Summary
Nanopodia är tunna men ömtåliga membrankanaler som sträcker sig upp till 100 nm från en cell ledande främre eller bakre bakåt och känner av den cellulära miljön. Direkt fixering vid 37 ° C, försiktig tvättning, och undvikande av organiska lösningsmedel som etanol, metanol eller aceton, och av högre Triton X-100-koncentrationer erfordras för att observera dessa cellulära strukturer.
Abstract
Vidhäftande celler i kultur upprätthålla ett polariserat tillstånd att stödja rörelsen och intercellulära interaktioner. Nanopodia är tunna, avlånga, mycket F-aktin-negativ membran projektioner i endotel-och cancerceller som kan visualiseras genom TM4SF1 (transmembran-4-L-sex-familj-1) immunofluorescensfärgning. TM4SF1 kluster i 100-300 ìm diameter TMED (TM 4SF1 e nriched mikro d omains) innehållande 3 till så många som 14 olika TM4SF1 molekyler. TMED är intermittent anordnade längs nanopodia vid en jämn delning av 1 till 3 TMED per μ m och fast förankra nanopodia till matrisen. Detta gör nanopodia att förlänga mer än 100 μ m från ledande främre eller bakre baksida polarise endotel eller tumörceller, och orsakar membranrester vara kvar på matrix när cellen rör sig bort. TMED och nanopodia har förbisetts på grund av sin extrema skörhet och känslighet för temperatur. Rutin tvättning och fixering rubba strukturen. Nanopodia bevaras genom direkt fixering i paraformaldehyd (PFA) vid 37 ° C, följt av kort exponering för 0,01% Triton X-100 före färgning. Nanopodia öppnar nya perspektiv i cellbiologi: de lovar att omforma vår förståelse av hur celler känner sin omgivning, upptäcka och identifiera andra celler på avstånd, initiera intercellulära interaktioner vid nära kontakt, och om signalmekanismer som är inblandade i rörelse, spridning, och cell -cellkommunikation. De metoder som är utvecklade för att studera TM4SF1-härledda nanopodia kan vara användbara för studier av nanopodia som bildas i andra celltyper genom förmedling av klassiska tetraspanins, särskilt ubiquitously uttryckt CD9, CD81 och CD151.
Introduction
Under polarisering för rörelse, djurceller förlänga en rad dynamiska, membran utskjutande från sina ytor, inklusive filopodia, lamellipodia, indragnings fibrer, och volanger 1. Nyligen läggas till denna lista var nanopodia, en nyligen erkänd typ av tunna (100-300 nm i diameter), långsträckt (upp till 50-100 ìm långa) membran projektion som ger membrankanalerna för utbyggnaden av F-aktin strukturer såsom filopodia och indragning fiber, och att fläcken positivt med TM4SF1 (transmembran-4-L-sex-familj-1) i odlade endotelceller och tumörceller 2,3.
TM4SF1 är ett protein med tetraspanin liknande topologi som ursprungligen var känd som en tumörcellsantigen 4 innan upptäckten att molekylen är en endotelceller biomarkör som spelar en väsentlig roll i endotelcellproliferation och migration 2,3. Immunofluorescens färgning avslöjade att TM4SF1 är lokaliserad till perinuclear blåsor och till plasmamembranet, och anrikas i TM 4SF1 e nriched mikro d omains (TMED). TMED ankare nanopodia till matris och förekommer i ett regelbundet avstånd randig mönster av 1-3 TMED / um längd nanopodia. Nanopodia sträcker sig vanligtvis från en cell ledande främre och bakre bak under cell polarisering för rörelse. På grund av den fast vidhäftande karaktär TMED, nanopodia inte kan dras tillbaka in i cellen när den rör sig bort; givna nanopodia rester spåra därmed ut vägen för cellrörelse. Nanopodia ge membrankanaler för F-aktin förlängning och indragning, och är områden av intercellulära interaktioner och kommunikation 2,3. Dessa egenskaper gör att nanopodia ger en unik möjlighet att studera mekanismerna bakom F-aktin montering under cellulär polarisering, cellulär avkänning av miljön, bestämning av vägen och riktningen för cellrörelse, och intercellulära interaktioner ennd kommunikation.
På grund av den hydrofoba natur TMED och den tunna och ömtåliga membran natur nanopodia, behöver särskild vård vidtas för att bevara TMED och nanopodia. Förstörelsen av nanopodia och avlägsnande av TMED av vanliga laboratoriemetoder är en möjlig anledning till varför bara sextiotre publikationer har dykt upp på TM4SF1 sedan den första upptäckten 1986 1 och för den totala bristen på kunskap om TM4SF1 anrikning i 100-300 ìm mikroområden på cellytan tills rapporten för TM4SF1 i endotelceller under 2009 2.
Konventionella immunfärgning metoder använder ofta organiska lösningsmedel som etanol, metanol eller aceton för att fixera cellerna och använda 0,1% eller högre Triton X-100 koncentration att permeabilize celler 5. Studier som beskrivs här genomfört tre stora förändringar till den konventionella metoden för att avslöja TMED och nanopodia: (i) använder 37 ° C 4% PFA och fixera cellerna i en 3776; C inkubator, (ii) tillämpa mild rumstemperatur PBS-tvättning, och (iii) använda mindre än 0,03% Triton X-100 endast i korthet att permeabilisera celler före tillsats av primär antikropp, såsom Triton X-100 är högre än 0,03% kommer att extrahera TM4SF1.
Alla tetraspanins bildar mikrodomäner på cellmembranet 6 och några colocalize med TMED i endoteliala celler och tumörceller 2,3. Såsom tetraspanins som CD9, CD81 och CD151 är ubiquitously uttryckt, kan färgningsprotokollet som beskrivs här utökas till många olika celltyper som saknar TM4SF1 för studierna av nanopodia funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling på kollagenbelagda glas Disk
- Placera glasskivor (12 mm i diameter) i en glasburk (4 ml) och autoklaven för att sterilisera de skivor.
- För över 25 ml 70% etanol i en 50 ml Falcon rör och placera den i en cellkultur huva. Denna lösning kan återanvändas flera gånger till dess att nivån av lösningen sänks till 20 ml.
- Placera en vass pincett med en extra fin spets i 70% etanol i 5 minuter innan du använder den för att hantera glasskivan.
- Ta försiktigt bort tången ut ur röret och stäng locket, sedan försiktigt placera etanolbehandlade tången ovanpå röret för att lufttorka i 2 min. Låt inte spetsen på tången för att röra någonting i huven.
- Använd steril pincett för att fånga en steril glasskivan ut ur glasburk och placera det i en brunn på 24-brunnars cellodlingsplatta. Upprepa tills önskat antal brunnar har befolkat med skivor.
- Sätt 500 l av bovint kollagenlösning (50 ng / ml) i varje brunn som innehåller en glasskivan och placera den i en 37 ° C, 5% CO 2 cellkultur inkubator under åtminstone 30 min. Det finns ingen skada i en längre inkubationstid.
- Harvest HUVEC (Human navelvenendotelceller) eller PC3 (prostatatumörceller) som redan odlades i 150 mm cellodlingsplatta genom trypsinization och blockerar trypsin aktivitet med hjälp av dess fullständiga odlingsmedium. Samla cellerna in i ett 15 ml Falcon-rör.
- Räkna antalet celler och se till att lönsamheten är större än 90%.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 200 x g under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten.
- Använd odlingsmediet för att späda cellerna till 10 5 celler / ml. Placera cellerna på is.
- Aspirera kollagen i cellkultur huva och försiktigt placera 500 | il av cellsuspension till varje brunn i vilket glas-skivorna förbelagts med kollagen. 5 x 10 4 celler / brunn i 24-brunnar kommer att ge 60% confluency för HUVEC och 30% sammanflytning för PC3-celler. Obs: lägga till mer cellsuspension för högre celltäthet.
- Kultur cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under 1 timme, 2 timmar, 4 timmar, 6 timmar, eller 24 tim för att spåra nanopodia aktiviteter och cellpassagen. Vanligtvis kommer celler fästa på glasskivan i den första 30 min, sedan börja att polarisera och vandrar i den första timmen, och utför intercellulära interaktioner och celldelning i följande timmar.
2. Cell Fixering
- Varje väl kommer att behöva 500 l 4% PFA (paraformaldehyd) för att fixera cellerna. Antingen kommersiellt tillverkat eller nybakade 4% PFA kan användas. Beräkna mängden PFA behövas baserat på antalet brunnar framställda och placera PFA i en 15-ml Falcon-rör. VARNING: paraformaldehyd är ett misstänkt cancerframkallande.
- Sätt falk rör i en frigolit stativ som redan var på plats i ett 37 ° C inkubator. Låt röret i inkubatorn i 30 min till krigm upp PFA till 37 ° C.
- Placera en värmedyna i kulturen huva och slå på den.
- Ta ut 24-väl cellodlingsplatta och den förvärmda PFA ur kuvösen och placera den på toppen av värmedyna.
- Använd en hand för att aspirera mediet från en brunn, och omedelbart efter att använda den andra handen för att försiktigt glida 500 l PFA i brunnen genom väl kanten. För enklare aspiration, luta odlingsplatta vid ca 45 °, lutar det mot frigolit stativet så att det är stabilt vid den vinkeln. Detta kommer att underlätta strävan och lägga PFA lösning på bra utan att störa cellerna i kulturen. Detta är den mest avgörande steg för att bevara den ursprungliga cellstrukturen hos cellaktiviteter.
- Upprepa processen tills alla brunnar med glasskiva har fått PFA. OBS: alla åtgärder som måste förändra befintlig lösning från brunnen kommer att tillämpa samma aspirationsförfaranden.
- Placera plattan i 37 ° C under 5 min. Ta tallriken tillbaka till kultur huven och luta mot frigolit som beskrivs i steg 2,5. Använd en hand för att försiktigt överföra PFA från brunnen in i en uppsamlingsröret; använda den andra handen för att omedelbart efteråt placera åtminstone 500 | il rumstemperatur PBS i brunnen. Efter att alla brunnar har tvättats, tillbaka och upprepa PBS tvätt en gång i varje väl. Töm insamlade PFA i en farlig avfallsbehållare.
- Förbered ICC blockerande buffert genom att tillsätta 2% fetalt bovint serum till PBS. 0,04% natriumazid (utspädd från 20% stamlösning) tillsätts som konserveringsmedel. VARNING: natriumazid är en giftig substans. Bufferten kan förvaras i 4 ° C under en lång tidsperiod utan att bakteriell kontamination.
- Med odlingsplattan fortfarande lutad mot en monter, en gång gå igenom varje brunn aspire ta bort PBS och omedelbart efteråt tillsätta 500 l av ICC blockeringsbuffert. Cellerna är nu redo för immunofluorescensfärgning. Vid behov kanfixerade celler kan lagras i en 4 ° C kylskåp i en vecka utan väsentlig förlust av TM4SF1 protein.
3. TM4SF1 immunofluorescensfärgning av Nanopodia
- I varje brunn, byt ut 500 l ICC blockerande buffert med en ny blockeringsbuffert innehållande 0,01% Triton X-100 och låt det sitta i rumstemperatur i 1 timme. Använd inte högre än 0,03% Triton X-100 som det kommer att ta bort TM4SF1 från cellmembran. PBS tvättade celler från steg 2,10 direkt kan flyttas till den blockerande buffert innehållande Triton om färgningen är klar att startas direkt.
- Späd primära anti TM4SF1 (eller anti-CD9) antikropp till 0,5 pg / ml i ICC blockeringsbuffert.
- I varje brunn, ta bort Triton bufferten ICC/0.01% och ersätta den med 300 l av den anti-TM4SF1-antikroppslösningen. Inkubera 2 timmar vid rumstemperatur eller lämna över natt vid 4 ° C.
- Tvätta varje brunn med inte mindre än 500 l PBS. Upprepa 3x; varje gång ger på least 5 min av inkubationstiden.
- Bered en sekundär antikropp och falloidin lösning i ICC blockerande buffert, med användning av en 1000 gångers utspädning av Alexa 488 märkt åsna-anti-mus sekundär antikropp (2 ^ g / ml slutlig koncentration) och 1000 x utspädning av falloidin (50 ng / ml slutlig koncentration).
- Ta bort PBS och tillsätt 300 l av den sekundära antikroppen och phalloidin lösning till varje brunn och inkubera i 2 timmar eller låt stå över natten vid 4 ° C.
- Upprepa PBS tvättsteg med minst en 5 min inkubation per tvätt. Under den sista tvättningen, lämna varje brunn i PBS under 1 timme.
- Släpp en droppe (~ 10 l) av anti-fade montering media på en glasplatta.
- Böj spetsen på en 19 G 1 ½ i sprutnål 90 ° genom att trycka lätt på en hård yta. Använd en hand för att hålla böjda nålen och försiktigt lyfta upp en glasskiva från brunnen, och använd den andra handen för att ta tag i skivan med hjälp av vassa pincett.
- Vrid glasskivan &# 160; sidan nedåt låta cellsidan kontakt monteringsmedia på objektglaset. Placera försiktigt glasskivan och låt den torka över natten på en mörk plats i rumstemperatur.
- Gå vidare till bilden av immunofluorescens färgade nanopodia, eller lagra bilder i ett bildspel box vid -20 ° C. Bilderna kommer att vara synlig under några månader i -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För Steg 1:
Om celler (såsom HUVEC och PC3 används i denna studie) kan växa normalt, kommer celler fästa på kollagenbelagda skivan inom 30 minuter efter att de är seedade, polarisera och bli mobila snart efteråt, och utöka nanopodia inför deras väg rörlighet. figurerna 1A och 1B visar respektive en polariserad och förökar HUVEC. Figur 2A visar polarise PC3-celler i ett mobilt tillstånd.
För Steg 2:
Med förvärmningsanordning av 4% PFA till 37 ° C, fixa celler vid 37 ° C under 20 min och varsam tvättning med rumstemperatur PBS, cellulära staterna bör väl bevarad. Generellt isolerad individ HUVEC (Figur 1A, 1) eller PC3 (Figur 2A)-celler kommer att visa en polariserad morfologi, såvida cellerna är i ett tillstånd av celldelning (Figur 1B, 1). Intercellulära interaktionervilket leder till cell korsningen bildning (Figur 1C, 1) är också vanligt förekommande. Nanopodia bör visas på cellens periferi, och F-aktin kommer ofta att vara närvarande i delar av nanopodia proximalt till cell. Kalla temperaturer orsakar F-aktin att dra tillbaka in i celler som lämnar bakom nanopodia membrankanalerna. Suboptimal temperatur, såsom visas i exemplen med användning av 4 ° C PFA fixering och kall PBS tvättning, kommer att störa och förstöra nanopodia struktur i polariserade celler (figur 1 A, 2), celler som förökar sig (Figur 1B, 2) och på konstgjord väg framställa öppningarna vid intercellulära förbindelser (Figur 1C, 2).
För Steg 3:
Många membranbundna proteiner inklusive TM4SF1 är mycket känsliga för Triton X-100 och kommer att tas bort från cellytan om koncentrationer som är högre än 0,03% används 2,3. För att bevara de flesta av cellytan TM4SF1, PFA fasta celler bör endast behandlas med 0,01% Triton X-100 innehåller blockerande buffert i en timme innan du byter till anti-TM4SF1 primär antikropp som har spätts ut i en vanlig blockerande buffert som inte innehåller Triton X-100. Eftersom nanopodia är tunna och långa membran prognoser och fäster matris genom TMED kommer TMED intensitet sannolikt behöver förbättras genom ljusstyrka och kontrast funktioner i bildbehandlingsprogram som Photoshop för att avslöja och spåra vägen för cellrörelse genom nanopodia rester (Figur 1, 2 inläggningar).
Figur 1. Nanopodia prognoser under endotelceller rörelse, celldelning, och korsningen bildning. HUVEC var nyligen odlade i 6 timmar after plätering vid 60% sammanflödet på kollagenbelagda glasskivan. Celler fixerades med användning av (1) den modifierade metoden där celler fixerades i 37 ° C 4% PFA direkt utan förtvätt i PBS och placerades i en 37 ° C inkubator under 20 min fixering tid, eller (2) en konventionell färgningsmetod där cellerna tvättades med rumstemperatur PBS två gånger och fixerades i 4% PFA under 20 minuter vid rumstemperatur. Nanopodia, tunna och långa membrantillägg som är markerade med en intermittent, bandad mönster av TMED (vita pilar) och som ofta omsluter falloidin-färgade F-aktin (rosa pilar) i portioner proximal till cellen, var immunofluorescens färgades med hjälp av anti-TM4SF1 Ab. Tre representativa HUVEC bilder fångades att visa utseendet på nanopodia under (A) polarisation, (B) celldelning, och (C) inter korsning bildning. Insatslådor visa större förstoring nanopodia. Under polariserad (A) eller retracted cellulära stater (B, C), var nanopodia prognoser bevaras genom att direkt fastställa celler i 37 ° C PFA, medan de strukturer som till stor del bort genom tvättning och fastställande av cellerna i rumstemperatur PBS och PFA. (C) 37 ° C PFA fixering bevarar intercellulära förbindelser (blå pilar), medan korsningar störs av kallare temperaturer som orsakar celler att dra, att skapa en klyfta mellan celler överbryggas genom nanopodia varav de flesta innehåller F-aktin (rosa pilar) och en del inte (vita pilar) Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Nanopodia demonstrera riktningen PC3 tumörcellrörelse. (A)PC3 tumörceller var nyligen odlats under 6 timmar efter plätering vid 60% sammanflödet på kollagenbelagda glasskivan. Celler fixerades direkt i 37 ° C 4% PFA och placerades i en 37 ° C inkubator i 20 min för att bevara nanopodia. Nanopodia (vita pilar) och F-aktin (rosa pilar) var immunofluorescens färgades med hjälp av anti-TM4SF1 Ab och phalloidin, respektive. Den infällda rutan visar nanopodia vid högre förstoring. Denna representativ bild visar att TM4SF1 uttryck i PC3-celler är heterogen; en PC3 cell med stark TM4SF1 färgning (gul pil) producerade långa nanopodia och är omgiven av två svagt TM4SF1-färgade PC3-celler (röda pilar). Nanopodia rester vid bakkanten (ib) anger riktningen för PC3 cellrörelse under 6 tim cellodlingsperioden. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Visualisering av nanopodia genom tetraspanin CD9. (A) HUVEC var nyligen odlade i 6 timmar efter plätering vid 60% sammanflytning på en kollagenbelagd glasskivan. Cellerna fixerades i 37 ° C 4% PFA och nanopodia (vita pilar) avslöjades genom anti-CD9 Ab. F-aktin (rosa pilar) var färgade med hjälp phalloidin. Denna representativ bild visar att CD9 lokaliserar också nanopodia. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopodia är tunna cellmembrankanaler som stadigt fäster matris genom TMED och kan sträcka sig mer än 100 nm från en polariserad mobil cell för att känna av omgivningen och förmedla intercellulära interaktioner 2,3. Nanopodia vidhäfta till matris så fast att rester lämnas kvar som cellen rör sig bort (fig. 1 och 2). Nanopodia tillåter alltså att vi kan studera hur celler känner av sin omgivning och bestämma vägen för cellrörelse, och hur förändringar genuttryck eller läkemedelsbehandling rörelse. Men på grund av den bräckliga dessa tunna (um bredd 100-300) membranstrukturer, måste försiktighet vidtas för att bevara dem.
För att troget spela cellulära aktiviteter utan att störa nanopodia, samt att studera hur experimentella förhållanden påverkar nanopodia aktiviteter och vägen för cellrörelse, bör man först kontrollera att celler växer effektivt i komplett medium före pursuing experimentet. Normala friska primära endotelceller, såsom HUVEC, i färskt EGM2-MV komplett odlingsmedium normalt kommer att dela ungefär var 18 timmar under deras log tillväxtfas inom sex passager av deras kultur. Man bör undvika att använda HUVEC som är större än passage-6 som högre passagenummer kommer att leda till ett ökat antal åldrande eller binukleära celler i kultur 7 och kommer att påverka cellernas förmåga att polarisera och producera nanopodia 2. PC3 prostatatumörceller är mer stabila till kulturer (opublicerad observation), men man bör ändå undvika att använda celler mer än tio passager från deras avlägsnande från fryst tillstånd.
Friska vidhäftande celler normalt fäster kollagenbelagda skivor inom de första 30 min efter att de är seedade, följde snart därefter genom cell polarisering. Således bör man förvänta sig att se de flesta endotelceller i ett polariserat tillstånd i slutet av den första timmen av inkubation. Om ettMajoriteten av endotelceller inte fäster på glasytan, så kolla om (a) kollagen har passerat sitt utgångsdatum, (b) trypsinization under cellskörd var för stränga, eller (c) celler är ohälsosamt. PC3-celler polariserar långsammare än endotelceller, men bör visa en polariserad morfologi inom 2 timmar efter sådd. Om kontaminering sker i kultur, sedan undersöka om glasskivor eller pincett var ordentligt steriliserad. Alternativt kan man överväga att använda kammare diabilder; det protokoll som beskrivs här tyder på att användningen av glasskivor i 24-brunnars odlingsplattor för att spara kostnader och att lättare kunna hantera ett stort antal prover.
Konventionella immunfärgning metoder, användning av PBS för att tvätta celler innan du lägger rumstemperatur fixativ, lätt störa fina cellulära strukturer som nanopodia och kommer att förstöra dem under färgningsprocessen. Detta beror till stor del på att de fysiska påfrestningar som temperatursvängningar under cell fixatipå eller rigorösa PBS-tvätt under färgningsprocessen är de främsta orsakerna till fragmentering eller borttagning av nanopodial strukturer. Med tre enkla metodologiska förändringar - (i) inte stör cell polarisering tillstånd genom tvättning med PBS före fixering, (ii) fixera celler direkt i 37 ° C förvärmd PFA och inkubera cellerna vid 37 ° C under fixering, och (ii) försiktigt tvätta celler i rumstemperatur PBS - nanopodia är till stor del bevarade Figur 1 visar hur PFA och PBS temperaturer påverka bevarandet av nanopodia i odlade endotelceller, fig. 2A visar att TM4SF1 uttryck är heterogen i PC3-celler, och att cellerna med den starkaste TM4SF1 färgning visas längst. nanopodia. Temperaturen har visats påverka F-aktin aktiviteter och tubulin integritet 8,9. Således fastställande celler vid samma temperatur där cellerna odlades (det är 37 ° C i det protokoll som beskrivs här) är sannolikt att bättre bevara den polariserade cellulära staten (
PFA är inte det enda reagens som används vid fixering; organiska lösningsmedel såsom metanol, etanol och aceton används också ofta i cellfixering för immunofärgning 10.Den bästa fixativ är ofta bestäms av epitopen lokaliseringen av en specifik antikropp som används vid färgning (opublicerade data). För mus-anti-human-TM4SF1 antikropp som känner igen extracellulära domänerna av den TM4SF1 (Millipore, användes i denna studie), är PFA den enda fixativ som avslöjar TMED i immun-färgning, vilket indikerar att andra organiska lösningsmedel förstör epitopen. Däremot kaninantihumant TM4SF1 polyklonal antikropp från Acris (data visas ej), vars epitop är belägen i arton aminosyror nära den N-terminala regionen, fungerar också med etanol fixerade celler. Däremot har den Acris antikropp inte ge bra TM4SF1 färgning, antagligen eftersom den N-terminala epitopen är upptagen av TM4SF1 interaktioner med cytosolisk molekyl (er) som delvis täcker den epitopen.
Triton X-100 är ett icke-joniskt ytaktivt medel och används ofta i immun-färgning i syfte att permeabilisering cellmembran och minska ytspänningen hos vattenlösningar 11,12. However, denna förmåga ger också risken för att solubilisera membranproteiner. TM4SF1 är helt bort från cellytan av Triton X-100 högre koncentrationer än 0,05% 2,3. Av denna anledning är endast en 1-tim behandling med 0,01% Triton X-100 före tillsats av den primära antikroppen som används i den här beskrivna metoden. Denna behandling permeabilizes membranet tillräckligt för att göra det möjligt för peri-nukleär TM4SF1 vara väl bedömas av de antikroppar, samtidigt som man bevarar de flesta TM4SF1 på cellmembranet. För dubbel färgning av TM4SF1 med proteiner som finns i kärnan, använder 0,03% Triton X-100 i förinkuberingen stadiet om 0,01% Triton inte fungerar. Detta kommer att underlätta Triton X-100 punktering av det nukleära membranet.
TM4SF1 är mycket specifika för endotelceller och tumörceller; flesta andra celltyper antingen inte uttrycka TM4SF1 eller uttrycka den på en mycket låg nivå 2,3. Men klassiska tetraspanins - en familj som omfattar trettiotre medlemmar including CD9, CD81 och CD151 - är ubiquitously uttryckt 6, och återfinns också i membrandomäner i nanopodia 2,3 (figur 3A). Således kan färgnings klassiska tetraspanins genom samma immun-färgningsmetoden används till TM4SF1 möjliggöra studier av nanopodia i celltyper som inte uttrycker TM4SF1. PC3 tumörceller som uttrycker TM4SF1 tenderar mycket att röra sig kontinuerligt i en riktning, medan PC3-celler som svagt uttrycker TM4SF1 inte har en tydlig rörelseriktning (Figur 2A och opublicerade data). TM4SF1 uttrycksnivå i tumörceller är känd för att vara korrelerade med deras metastaspotential 13, och utredningar pågår länkning tumörcellernas förmåga att uttrycka TM4SF1 och producera nanopodia till sin metastatisk potential.
Sammanfattningsvis behärskning av effektiva metoder för färgning nanopodia gör utredarna att spåra vägen för cellrörelse genom nanopodia residues, studera hur celler känner av sin omgivning för rörelse, hur cellrörelse modifieras genom förändring av uttrycksnivåer av gener (antingen överuttryck eller knockdown av gener av intresse). Nanopodia representera ett nytt verktyg för undersökning av cell polarisering och cellrörelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi erkänner Dr Harold Dvorak för bra diskussioner bland annat förslaget att prova fixering i 37 ° C PFA. Detta arbete stöddes av NIH bidrag P01 CA92644 och genom ett avtal från Nationella stiftelsen för cancerforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E.
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
