden. Wie nanopodia sind dünn und lang Membran Projektionen und heften sich durch TMED Matrix wird TMED Intensität wahrscheinlich benötigen, um durch Helligkeit und Kontrast Funktionen in Bildbearbeitungssoftware wie Photoshop, um durch nanopodia Reste verraten und verfolgen den Weg der Zellbewegung (Abbildung verbessert werden 1, 2 Einschübe).
Fig. 1 ist. Nanopodia Projektionen während der endothelialen Zellbewegung, Zellteilung und Bildung Kreuzung. HUVEC wurden für 6 Stunden afte frisch kultiviertenr Plattieren bei 60% Konfluenz auf Kollagen-beschichteten Glasplatte. Zellen wurden unter Verwendung von (1) Verfahren, bei dem das modifizierte Zellen wurden in 37 ° C direkt ohne Vorwäsche PBS 4% PFA fixiert, und in einem 37 ° C-Inkubator während 20 min Fixierungszeit, oder (2) einem herkömmlichen Färbungsverfahren platziert fest wobei die Zellen mit PBS zweimal Raumtemperatur in 4% PFA für 20 min bei Raumtemperatur gewaschen und fixiert. Nanopodia, dünnen und langen Membran-Erweiterungen, die durch eine intermittierende, gebändert Muster der TMED (weiße Pfeile) markiert sind, und dass oft umschließen Phalloidin-gefärbten F-Aktin (rosa Pfeile) in Portionen proximal der Zelle wurden Immunfluoreszenz gefärbt mit Anti-TM4SF1 Ab. Drei repräsentative HUVEC Bilder wurden eingefangen, um das Aussehen nanopodia während (A) Polarisation, (B) Zellteilung, und (C) interzelluläre Verbindung Bildung zeigen. Insetboxen zeigen höhere Vergrößerungen von nanopodia. Während polarisiert (A) oder retracted zelluläre Zustände (B, C) wurden die nanopodia Vorsprünge durch direktes Fixieren Zellen in 37 ° C PFA erhalten, während die Strukturen weitgehend durch Waschen entfernt und die Fixierung der Zellen in PBS, Raumtemperatur und PFA. (C) 37 ° C PFA Fixierung bewahrt interzellulären Verbindungen (blaue Pfeile), während Übergänge von kälteren Temperaturen, die Zellen veranlassen, sich zurückzuziehen gestört ist, dass eine Lücke zwischen Zellen durch nanopodia von denen die meisten F-Aktin (rosa Pfeile) überbrückt und einige nicht (weiße Pfeile) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Nanopodia die Richtung der PC3 Tumorzellbewegung demonstrieren. (A)PC3-Tumorzellen wurden frisch für 6 Stunden nach dem Ausstreichen bei 60% Konfluenz auf Kollagen-beschichtete Glasplatte kultiviert. Die Zellen wurden direkt in 37 ° C 4% PFA fixiert und in einem 37 ° C Inkubator für 20 min auf nanopodia erhalten platziert. Nanopodia (weiße Pfeile) und F-Aktin (rosa Pfeile) waren Immunfluoreszenz gefärbt mit Anti-TM4SF1 Ab und Phalloidin auf. Der Einschub Box zeigt nanopodia bei höherer Vergrößerung. Dieses Bild zeigt, dass Vertreter TM4SF1 Ausdruck in PC3-Zellen ist heterogen; ein PC3 Zelle mit starken TM4SF1 Färbung (gelber Pfeil) erzeugt lange nanopodia und wird durch zwei schwach TM4SF1-gefärbten PC3-Zellen (rote Pfeile) umgeben ist. Nanopodia Rückstände an der Hinterkante (ib) geben die Richtung der PC3 Zellbewegung während der 6 Stunden Zellkultur Zeitraum. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Visualisierung von nanopodia durch Tetraspanin CD9. (A) HUVEC wurden nach der Beschichtung bei 60% Konfluenz auf einem Kollagen-beschichtete Glasplatte für 6 Stunden frisch kultiviert. Zellen wurden fixiert in 37 ° C 4% PFA und nanopodia (weiße Pfeile) wurden durch anti-CD9 Ab ergab. F-Aktin (rosa Pfeile) wurde mit Phalloidin gefärbt. Diese repräsentative Bild zeigt, dass CD9 lokalisiert auch nanopodia. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Nanopodia sind dünne Zellmembran Kanäle, die fest an, um durch TMED Matrix und kann mehr als 100 um aus einer mobilen Zelle polarisiert, um die Umwelt zu erfassen und zu vermitteln interzellulären Wechselwirkungen 2,3 verlängern. Nanopodia haften so fest, dass die Rückstände hinter wie die Zelle bewegt sich nach links Matrix (Abbildungen 1 und 2). Nanopodia damit es uns ermöglichen, zu untersuchen, wie Zellen ihre Umwelt spüren und bestimmen den Weg der Zellbewegung, und wie Genexpression oder medikamentöse Behandlung Änderungen Bewegung. Aufgrund der Zerbrechlichkeit dieser dünne (100-300 um Breite) Membranstrukturen, ist Vorsicht jedoch, um sie zu bewahren genommen werden.
Um treu Zellaktivitäten aufnehmen, ohne zu stören nanopodia, und zu untersuchen, wie Versuchsbedingungen beeinflussen nanopodia Aktivitäten und den Weg der Zellbewegung, sollte man zuerst überprüfen, ob Zellen effektiv wachsen in Vollmedium vor pursuing das Experiment. Normale gesunde primären Endothelzellen, wie HUVEC, in frischem EGM2-MV komplette Kulturmedium wird in der Regel etwa während ihrer logarithmischen Wachstumsphase teilen alle 18 Stunden innerhalb von sechs Passagen ihrer Kultur. Man sollte die Verwendung von HUVEC, die größer als Passage-6 die höheren Zahlen Durchgang zu einer erhöhten Zahl von seneszenten oder zweikernigen Zellen in Kultur 7 führen und Zellen die Fähigkeit zu polarisieren und produzieren nanopodia 2 beeinflussen zu vermeiden. PC3 Prostata-Tumorzellen sind stabiler Kulturen (unveröffentlichte Beobachtung), aber man sollte immer noch die Verwendung von Zellen über zehn Passagen aus der Entfernung aus dem gefrorenen Zustand zu vermeiden.
Gesunde adhärenten Zellen werden in der Regel zu befestigen, um Kollagen-beschichteten Scheiben innerhalb der ersten 30 Minuten, nachdem sie ausgesät werden, folgten bald danach durch Zellpolarisation. Somit sollte man erwarten, dass die meisten Endothelzellen in einem polarisierten Zustand am Ende der ersten Stunde der Inkubation sehen. Wenn eineMehrheit der Endothel-Zellen nicht auf der Glasoberfläche zu befestigen, dann überprüfen Sie, ob (a)-Kollagen hat sein Verfallsdatum überschritten, (b) Trypsinierung während der Zellernte war zu streng, oder (c) Zellen, die ungesund sind. PC3 Zellen polarisieren langsamer als Endothelzellen, sondern einen polarisierten Morphologie innerhalb von 2 h nach dem Aussäen demonstrieren. Wenn Verunreinigungen in der Kultur auftritt, dann prüfen, ob Glasplatten oder Zange ordnungsgemäß sterilisiert wurden. Alternativ kann man prüfen, mit Kammer-Objektträgern; Das hier beschriebene Protokoll schlägt die Verwendung von Glasplatten in 24-Well-Kulturplatten, um Kosten zu sparen und um mehr problemlos eine große Anzahl von Proben.
Herkömmliche Methoden Immunfärbung, die Verwendung von PBS, um Zellen zu waschen, bevor Raumtemperatur Fixiermittel, leicht stören feinen Zellstrukturen wie nanopodia und wird sie während der Färbung zu zerstören. Dies ist vor allem aufgrund der Tatsache, dass körperliche Belastungen wie Temperaturschwankungen während der Zell fixatioder strengen PBS Waschen während der Färbung sind die wichtigsten Ursachen der Fragmentierung oder Entfernung von nanopodial Strukturen. Mit drei einfachen methodischen Änderungen - (i) nicht Zelle Polarisationszustand stören durch Waschen mit PBS vor der Fixierung, (ii) zu fixieren Zellen direkt in 37 ° C vorgewärmt und Inkubation PFA-Zellen bei 37 ° C während der Fixierung, und (ii) vorsichtig waschen Zellen in PBS Raumtemperatur - nanopodia sind weitgehend erhalten Abbildung 1 zeigt, wie PFA und PBS Temperaturen beeinflussen Erhaltung nanopodia in kultivierten Endothelzellen; 2A zeigt, dass TM4SF1 Ausdruck ist heterogen in PC3-Zellen und Zellen mit der stärksten TM4SF1 Färbung zeigt die längste. nanopodia. Temperatur ist bekannt, dass F-Actin-Aktivitäten und Tubulin 8,9 Integrität beeinflussen. Somit Fixierung von Zellen bei der gleichen Temperatur in dem Zellen gezüchtet wurden (dies ist 37 ° C in dem hier beschriebenen Protokoll) ist wahrscheinlich die polarisierten Zellzustand besser zu bewahren (
PFA ist nicht das einzige Reagens Fixierung verwendet; organische Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol und Aceton werden ebenfalls häufig in Zellfixierung für die Immunfärbung 10 verwendet.Die beste Fixierungs wird oft durch die Lage Epitop eines spezifischen Antikörpers in der Färbung (unveröffentlichte Daten) bestimmt. Für die Maus-Anti-Human-Antikörper, der TM4SF1 extrazellulären Domänen des TM4SF1 (Millipore, die in dieser Studie verwendet wird) erkennt, ist die einzige PFA Fixativ die TMED Immunfärbung zeigt, was anzeigt, daß andere organische Lösungsmittel, die das Epitop zerstören. Im Gegensatz dazu arbeitet Kaninchen-Anti-Human-TM4SF1 polyklonalen Antikörpers aus Acris (Daten nicht gezeigt), dessen Epitop in achtzehn Aminosäuren nahe dem N-terminalen Bereich befindet, auch mit Ethanol fixierten Zellen. Allerdings ist die Acris Antikörper keine guten TM4SF1 Färbung, wahrscheinlich, weil die N-terminale Epitop durch TM4SF1 Interaktionen mit cytosolischen Molekül (en), die teilweise das Epitop decken beschäftigt.
Triton X-100 ist ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel und wird häufig in der Immunfärbung mit dem Ziel der Permeabilisierung der Zellmembran und die Verringerung der Oberflächenspannung von wässrigen Lösungen verwendet 11,12. However, bringt diese Fähigkeit auch das Risiko der Solubilisierung von Membranproteinen. TM4SF1 vollständig von der Zelloberfläche durch Triton X-100-Konzentrationen von mehr als 0,05% 2,3 entfernt. Aus diesem Grund wird nur eine 1-Stunden-Behandlung mit 0,01% Triton X-100 vor der Zugabe des primären Antikörpers in dem hier beschriebenen Verfahren verwendet. Diese Behandlung permeabilisiert die Membran genug, um peri-Kern TM4SF1 ermöglichen, auch durch die Antikörper beurteilt werden, unter Wahrung meisten TM4SF1 auf der Zellmembran. Für Doppelfärbung von TM4SF1 mit Proteinen im Zellkern befindet, verwenden Sie 0,03% Triton X-100 in der Vorinkubation der Bühne, wenn 0,01% Triton funktioniert nicht. Dies wird Triton X-100 Stechen der Kernmembran zu erleichtern.
TM4SF1 ist sehr spezifisch für Endothelzellen und Tumorzellen; die meisten anderen Zelltypen entweder nicht äußern TM4SF1 oder Express auf einem sehr niedrigen Niveau 2,3. Allerdings klassischen Tetraspaninen - eine Familie, die dreiunddreißig Mitglieder umfasst including CD9, CD81 und CD151 - ubiquitär exprimiert 6, und kann auch in Membrandomänen in nanopodia 2,3 (3A) gefunden werden. So Färbung klassischen Tetraspaninen durch die für TM4SF1 verwendet dieselbe Immunfärbung Methode kann die Studien nanopodia in Zelltypen, die nicht TM4SF1 exprimieren können. PC3 Tumorzellen, die TM4SF1 auszudrücken hoch neigen dazu, ständig in eine Richtung bewegen, während PC3-Zellen, die schwach auszudrücken TM4SF1 nicht eine klar definierte Bewegungsrichtung (2A und unveröffentlichte Daten) haben. TM4SF1 Expressionsniveau in Tumorzellen ist bekannt, mit ihren 13 metastatischen Potential korreliert werden, und Untersuchungen sind derzeit im Gange Verknüpfung Tumorzellen die Fähigkeit zu TM4SF1 exprimieren und nanopodia ihre metastatische Potential.
Zusammenfassend Beherrschung der effektivsten Methoden zur Färbung nanopodia ermöglicht Ermittler, den Weg der Zellbewegung durch nanopodia Wieder verfolgensidues, zu untersuchen, wie Zellen ihre Umwelt wahr für Bewegung, wie Zellbewegung wird durch Veränderung der Expression von Genen (entweder Überexpression oder Knockdown von Genen von Interesse) modifiziert. Nanopodia stellen ein neues Werkzeug für die Untersuchung der Zellpolarisation und Zellbewegung.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Harold Dvorak für hilfreiche Diskussionen einschließlich der Vorschlag, Fixierung in 37 ° C PFA versuchen. Diese Arbeit wurde vom NIH P01 CA92644 und durch einen Vertrag von der Nationalen Stiftung für Krebsforschung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
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