Summary
Nanopodia тонкие, но хрупкие мембранные каналы, которые простираются до 100 мкм от переднего фронта или задней задней ячейки и чувств сотовой среды. Прямая фиксация при 37 ° С, нежной стирки, и избежания органических растворителей, таких как этанол, метанол или ацетон и более высоких концентраций Тритон Х-100, должны соблюдать эти клеточные структуры.
Abstract
Приверженец клетки в культуре поддерживать поляризованное состояние, чтобы поддержать движение и межклеточных взаимодействий. Nanopodia тонкие, удлиненные, в значительной степени F-актин-отрицательных мембранные выступы в эндотелиальных и раковых клеток, которые могут быть визуализированы с помощью TM4SF1 (Трансмембранное-4-L-шесть-семья-1) окрашивания иммунофлюоресценции. TM4SF1 кластеры в 100-300 диаметром мкм Tmed (ТМ 4SF1 е nriched микро D omains), содержащий от 3 до целых 14 отдельных TM4SF1 молекул. Tmed расположены прерывисто вдоль nanopodia на очередной интервал от 1 до 3 Tmed за μ м и прочно закрепить nanopodia в матрице. Это позволяет nanopodia расширить более 100 μ м от переднего фронта или задней задней поляризованных эндотелиальных или опухолевых клеток, и вызывает мембранные остатки, чтобы их оставили позади на MATRIX, когда клетка отходит. Tmed и nanopodia были упущены из-за их крайней хрупкости и чувствительности к температуре. Регулярное мытье и фиксация нарушают структуру. Nanopodia сохраняются путем непосредственного фиксации в параформальдегида (PFA) при 37 ° С с последующим короткой инкубации в 0,01% Triton X-100 перед окрашиванием. Nanopodia открыть новые перспективы в области клеточной биологии: они обещают, чтобы изменить наше понимание того, как клетки воспринимают окружающую их среду, обнаруживать и идентифицировать другие клетки на расстоянии, инициировать межклеточных взаимодействий в тесном контакте, и из сигнальных механизмов, участвующих в движении, пролиферации и клеточной -клеточные коммуникации. Методы, разработанные для изучения TM4SF1 производный nanopodia могут быть полезны для изучения nanopodia, которые образуют в других типах клеток посредством классических tetraspanins, в частности с повсеместно выражается CD9, CD81, CD151 и.
Introduction
Во время поляризации для движения, клетки животных расширить разнообразные динамические, мембранные выступы из их поверхности, в том числе филоподий, ламеллиподий, отвода волокон, и оборками 1. Недавно добавленные в этот список были nanopodia, недавно признанным тип тонкий (100-300 мкм в диаметре), удлиненные (длиной до 50-100 мкм) мембраны проекция, которые обеспечивают мембранные каналы для расширения F-актиновых структур, таких как филоподий и отвод волокна, и что пятно положительно с TM4SF1 (трансмембранного-4-L-шесть семьи-1) в культивируемых эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3.
TM4SF1 представляет собой белок с tetraspanin, как топологии, который был первоначально известен как антигеном опухолевых клеток 4 до открытия, что молекула эндотелиальных биомаркеров клеток, что играет существенную роль в пролиферации эндотелиальных клеток и миграции 2,3. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что TM4SF1 локализуется в perinucLear пузырьки и в плазматическую мембрану, и обогащен ТМ 4SF1 электронных nriched микро г omains (Tmed). Tmed якорь nanopodia к матрице и присутствует в регулярно расположенные Banded рисунком 1-3 длины Tmed / мкм из nanopodia. Nanopodia обычно простираются от переднего фронта клетки и конце задней течение поляризации клеток для движения. В связи с твердым приверженцем природы Tmed, nanopodia не в состоянии отказаться обратно в камеру, как она движется в сторону; брошенные остатки nanopodia таким образом проследить путь сотовой движения. Nanopodia обеспечить мембранные каналы для F-актина выдвижения и втягивания, и являются местами межклеточных взаимодействий и коммуникаций 2,3. Эти характеристики означают, что nanopodia предоставляют уникальную возможность для изучения механизмов, лежащих F-сборку актина во время клеточного поляризации, клеточном зондирования окружающей среды, определения пути и направления движения клеток и межклеточных взаимодействийй коммуникации.
В связи с высокой гидрофобной природы Tmed и тонкой и хрупкой мембранного природы nanopodia, особое внимание должно быть принято в целях сохранения Tmed и nanopodia. Разрушение nanopodia и удаления Tmed по распространенных методов лабораторных является возможная причина, почему только шестьдесят три публикации появились на TM4SF1 с момента своего первого открытия в 1986 1 и для полного незнания TM4SF1 обогащения в 100-300 мкм микродоменов на клеточной поверхности до доклада TM4SF1 в эндотелиальных клетках в 2009 году 2.
Обычные методы иммунным окрашиванием обычно используют органические растворители, как этанол, метанола, ацетона или исправить клетки и используют 0,1% или более высокую концентрацию Triton X-100 в проницаемыми клеткам 5. Исследования, описанные здесь реализуется три основных изменения с обычным способом выявить Tmed и nanopodia: (я) использовать 37 ° C 4% PFA и исправить клеток в 3776; C инкубатор, (II) нежный комнатной температуры стирки PBS, и (III) используют менее 0,03% Triton X-100 только кратко проницаемыми клетки перед добавлением первичного антитела, как Triton X-100 выше, чем 0,03% извлечет TM4SF1.
Все tetraspanins образуют микродомены на клеточной мембране 6 и некоторые локализуются с Tmed в эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3. Как tetraspanins как CD9, CD81, CD151 и экспрессируются повсеместно, протокол окрашивания описанный здесь, может быть продлен до многих различных типов клеток, которые не имеют TM4SF1 для исследований функции nanopodia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток на коллаген стекла с покрытием диска
- Место стеклянные диски (12 мм в диаметре) в стеклянной банке (4 унции) и автоклав для стерилизации диски.
- Положите 25 мл 70% этанола в 50 мл трубки Сокол и поместить его в капот культуре клеток. Это решение может быть повторно использован многократно, пока уровень раствора не падает до 20 мл.
- Поместите острые щипцы с дополнительной тонкой точке в 70% этанола в течение 5 мин перед использованием его для обработки стекла диск.
- Осторожно снимите щипцы из трубки и закройте крышку, затем аккуратно поместите этанола обрабатывают щипцами на верхней части трубки высохнуть на воздухе в течение 2 мин. Не допускайте, чтобы кончик пинцетом касаться чего-либо в капюшоне.
- Используйте стерильного пинцета, чтобы захватить один стерильный стеклянный диск из стеклянной банке и поместить его в лунку для культивирования клеток пластины 24-а. Повторяйте, пока желаемое количество скважин не была заселена с дисками.
- Поместите 500 мкл раствора бычьего коллагена (50 нг / мл) в каждую лунку, которая содержит стеклянную диск и поместить его в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора клеток культуры, по крайней мере 30 мин. Там нет никакого вреда в долгосрочной инкубации.
- Урожай HUVEC (Human эндотелиальных клеток пупочной вены) или PC3 предстательной железы (опухолевые клетки), которые уже были выращены в 150 мм клеточной культуральной пластины с помощью обработки трипсином и блокируют активность трипсина, используя его полной культуральной среде. Сбор клеток в 15 мл сокола трубки.
- Подсчитайте количество клеток и убедитесь, что жизнеспособность более 90%.
- Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалить супернатант.
- Используйте культуральной среды для разбавления клеток до 10 5 клеток / мл. Поместите клетки на льду.
- Аспирируйте коллагена в капот культуре клеток и осторожно поместить 500 мкл суспензии клеток в каждой лунке, в которой стекло диски были предварительно покрытый коллагеном. 5 х 10 4 клеток / лунку в 24-луночный планшет даст 60% конфluency для HUVEC и 30% слияния для клетках РС3. Примечание: добавить больше клеточной суспензии для более высокой плотности клеток.
- Культуры клеток в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в течение 1 часа, 2 часа, 4 часа, 6 часов, или 24 часов, чтобы отслеживать nanopodia деятельности и переход клеток. Как правило, клетки будут приложить к стеклянный диск в первые 30 мин, после чего можно будет поляризовать и мигрируют в течение первого часа, а также выполнять межклеточные взаимодействия и деление клеток в следующих часов.
2. Сотовый Фиксация
- Каждый хорошо понадобится 500 мкл 4% PFA (параформальдегида) для фиксации клеток. Либо коммерчески изготовлены или свежеприготовленные 4% PFA может быть использован. Рассчитать количество PFA, необходимое на основе количества скважин, приготовленных, и поместить PFA в 15 мл трубки сокола. ВНИМАНИЕ: параформальдегиде потенциальный канцероген.
- Положите трубки сокола в пенополистирола стенде, который был уже на месте в 37 ° C инкубаторе. Оставьте трубку в инкубаторе в течение 30 мин до войным до свободной зоны до 37 ° С.
- Поместите грелку в капот культуры и включите его.
- Выньте клеточной культуры пластину 24-а и нагретого PFA из инкубатора и разместить его на верхней части грелку.
- Одной рукой аспирации среды из скважины, и сразу же после использования другой рукой аккуратно сдвиньте 500 мкл PFA в колодец через а края. Для облегчения аспирации, наклонить культуральный планшет при температуре около 45 °, опираясь его против пенополистирола стенде так, что она стабильна под этим углом. Это будет способствовать стремление и добавления PFA решение колодца, не нарушая клетки в культуре. Это самый важный шаг, чтобы сохранить оригинальный клеточную структуру клеточных деятельности.
- Повторите процесс, пока все скважины с стеклянный диск не получили PFA. Примечание: все шаги, которые необходимо изменить уже существующие решения от колодца будет применять те же процедуры аспирации.
- Место пластины в 37 ° С в течение 5 мин. Возьмите тарелку обратно в капот культуры и наклона против пенополистирола как описано в шаге 2.5. Одной рукой осторожно перенести PFA из колодца в пробирку; использовать другую руку, чтобы сразу же после этого разместить по крайней мере, 500 мкл температуры в помещении PBS в скважине. После того как все колодцы были вымыты, вернуться и повторить промывку PBS еще раз в каждую лунку. Слейте собранную PFA в контейнер с опасными отходами.
- Подготовка блокирующий буфер ICC добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки в PBS. 0,04% азид натрия (разбавленный 20% от исходного раствора) добавляют в качестве консерванта. ВНИМАНИЕ: азид натрия является токсичным соединением. Буфер может быть сохранен в 4 ° С в течение длительного периода времени без бактериального заражения.
- С планшета для культуры еще наклоненной против подставке, еще раз перебирать каждую лунку аспирационных удалить PBS и сразу же после этого, добавив 500 мкл ICC блокировки буфера. Клетки готовы к иммунофлуоресцентного окрашивания. При необходимостификсированные клетки могут быть сохранены в 4 ° С холодильником в течение недели без значительной потери TM4SF1 белка.
3. TM4SF1 Иммунофлуоресценции Окрашивание Nanopodia
- В каждой лунке заменить 500 мкл ICC блокирующий буфер с новым блокирующем буфере, содержащем 0,01% Triton X-100 и оставьте при комнатной температуре в течение 1 часа. Не следует использовать выше, чем 0,03% Triton X-100, как это будет удалить TM4SF1 из клеточных мембран. PBS клетки промывали с шагом 2,10 может быть непосредственно перемещается в блокирующем буфере, содержащем Triton если окрашивание готов быть начата немедленно.
- Развести первичного анти-TM4SF1 (или анти-CD9) антитела с 0,5 мкг / мл в блокирующем буфере ICC.
- В каждую лунку, удалите ICC/0.01% Triton буфер и заменить его 300 мкл анти-TM4SF1-антител решения. Инкубировать 2 часа при комнатной температуре или оставить на ночь при 4 ° С.
- Вымойте каждую лунку с не менее 500 мкл PBS. Повторите 3 раза; каждый раз дают в леаст 5 мин времени инкубации.
- Подготовка вторичного антитела и фаллоидином решение в ICC блокирующем буфере, используя 1000 раз разведение в Alexa 488 помечены осел против мышиного вторичных антител (2 мкг / мл конечной концентрации) и 1000 х разбавление фаллоидином (50 нг / мл конечная концентрация).
- Удалить PBS и добавьте 300 мкл вторичного антитела и фаллоидином раствора в каждую лунку и инкубировать в течение 2 часов или оставить его на ночь при 4 ° C.
- Повторите промывание PBS с по крайней мере 5 мин инкубации в стирке. В последней промывки оставить каждую лунку PBS в течение 1 часа.
- Оставьте ни капли (~ 10 мкл) анти-выцветанию монтажа СМИ на предметное стекло.
- Согните кончик 19 G 1 ½ в иглу шприца 90 °, нажав аккуратно на твердую поверхность. Одной рукой удерживайте согнутых иглу и осторожно поднимите стеклянную диск из колодца, и использовать другую руку, чтобы схватить диск с помощью острых щипцов.
- Поверните стеклянный диск &# 160; лицом вниз позволяя боковую клеток контакт монтажа медиа на предметное стекло. Аккуратно поместите стеклянную диск и дайте ему высохнуть в течение ночи в темном месте при комнатной температуре.
- Перейдите к изображению иммунофлюоресценции окрашенных nanopodia или хранить слайды в режиме слайд-поле при температуре -20 ° С. Слайды останется просмотра в течение нескольких месяцев в -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для Шаг 1:
Если клетки (например, HUVEC и PC3 используемые в данном исследовании) способны нормально расти, клетки будут приложить к коллагена покрытием диска в течение 30 мин после того как они высевают, поляризовать и становятся подвижными вскоре, и расширить nanopodia впереди своего пути передвижения. фиг.1А и 1В соответственно показывает поляризованы и пролиферирующих HUVEC. Фиг.2А показывает поляризованных клетках РС3 в подвижном состоянии.
Для Шаг 2:
С prewarming 4% PFA до 37 ° С, фиксируя клетки при 37 ° С в течение 20 мин, и нежной промывки комнатной температуре PBS, клеточные государства должны быть хорошо сохранились. Как правило, изолированный индивидуальный HUVEC (рис. 1А, 1) или PC3 (2А) клетки покажет поляризованный морфологию, если клетки не находятся в состоянии деления клеток (фигура 1В, 1). Межклеточных взаимодействийприводит к образованию клеток соединительной (рис. 1в, 1) также обычно наблюдается. Nanopodia должен появиться на периферии клетки, и F-актин часто присутствовать в частях nanopodia, приближенную к клетке. Холодные температуры вызывают F-актин вытянуть обратно в клетки, оставляя позади nanopodia мембранных каналов. Субоптимальное температура, как показано на примерах с использованием 4 ° C PFA фиксацию и холодной PBS мытье, будет мешать и уничтожить структуру nanopodia в поляризованных клетках (рис. 1А, 2), пролиферирующие клетки (рис. 1Б, 2), и искусственно производить пробелы на межклеточных соединений (рис. 1C, 2).
Для шага 3:
Многие мембранных белков, включая TM4SF1 очень чувствительны к Triton X-100 и будет удален от поверхности клетки, если концентрации выше, чем 0,03% используются 2,3. Для того чтобы сохранить большую часть клеточной поверхности, P TM4SF1FA фиксированные клетки должны рассматриваться только с 0,01% Triton X-100, содержащий блокирующем буфере в течение часа перед изменением анти-TM4SF1 первичным антителом, которое было разбавленного в обычном блокирующем буфере, который не содержит Triton X-100. Как nanopodia тонкие и длинные прогнозы мембранные и приложить к матричным через Tmed, Tmed интенсивность, вероятно, должны быть повышена за счет яркости и контрастности функций в обработки изображений программное обеспечение, как Photoshop с целью выявления и отслеживания пути движения клетки через nanopodia остатков (рис. 1, 2 вставки).
Рисунок 1. Nanopodia прогнозы во время эндотелия клеточного движения, деление клеток и формирования перехода. HUVEC были недавно культивировали в течение 6 ч AfteR покрытие на 60% слияния на покрытые коллагеном стеклянный диск. Клетки фиксировали с помощью (1) модифицированный метод где клетки фиксировали в 37 ° С в 4% PFA непосредственно, без предварительной стирки в PBS, и помещают в инкубатор 37 ° C в течение времени фиксации 20 мин, либо (2) обычным способом окрашивания где клетки промывали PBS при комнатной температуре дважды, и фиксировали в 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре. Nanopodia, тонкие и длинные расширения мембранные, помеченные прерывистым, ленточной схеме Tmed (белые стрелки) и что часто заключите фаллоидином окрашенных F-актин (розовые стрелки) порциями проксимального к ячейке, были иммунофлюоресценции окрашивали анти-TM4SF1 Ab. Три представительные изображения HUVEC были захвачены, чтобы показать внешний вид nanopodia во время (А) поляризации, (б) деление клеток, и (с) формирование межклеточной соединительной. Врезка коробки показывают более высокие увеличениях nanopodia. Во поляризован (А) или retracteг сотовые государства (B, C), то nanopodia прогнозы были сохранены непосредственно фиксации клеток в 37 ° C PFA, в то время как структуры были в значительной степени удаляются промывкой и фиксации клеток в комнатной температуре PBS и PFA. (C) 37 ° C PFA фиксация сохраняет межклеточные (синие стрелки), в то время как переходы обеспокоены низких температурах, которые вызывают клетки, чтобы убрать, создавая зазор между клетками мостиком на nanopodia из которых наиболее содержать F-актин (розовые стрелки) и некоторые не (белые стрелки) Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Nanopodia демонстрируют направление движения PC3 опухолевых клеток. (A)Опухолевые клетки PC3 недавно культивировали в течение 6 ч после посева на 60% слияния на покрытые коллагеном стеклянный диск. Клетки фиксировали непосредственно в 37 ° C 4% PFA и помещают в инкубатор 37 ° C в течение 20 мин по сохранению nanopodia. Nanopodia (белые стрелки) и F-актин (розовые стрелки) были иммунофлюоресценции окрашивали анти-TM4SF1 Ab и фаллоидина соответственно. На вставке окно показывает nanopodia при большем увеличении. Этот представитель изображение показывает, что TM4SF1 выражение в клетках РС3 неоднородна; один PC3 клеток с сильным TM4SF1 окрашивания (желтая стрелка) производится длинный nanopodia и окружен двумя слабо TM4SF1 окрашенных PC3 клеток (красные стрелки). Nanopodia вычеты в задней кромке (IB) указывают направление движения PC3 клеток в период культивирования клеток 6 час. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Визуализация nanopodia через tetraspanin CD9. (A) HUVEC были недавно культивировали в течение 6 ч после посева на 60% слияния на стеклянной диске коллагена покрытием. Клетки фиксировали в 37 ° С 4% PFA и nanopodia (белые стрелки) были выявлены через анти-CD9 Ab. F-актин (розовые стрелки) окрашивали с использованием фаллоидина. Этот представитель изображение показывает, что CD9 также локализуется в nanopodia. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopodia тонкие клеточной мембраны каналы, которые прочно прикрепить к матрице через Tmed и может расширить более 100 мкм от поляризованного мобильного клетки ощутить окружающую среду и посредником межклеточные взаимодействия 2,3. Nanopodia придерживаться матрицы так прочно, что остатки остались позади, как клеточных уходит (рис. 1 и 2). Таким образом, Nanopodia позволяют нам изучить, как клетки воспринимают окружающую их среду и определить путь движения клетки, и как движение изменения экспрессии генов или наркотиков лечения. Однако из-за хрупкости этих тонких (100-300 ширина мкм) мембранных структур, осторожность должны быть приняты для того, чтобы сохранить их.
Для того, чтобы точно записать клеточную активность, не нарушая nanopodia, и для изучения, как экспериментальные условия влияют nanopodia деятельности и пути клеточного движения, в первую очередь следует убедиться, что клетки растут эффективно в полной среде до Pursuing эксперимент. Нормальные здоровые первичные эндотелиальные клетки, такие как HUVEC, в пресной EGM2-MV полной культуральной среде, как правило, делят примерно каждый 18 ч во время их журнала фазе роста в течение шести проходов их культуры. Следует избегать использования HUVEC, которые больше прохода-6, как более высокие номера прохождение приведет к росту числа стареющих или двуядерных клеток в культуре 7 и повлияет на способность клеток к поляризации и производить nanopodia 2. PC3 предстательной железы опухолевые клетки более устойчивы к культурам (неопубликованные наблюдения), но один все равно должны избегать использования клеток более десяти отрывки из их удаления из замороженного состояния.
Здоровые прилипшие клетки, как правило, придают дисков покрытые коллагеном в течение первых 30 мин после того как они высевают, а затем вскоре после этого по поляризации клеток. Таким образом, следует ожидать, чтобы увидеть большинство эндотелиальные клетки в поляризованном состоянии в конце первого часа инкубации. ЕслиБольшинство эндотелиальных клеток не следует присоединяться к поверхности стекла, а затем проверить, была ли (а) коллаген прошел срок годности, (б) трипсинизации во время сбора урожая клеток было слишком жестким, или (с) клетки являются нездоровыми. PC3 клетки поляризовать медленнее, чем эндотелиальных клеток, но должны продемонстрировать поляризованный морфологии в пределах 2 ч после посева. Если заражение происходит в культуре, затем изучить, были ли должным образом стерилизовать стеклянные диски или щипцы. Кроме того, можно рассмотреть возможность использования камеры слайды; Протокол, описанный здесь предполагает использование стеклянных дисков в культуре 24-луночных планшетах в целях экономии расходов и более легко обрабатывать большое количество образцов.
Традиционные методы Иммуноокрашивание, использование PBS, чтобы промыть клетки перед добавлением комнатной температуры фиксатором, легко нарушить тонкие клеточные структуры, как nanopodia и истреблю их во время процесса окрашивания. Во многом это связано с тем, что физические нагрузки, такие как колебания температуры во время клеточных fixatiили строгий PBS стиральная во время процесса окрашивания являются основными причинами фрагментации или удаления nanopodial структур. С трех простых методологических изменений - (I) не беспокоить состояние поляризации клеток путем промывки PBS до фиксации, (II) зафиксировать клетки непосредственно в 37 ° С в предварительно нагретой PFA и инкубировать клетки при 37 ° С в течение фиксации, и (II) осторожно мыть клетки в комнатной температуре PBS - nanopodia в значительной степени сохранились 1 показано, как PFA и PBS температура влияет сохранение nanopodia в культивируемых эндотелиальных клеток; 2А показывает, что выражение TM4SF1 неоднородна в клетках РС3 и что клетки с сильнейшей окрашивания TM4SF1 отображения самый длинный. nanopodia. Температура, как известно, влияют на F-актин деятельность и целостность тубулина 8,9. Таким образом фиксации клеток при той же температуре в которой были выращены клетки (это 37 ° C в протокол, описанный здесь), скорее всего, лучше сохранить поляризованный сотовой состояние (
PFA не только реагент, используемый в фиксации; органические растворители, такие как метанол, этанол, ацетон и также часто используются в фиксации клеток для иммунного окрашивания 10.Лучший фиксатор часто определяется расположением эпитопом специфического антитела, используемого в окрашивания (неопубликованные данные). Для мышиного антитела против человеческого TM4SF1 антителами, которые распознают внеклеточные домены в TM4SF1 (Millipore, используется в данном исследовании), PFA является единственным фиксатор, который показывает Tmed в иммунной окрашивания, указывая, что другие органические растворители уничтожить эпитоп. В отличие от этого, кролик анти-человеческий TM4SF1 поликлональное антитело с ACRIS (данные не показаны), чьи эпитоп расположен в восемнадцати аминокислот близ N-концевой области, работает также с этанолом фиксированных клеток. Тем не менее, антитела Acris не дает хорошую окрашивание TM4SF1, вероятно, потому что N-концевой эпитоп озаботились TM4SF1 взаимодействия с цитозольным молекулы (ов), который частично покрывают эпитоп.
Triton X-100 представляет собой неионное поверхностно-активное вещество и часто используется в иммунной окрашивания с целью permeabilizing клеточную мембрану и снижения поверхностного натяжения водных растворов 11,12. Howeveг, эта возможность также приносит риск растворения мембранных белков. TM4SF1 полностью удаляется из клеточной поверхности на Тритон Х-100 концентрациях выше 0,05% 2,3. По этой причине лечение только 1-час с 0,01% Triton X-100 перед добавлением первичного антитела используют в способе, описанном здесь. Это лечение permeabilizes мембрану достаточно для того, чтобы пери-ядерного TM4SF1 быть хорошо оценены антител, сохраняя наиболее TM4SF1 на клеточной мембране. Для двойного окрашивания TM4SF1 с белками, расположенных в ядре, используют 0,03% Triton X-100 на этапе предварительной инкубации при 0,01% Triton не работает. Это будет способствовать Triton X-100 прокалывания мембраны ядра.
TM4SF1 высоко специфичен для эндотелиальных клеток и опухолевых клеток; большинство других типов клеток либо не выражают TM4SF1 или выразить это на очень низком уровне 2,3. Тем не менее, классические tetraspanins - семейные, который охватывает тридцать три участника includinг CD9, CD81, CD151 и - экспрессируются повсеместно 6, а также могут быть найдены в мембранных доменов в nanopodia 2,3 (фиг.3А). Таким образом, окрашивание классические tetraspanins через тот же методом иммуно-окрашивания, используемой для TM4SF1 можно включить исследования nanopodia в типах клеток, которые не экспрессируют TM4SF1. Опухолевые PC3 клетки, которые экспрессируют TM4SF1 высоко имеют тенденцию двигаться непрерывно в одном направлении, в то время как PC3 клетки, которые слабо выражают TM4SF1 не имеют четко определенный направление движения (рис. 2A и неопубликованные данные). Уровень экспрессии TM4SF1 в опухолевых клетках, как известно, коррелирует с их метастатическим потенциалом 13, и исследования в настоящее время ведется способность опухолевых клеток связывание на выражение TM4SF1 и производить nanopodia их метастатическим потенциалом.
Таким образом, овладение эффективных методов окрашивания nanopodia позволяет следователям отслеживать путь движения клетки через nanopodia реsidues, изучить, как клетки воспринимают окружающую их среду для движения, как движение клетки модифицирован путем изменения уровней экспрессии генов (либо избыточной экспрессии или нокдаун интересующих генов). Nanopodia представляют новый инструмент для исследования поляризации клеток и клеточного движения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы признаем, Д-р Гарольд Дворжака за полезные обсуждения в том числе по предложению попробовать фиксацию в 37 ° C PFA. Эта работа была поддержана NIH грант P01 CA92644 и договором с Национальным фондом по исследованию рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E.
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
