Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nanopodia - رقيقة، غشاء التوقعات الهشة مع الأدوار في حركة التفاعلات بين الخلايا الخليوي و

Published: April 3, 2014 doi: 10.3791/51320
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Vascular Biology Research, Department of of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

Summary

Nanopodia قنوات غشاء رقيق ولكنها هشة التي تمتد ما يصل الى 100 ميكرون من قيادة الجبهة الخلفية أو زائدة الخلية والشعور البيئة الخلوية. ويلزم تثبيت مباشرة عند 37 درجة مئوية، وغسل لطيف، وتجنب المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، أو الأسيتون وارتفاع تريتون X-100 تركيزات مراعاة هذه الهياكل الخلوية.

Abstract

الخلايا الملتصقة في ثقافة الحفاظ على حالة الاستقطاب لدعم الحركة والتفاعلات بين الخلايا. Nanopodia هي رقيقة، ممدود، إلى حد كبير، F-الأكتين سلبية التوقعات في غشاء الخلايا البطانية والسرطان الذي يمكن تصور خلال TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) المناعي تلطيخ. مجموعات TM4SF1 في 100-300 ميكرون قطر TMED (TM 4SF1 ه nriched omains د الصغرى) التي تحتوي على 3 إلى ما يصل إلى 14 فرد TM4SF1 الجزيئات. يتم ترتيب TMED بشكل متقطع على طول nanopodia في تباعد العادية من 1-3 TMED في μ م وترسيخ nanopodia إلى المصفوفة. وهذا يتيح nanopodia تمديد أكثر من 100 μ م من قيادة الجبهة أو زائدة الجزء الخلفي من الخلايا البطانية أو ورم الاستقطاب، ويسبب بقايا الغشاء أن تترك وراءها على MATRالتاسع عندما يتحرك الخلية بعيدا. تم التغاضي TMED وnanopodia بسبب هشاشتها الشديدة والحساسية لدرجة الحرارة. غسل الروتينية وتعطيل تثبيت الهيكل. يتم الاحتفاظ Nanopodia من قبل التثبيت المباشر في بارافورمالدهيد (PFA) عند 37 درجة مئوية، تليها التعرض قصيرة إلى 0.01٪ تريتون X-100 قبل تلطيخ. Nanopodia فتح آفاقا جديدة في بيولوجيا الخلية: يعدون لإعادة تشكيل فهمنا لكيفية خلايا الشعور بيئتهم، كشف وتحديد الخلايا الأخرى على مسافة، والشروع في التفاعلات بين الخلايا في اتصال وثيق، وآليات الإشارات المشاركة في الحركة، والانتشار، والخلية الاتصالات الخلية. قد تكون الأساليب التي يتم تطويرها لدراسة nanopodia TM4SF1 المستمدة من المفيد للدراسات nanopodia التي تشكل في أنواع الخلايا الأخرى من خلال وكالة tetraspanins الكلاسيكية، ولا سيما CD9 أعرب بتواجد مطلق، CD81، وCD151.

Introduction

خلال الاستقطاب للحركة، والخلايا الحيوانية توسيع مجموعة متنوعة من الديناميكية، نتوءات غشاء من سطوحها، بما في ذلك أرجل كاذبة خيطية، أقدام صفاحية والألياف التراجع، والكشكشة 1. تمت إضافتها مؤخرا إلى هذه القائمة كانت nanopodia، وهو نوع المعترف بها حديثا رقيقة (100-300 ميكرون في القطر)، ممدود (50-100 ميكرون تصل إلى الطويل) الغشاء الذي الإسقاط توفير قنوات الغشاء لتمديد الهياكل F-الأكتين مثل أرجل كاذبة خيطية والألياف التراجع، وأنه وصمة عار بإيجابية مع TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) في البطانية والورم الخلايا المستزرعة 2،3.

TM4SF1 هو بروتين مع مثل tetraspanin طوبولوجيا التي كانت تعرف أصلا باعتبارها مستضد الخلايا السرطانية 4 قبل اكتشاف جزيء أن العلامات البيولوجية هو الخلايا البطانية التي تلعب دورا أساسيا في تكاثر الخلايا البطانية والهجرة 2،3. وكشف المناعي تلطيخ أن TM4SF1 المترجمة إلى perinucالحويصلات ولير لغشاء البلازما، ويتم تخصيبها في TM 4SF1 ه nriched omains د الدقيقة (TMED). TMED مرساة nanopodia إلى matrix والحاضر في نمط النطاقات متباعدة بصورة منتظمة من 1-3 طول TMED / ميكرون من nanopodia. Nanopodia تمتد عادة من الأمام مما يؤدي خلية وراء خلية الخلفية خلال الاستقطاب للحركة. نظرا لطبيعة ملتصقة شركة من TMED، nanopodia غير قادرين على التراجع مرة أخرى إلى الخلية وهو يتحرك بعيدا؛ وبالتالي التخلي عن بقايا nanopodia تتبع خارج مسار الحركة الخلوية. Nanopodia توفير قنوات لتمديد غشاء F-الأكتين والتراجع، والمواقع هي من التفاعلات بين الخلايا والاتصالات 2،3. هذه الخصائص يعني أن nanopodia توفير فرصة فريدة لدراسة الآليات الكامنة وراء التجمع F-الأكتين خلال الاستقطاب الخلوية، والاستشعار الخلوية للبيئة، وتحديد مسار واتجاه حركة الخلية، والتفاعلات بين الخلايا والثانية الاتصالات.

نظرا لطبيعة مسعور للغاية من TMED وطبيعة الغشائي رقيقة وهشة من nanopodia، يحتاج إلى رعاية خاصة التي يتعين اتخاذها من أجل الحفاظ على TMED وnanopodia. تدمير nanopodia وإزالة TMED بالطرق المختبرية الشائعة هي الأسباب المحتملة لماذا ظهرت المنشورات ثلاث وستين فقط على TM4SF1 منذ أول اكتشاف لها في عام 1986 1 والافتقار التام إلى معرفة تخصيب TM4SF1 في 100-300 ميكرون microdomains على سطح الخلية حتى تقرير TM4SF1 في الخلايا البطانية في عام 2009 2.

أساليب المناعية التقليدية عادة ما تستخدم المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، الأسيتون أو لإصلاح الخلايا واستخدام 0.1٪ أو أعلى تركيز تريتون X-100 لpermeabilize الخلايا 5. تنفيذ الدراسات وصفها هنا ثلاثة تغييرات كبيرة في الطريقة التقليدية للكشف عن TMED وnanopodia: (ط) استخدام 37 درجة مئوية 4٪ PFA وإصلاح الخلايا في 3776؛ مئوية الحاضنة، (ب) تطبيق لطيف درجة حرارة الغرفة PBS الغسيل، و (ج) استخدام أقل من 0.03٪ تريتون X-100 فقط لفترة وجيزة لpermeabilize الخلايا قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية، كما تريتون X-100 أعلى من 0.03٪ سيتم استخراج TM4SF1.

جميع tetraspanins تشكيل microdomains على غشاء الخلية 6 و بعض colocalize مع TMED في البطانية وخلايا الورم 2،3. كما يتم التعبير عن tetraspanins مثل CD9، CD81، وCD151 بتواجد مطلق، وبروتوكول تلطيخ الموصوفة هنا يمكن أن تمتد إلى العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تفتقر TM4SF1 للدراسات وظيفة nanopodia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الثقافة الخلية على الكولاجين المغلفة القرص زجاج

  1. الأقراص مكان الزجاج (12 مليمتر في القطر) في وعاء زجاجي (4 أوقية) والأوتوكلاف لتعقيم الأقراص.
  2. وضع 25 مل 70٪ من الإيثانول في أنبوب 50 مل الصقر ووضعه في غطاء ثقافة الخلية. هذا الحل يمكن إعادة استخدامها عدة مرات حتى مستوى الحل ينخفض ​​إلى 20 مل.
  3. وضع ملقط حاد مع نقطة غرامة اضافية في الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق قبل استخدامه للتعامل مع القرص الزجاج.
  4. إزالة بعناية ملقط من الأنبوب وأغلق الغطاء، ثم ضع برفق الإيثانول تعامل ملقط على رأس الأنبوب إلى الهواء الجاف لمدة 2 دقيقة. لا تسمح غيض من ملقط للمس أي شيء في غطاء محرك السيارة.
  5. استخدام ملقط معقم للاستيلاء على قرص واحد زجاجية معقمة للخروج من جرة الزجاج ووضعه في بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية. كرر حتى تم ملؤها العدد المطلوب من الآبار مع أقراص.
  6. وضع 500 ميكرولتر من محلول الكولاجين البقري (50 نانوغرام / مل) في كل بئر يحتوي على قرص من الزجاج ووضعه في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 خلية ثقافة حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ليس هناك ضرر في الحضانة لفترة أطول.
  7. الحصاد HUVEC (الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان) أو PC3 (الخلايا السرطانية في البروستاتا) التي كانت تزرع بالفعل في 150 ملم وحة الثقافة الخلية من خلال trypsinization ومنع النشاط التربسين باستخدام كاملة المتوسطة ثقافتها. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل الصقر.
  8. حساب عدد الخلايا والتأكد من جدوى أكبر من 90٪.
  9. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف.
  10. استخدام مستنبت لتمييع الخلايا إلى 10 5 خلية / مل. وضع الخلايا على الجليد.
  11. نضح الكولاجين في غطاء محرك السيارة خلية ثقافة ووضع بلطف 500 ميكرولتر من تعليق خلية إلى كل بئر التي تم precoated الأقراص الزجاج مع الكولاجين. سوف 5 × 10 4 خلايا / جيد في 24 لوحة جيدا تعطي 60٪ أسيوطluency لHUVEC و 30٪ confluency للخلايا PC3. ملاحظة: إضافة المزيد من تعليق خلية لأعلى كثافة الخلية.
  12. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 ساعة، 2 ساعة، 4 ساعة، 6 ساعة، أو 24 ساعة لتتبع أنشطة nanopodia ومرور الخلية. عادة، سوف الخلايا نعلق على القرص الزجاج في أول 30 دقيقة، ثم البدء في استقطاب وتهاجر في الساعة الأولى، وإجراء التفاعلات بين الخلايا وانقسام الخلايا في الساعات التالية.

2. تثبيت الخلية

  1. كل بئر ستحتاج 500 ميكرولتر PFA 4٪ (بارافورمالدهيد) لإصلاح الخلايا. إما تصنيعها تجاريا أو تقدم طازجة PFA 4٪ يمكن استخدامها. حساب كمية PFA اللازمة استنادا إلى عدد من الآبار على استعداد، ووضع منهاج العمل في أنبوب 15 مل الصقر. تنبيه: امتصاص العرق هو مادة مسرطنة مشتبه بهم.
  2. وضع أنبوب الصقر في موقف الستايروفوم التي كانت بالفعل في مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية. ترك الأنبوب في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إلى الحربم حتى PFA إلى 37 درجة مئوية.
  3. وضع وسادة التدفئة في غطاء محرك السيارة والثقافة، وتشغيله.
  4. إخراج 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية وPFA prewarmed للخروج من الحاضنة ووضعه على رأس وسادة التدفئة.
  5. استخدام يدا واحدة لنضح المتوسطة من بئر، وعلى الفور بعد استخدام اليد الأخرى إلى الشريحة بلطف 500 ميكرولتر PFA في البئر من خلال الحافة جيدا. لتسهيل الطموح، إمالة لوحة الثقافة في حوالي 45 درجة، يميل ضد موقف الستايروفوم بحيث أنها مستقرة في هذه الزاوية. وسوف يسهل هذا الطموح وإضافة PFA حل لالبئر من دون إزعاج الخلايا في الثقافة. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية للحفاظ على بنية الخلية الأصلية للأنشطة الخلية.
  6. كرر العملية حتى تلقوا جميع الآبار مع قرص الزجاج PFA. ملاحظة: ستكون جميع الخطوات التي تحتاج إلى تغيير الحل موجود مسبقا من البئر تطبيق إجراءات الطموح نفسه.
  7. وضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تأخذ اللوحة إلى غطاء محرك السيارة والثقافة، وإمالة ضد الستايروفوم كما هو موضح في الخطوة 2.5. استخدام يد واحدة لنقل بلطف PFA من البئر في أنبوب جمع؛ استخدام اليد الأخرى لوضع مباشرة بعد ذلك لا يقل عن 500 غرفة درجة الحرارة PBS ميكرولتر في البئر. بعد أن تم غسلها جميع الآبار، والعودة وتكرار الغسيل PBS مرة أخرى في كل جيدا. إفراغ PFA جمعها في وعاء النفايات الخطرة.
  8. إعداد عازلة تمنع المحكمة الجنائية الدولية بإضافة 2٪ مصل بقري جنيني لبرنامج تلفزيوني. يضاف 0.04٪ أزيد الصوديوم (20٪ من تمييع الحل الأسهم) كمادة حافظة. تنبيه: أزيد الصوديوم هو مركب سام. ويمكن تخزين المخزن المؤقت في 4 درجة مئوية لفترة طويلة من الزمن دون التلوث الجرثومي.
  9. مع لوحة الثقافة لا يزال يميل ضد موقف، مرة أخرى من خلال كل دورة الشفط جيدا لإزالة برنامج تلفزيوني ومباشرة بعد ذلك بإضافة 500 ميكرولتر من المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة. الخلايا هي الآن جاهزة للتلوين المناعي. إذا لزم الأمر، وخلايا ثابتة يمكن تخزينها في الثلاجة 4 ° C لمدة أسبوع دون خسارة كبيرة من البروتين TM4SF1.

3. TM4SF1 المناعي تلون Nanopodia

  1. في كل بئر، واستبدال العازلة حجب 500 ميكرولتر المحكمة الجنائية الدولية مع عازلة تمنع جديدة تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100 والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. لا تستخدم أعلى من 0.03٪ تريتون X-100 كما أنه سيتم إزالة TM4SF1 من أغشية الخلايا. PBS غسلها الخلايا من الخطوة 2.10 يمكن نقلها مباشرة إلى المخزن المؤقت حجب تحتوي على تريتون إذا كان على استعداد لتلطيخ أن تبدأ على الفور.
  2. تمييع الأساسية المضادة للTM4SF1 (أو المضادة للCD9) الأجسام المضادة إلى 0.5 ميكروغرام / مل في المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة.
  3. في كل بئر، وإزالة ICC/0.01٪ تريتون العازلة واستبدالها 300 ميكرولتر من الحل لمكافحة TM4SF1 الضد. احتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو ترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. غسل كل بئر مع ما لا يقل عن 500 ميكرولتر PBS. تكرار 3X؛ في كل مرة تعطي في LeAST 5 دقائق من الوقت الحضانة.
  5. إعداد الأجسام المضادة وphalloidin حل الثانوي في المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة، وذلك باستخدام 1،000 مرة التخفيف من اليكسا 488 المسمى حمار مكافحة فأر الضد الثانوية (2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) و 1،000 س التخفيف من phalloidin (50 نانوغرام / مل تركيز النهائي).
  6. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية وحل phalloidin إلى كل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة أو ترك الأمر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. تكرار PBS غسل الخطوات مع ما لا يقل عن 5 دقائق في الحضانة غسل. في غسل الماضي، وترك كل بئر في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة.
  8. إسقاط قطرة واحدة (~ 10 ميكرولتر) من مكافحة تتلاشى تصاعد وسائل الاعلام على شريحة زجاجية.
  9. منحنى غيض من 19 G 1 ½ حقنة في الإبرة 90 درجة عن طريق الضغط بلطف على سطح صلب. استخدام يد واحدة لعقد إبرة محني ورفع بلطف صعودا قرص الزجاج من البئر، واستخدام اليد الأخرى لفهم القرص باستخدام ملقط حادة.
  10. تحويل القرص الزجاج و# 160؛ وجهه لأسفل السماح للاتصال الجانب خلية الإعلام متزايدة على شريحة زجاجية. وضع بلطف قرص الزجاج واتركها تجف بين عشية وضحاها في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة.
  11. انتقل إلى صورة ملطخة nanopodia المناعي، أو تخزين الشرائح في مربع الشريحة في -20 درجة مئوية. ستبقى الشرائح للعرض لمدة بضعة أشهر في -20 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لخطوة 1:

إذا الخلايا (مثل HUVEC وPC3 المستخدمة في هذه الدراسة) هي قادرة على النمو بشكل طبيعي، وسوف نعلق على خلايا القرص المغلفة الكولاجين في غضون 30 دقيقة بعد هم المصنف، استقطاب وتصبح المحمول بعد ذلك بقليل، وتوسيع nanopodia قبل مسيرتهم الحركة. أرقام 1A و 1B يظهر على التوالي على الاستقطاب والانتشار HUVEC. الشكل 2A يظهر خلايا PC3 الاستقطاب في حالة المحمول.

لخطوة 2:

مع prewarming من PFA 4٪ إلى 37 درجة مئوية، وتحديد الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وغسل لطيف مع درجة حرارة الغرفة PBS، الدول الخلوية وينبغي الحفاظ عليها جيدا. عموما، معزولة الفردية (1A الشكل، 1) HUVEC أو PC3 (الشكل 2A) الخلايا سوف تظهر مورفولوجيا الاستقطاب، إلا إذا الخلايا هي في حالة انقسام الخلايا (الشكل 1B، 1). التفاعلات بين الخلايامما يؤدي إلى تشكيل تقاطع الخلية (الشكل 1C، 1) هي أيضا يلاحظ عموما. يجب أن تظهر Nanopodia على هامش الخلية، وسوف F-الأكتين غالبا ما تكون موجودة في أجزاء من الداني nanopodia إلى الخلية. درجات الحرارة الباردة تسبب F-الأكتين إلى التراجع مرة أخرى إلى الخلايا تاركا وراءه قنوات الغشاء nanopodia. درجة الحرارة دون المستوى الأمثل، كما هو مبين في الأمثلة باستخدام 4 ° C PFA التثبيت والغسيل PBS الباردة، سوف يزعج وتدمير البنية nanopodia في خلايا الاستقطاب (الشكل 1A، 2)، والخلايا المتكاثرة (الشكل 1B، 2)، وتنتج بشكل مصطنع الثغرات في تقاطعات بين الخلايا (الشكل 1C، 2).

لخطوة 3:

العديد من البروتينات غشاء محدد بما في ذلك TM4SF1 حساسة جدا لتريتون X-100 وسوف يتم إزالتها من سطح الخلية في حالة استخدام تركيزات أعلى من 0.03٪ 2،3. من أجل الحفاظ على معظم TM4SF1 سطح الخلية، Pينبغي أن يعامل الخلايا FA الثابتة فقط مع 0.01٪ تريتون X-100 التي تحتوي على عرقلة العازلة لمدة ساعة قبل تغيير إلى الأجسام المضادة لمكافحة TM4SF1 الأولية التي تم المخفف في عرقلة العازلة العادية التي لا تحتوي على تريتون X-100. كما nanopodia هي إسقاطات غشاء رقيق وطويل ونعلق على مصفوفة من خلال TMED، سوف تحتاج على الأرجح كثافة TMED إلى تعزيز من خلال وظائف السطوع والتباين في برامج معالجة الصور مثل فوتوشوب من أجل الكشف عن وتتبع مسار حركة الخلية من خلال بقايا nanopodia (الشكل 1، 2 إدراجات).

الشكل 1
الشكل 1. وكانت التوقعات HUVEC Nanopodia خلال حركة البطانية الخلية، وانقسام الخلايا، وتكوين تقاطع مثقف طازجة لمدة 6 ساعة بعد عملية الشراءص الطلاء بنسبة 60٪ على التقاء المغلفة الكولاجين القرص الزجاج. تم إصلاح الخلايا باستخدام (1) طريقة تعديل حيث تم إصلاح الخلايا في 37 درجة مئوية 4٪ PFA مباشرة دون prewashing في برنامج تلفزيوني، وتوضع في الحاضنة 37 درجة مئوية خلال فترة التثبيت 20 دقيقة، أو (2) طريقة تلوين التقليدية حيث تم غسلها الخلايا مع درجة حرارة الغرفة PBS مرتين والثابتة في PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Nanopodia، ملحقات غشاء رقيق وطويل التي تميزت متقطعة، ونمط النطاقات من TMED (السهام البيضاء) والتي غالبا ما أرفق ملطخة phalloidin F-الأكتين (السهام الوردي) في أجزاء الأقرب إلى الخلية، تم المناعي الملون استخدام الألغام المضادة للTM4SF1 من أساسها. تم القبض على ثلاث صور HUVEC ممثل لإظهار مظهر nanopodia خلال (A) الاستقطاب، (ب) انقسام الخلايا، و(C) تشكيل تقاطع بين الخلايا. تظهر مربعات أقحم تكبير أعلى من nanopodia. خلال الاستقطاب (A) أو retracteالدول الخلوية د (B، C)، والحفاظ على التوقعات nanopodia مباشرة عن طريق تحديد الخلايا في 37 درجة مئوية منهاج العمل، في حين تم إزالة الهياكل إلى حد كبير عن طريق الغسيل وتحديد الخلايا في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني ومنهاج العمل. (C) 37 ° C PFA تثبيت يحفظ تقاطعات بين الخلايا (الأسهم الزرقاء)، في حين نشعر بالانزعاج تقاطعات درجات الحرارة برودة التي تسبب خلايا التراجع، وخلق فجوة بين الخلايا سدها بواسطة nanopodia ومعظمها تحتوي على F-الأكتين (الأسهم وردي) وبعض لا (السهام البيضاء) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. Nanopodia تدليل على اتجاه حركة الخلايا السرطانية PC3. (A)الخلايا السرطانية PC3 تم زرعها حديثا لمدة 6 ساعة بعد الطلاء بنسبة 60٪ على التقاء المغلفة الكولاجين القرص الزجاج. تم إصلاح الخلايا مباشرة في 37 ° C 4٪ PFA وضعها في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للحفاظ على nanopodia. كانت Nanopodia (السهام البيضاء) وF-الأكتين (السهام الوردي) المناعي الملون استخدام الألغام المضادة للTM4SF1 أب وphalloidin، على التوالي. يظهر مربع أقحم nanopodia في أعلى التكبير. هذه الصورة تظهر الممثلة أن TM4SF1 التعبير في خلايا PC3 غير المتجانسة؛ خلية واحدة PC3 مع تلطيخ TM4SF1 قوية (السهم الأصفر) أنتجت nanopodia طويلة وتحيط به خليتين PC3 ضعيفة TM4SF1 الملون (الأسهم الحمراء). بقايا Nanopodia على حافة زائدة (IB) تشير إلى اتجاه حركة الخلية PC3 خلال الفترة خلية ثقافة 6 ساعة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3 الرقم 3. كان التصور من خلال nanopodia tetraspanin CD9. (A) HUVEC مثقف طازجة لمدة 6 ساعة بعد الطلاء بنسبة 60٪ confluency على قرص الزجاج المغلفة الكولاجين. تم إصلاح الخلايا في 37 درجة مئوية وقد كشفت PFA 4٪ وnanopodia (السهام البيضاء) من خلال مكافحة CD9 أب. كانت ملطخة F-الأكتين (السهام الوردي) باستخدام phalloidin. هذه الصورة تظهر الممثلة أن يموضع CD9 أيضا nanopodia. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanopodia قنوات رقيقة الغشاء الخلوي أن نعلق بحزم إلى matrix خلال TMED ويمكن أن تمتد أكثر من 100 ميكرون من خلية المحمول الاستقطاب لاستشعار البيئة والتفاعلات بين الخلايا توسط 2،3. Nanopodia التمسك مصفوفة بقوة حتى يتم ترك مخلفات وراء بينما يتحرك بعيدا الخلية (الشكلان 1 و 2). وبالتالي Nanopodia تسمح لنا لدراسة كيفية خلايا الشعور بيئتهم وتحديد مسار حركة الخلية، وكيفية حركة التغييرات التعبير الجيني أو المخدرات العلاج. ولكن نظرا لهشاشة هذه (100-300 ميكرون العرض) هياكل غشاء رقيق، يحتاج الحذر الواجب اتخاذها من أجل الحفاظ عليها.

من أجل تسجيل بإخلاص الأنشطة الخلوية من دون إزعاج nanopodia، ودراسة كيفية تأثير الظروف التجريبية الأنشطة nanopodia ومسار حركة الخلية، ينبغي للمرء أن تحقق الأولى التي تنمو الخلايا بشكل فعال في المتوسط ​​كاملة قبل إبرامهاuing التجربة. الخلايا الأولية صحية طبيعية البطانية، مثل HUVEC، في الطازجة EGM2-MV كاملة مستنبت وعادة ما تقسم تقريبا كل 18 ساعة خلال المرحلة سجل نموها في غضون ستة مقاطع من ثقافتهم. ينبغي للمرء تجنب استخدام HUVEC التي هي أكبر من مرور 6 كأرقام مرور العالي سيؤدي إلى زيادة في أعداد خلايا هرمة أو ثنائي النواة في الثقافة 7 وسوف تؤثر على قدرة الخلايا على استقطاب وإنتاج nanopodia 2. الخلايا السرطانية في البروستاتا PC3 هي أكثر استقرارا على الثقافات (المراقبة غير منشورة)، ولكن ينبغي للمرء أن لا تزال تجنب استخدام الخلايا أكثر من عشرة مقاطع من إزالتها من الدولة المجمدة.

الخلايا الملتصقة صحية سوف نعلق عادة على أقراص المغلفة الكولاجين في غضون ال 30 دقيقة الأولى بعد هم المصنف، وسرعان ما تبعه بعد ذلك من خلال الاستقطاب الخلية. وهكذا ينبغي للمرء أن نتوقع أن نرى معظم الخلايا البطانية في حالة الاستقطاب في نهاية الساعة الأولى من الحضانة. إذا كانالغالبية العظمى من الخلايا البطانية لا نعلق على سطح الزجاج، ثم تحقق ما إذا كان (أ) الكولاجين اجتاز تاريخ انتهاء صلاحيتها، (ب) كان trypsinization أثناء الحصاد خلية صارمة جدا، أو (ج) خلايا غير صحية. خلايا PC3 استقطاب أبطأ من الخلايا البطانية، ولكن يجب أن يبرهن على وجود مورفولوجيا الاستقطاب في غضون 2 ساعة بعد البذر. في حالة حدوث تلوث في الثقافة، ثم دراسة ما إذا كانت أقراص الزجاج أو ملقط تم تعقيمها بشكل صحيح. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن تنظر في استخدام الشرائح الغرفة؛ بروتوكول الموصوفة هنا يقترح استخدام الزجاج من الأقراص في لوحات الثقافة 24 أيضا من أجل توفير التكاليف والتعامل مع أكثر بسهولة عدد كبير من العينات.

أساليب المناعية التقليدية، واستخدام برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا قبل أن يضيف درجة حرارة الغرفة تثبيتي، بسهولة زعزعة الهياكل الخلوية الراقية مثل nanopodia ومهلكهم أثناء عملية التلوين. هذا يرجع إلى حد كبير إلى حقيقة أن الضغوط الجسدية، مثل التقلبات في درجات الحرارة خلال fixati الخليةأو صارمة الغسيل PBS أثناء عملية التلوين هي الأسباب الرئيسية للتجزئة أو إزالة الهياكل nanopodial. مع ثلاثة تغييرات منهجية بسيطة - (ط) لا تخل الخلايا الدولة الاستقطاب عن طريق الغسيل مع برنامج تلفزيوني قبل التثبيت، (ب) إصلاح الخلايا مباشرة في 37 ° C prewarmed PFA واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال التثبيت، و (ب) غسل بلطف الخلايا في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني - يتم الاحتفاظ إلى حد كبير nanopodia الشكل 1 يبين كيف تؤثر PFA وPBS درجات الحرارة الحفاظ على nanopodia في الخلايا البطانية مثقف؛ ويبين الشكل 2A أن TM4SF1 التعبير غير المتجانسة في خلايا PC3 وأن الخلايا مع أقوى TM4SF1 تلطيخ عرض أطول. nanopodia. ومن المعروف أن درجة الحرارة تؤثر على الأنشطة F-الأكتين وتويولين النزاهة 8،9. وبالتالي تحديد الخلايا في نفس درجة الحرارة التي كانت تزرع الخلايا (وهذا هو 37 درجة مئوية في بروتوكول الموصوفة هنا) هو المرجح للحفاظ على أفضل حالة الاستقطاب الخلوية ( 1B) وتقاطعات بين الخلايا (الشكل 1C)، والسماح تسجيل أكثر المؤمنين من الأنشطة الخلوية في الوقت الذي تتم إزالة الخلايا للدراسات التجريبية. خلافا على الجانب التراجع، والإسقاطات nanopodia في الجبهة الرائدة الخلية وقصيرة الأجل، في جزء منه لأن الخلايا تتحرك باستمرار وتجاوز nanopodia حافة الرائدة لأنها تتحرك إلى الأمام 2،3. وبالتالي فإن أفضل وقت لمراقبة nanopodia في الجبهة الرائدة ليس لفترة طويلة بعد ومطلي الخلايا، من الناحية المثالية في حوالي 30-60 دقيقة بعد البذر، وهو الوقت الذي قد تعلق الخلايا لمصفوفة ويست سوى بداية لبدء الحركة. التصوير الخلية الحية هو نهج بديل والتي تمكن بسجل دقيق للأنشطة nanopodia في الجبهة الرائدة.

PFA ليس كاشف الوحيدة المستخدمة في التثبيت؛ وكثيرا ما تستخدم أيضا المذيبات العضوية مثل الميثانول والإيثانول والأسيتون والتثبيت في الخلية المناعية لل10.وغالبا ما قرر أفضل تثبيتي من قبل موقع حاتمة من الأجسام المضادة المحددة المستخدمة في تلوين (بيانات غير منشورة). للفأر TM4SF1 مكافحة الأجسام المضادة البشرية التي تعترف المجالات خارج الخلية من TM4SF1 (ميليبور، وتستخدم في هذه الدراسة)، PFA هو مثبت الوحيد الذي يكشف TMED في المناعة تلطيخ، مشيرا إلى أن المذيبات العضوية الأخرى تدمير حاتمة. في المقابل، أرنب المضادة الإنسان TM4SF1 بولكلونل الأجسام المضادة من الاحتدادي (لا تظهر البيانات)، الذي يقع في ثمانية عشر من الأحماض الأمينية بالقرب من منطقة محطة N-حاتمة، ويعمل أيضا مع الخلايا الثابتة الايثانول. ومع ذلك، فإن الأجسام المضادة الاحتدادي لا تسفر جيدة TM4SF1 تلطيخ، ربما بسبب انشغال حاتمة N-محطة التفاعلات TM4SF1 مع جزيء عصاري خلوي (ق) التي تغطي جزئيا حاتمة.

تريتون X-100 هو بالسطح غير أيوني وغالبا ما تستخدم في المناعة تلطيخ بهدف permeabilizing غشاء الخلية وخفض التوتر السطحي للمحاليل المائية 11،12. Howeveص، وهذا أيضا القدرة يجلب مخاطر solubilizing البروتينات الغشاء. تتم إزالة TM4SF1 تماما من سطح الخلية بواسطة تريتون X-100 تركيزات أكبر من 0.05٪ 2،3. لهذا السبب، يستخدم فقط لعلاج 1 ساعة مع 0.01٪ تريتون X-100 قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية في الطريقة الموصوفة هنا. هذا العلاج permeabilizes الغشاء بما يكفي لتمكين TM4SF1 شبه النووية إلى تقييم جيد من قبل الأجسام المضادة، مع الحفاظ على معظم TM4SF1 على غشاء الخلية. لتلطيخ مزدوجة من TM4SF1 مع البروتينات الموجودة في نواة، استخدم 0.03٪ تريتون X-100 في مرحلة حضن مسبق إذا 0.01٪ تريتون لا يعمل. وسوف يسهل هذا تريتون X-100 تعطيب من الغشاء النووي.

TM4SF1 هي محددة للغاية إلى الخلايا البطانية وخلايا الورم؛ معظم أنواع الخلايا الأخرى إما لا تعبر عن TM4SF1 أو التعبير عن ذلك عند مستوى منخفض جدا 2،3. ومع ذلك، tetraspanins الكلاسيكية - عائلة التي تضم ثلاثة وثلاثين عضوا منها:ز CD9، CD81، وCD151 - يتم التعبير عن بتواجد مطلق 6، ويمكن أيضا أن تكون موجودة في الغشاء في المجالات nanopodia 2،3 (الشكل 3A). وبالتالي، تلطيخ tetraspanins الكلاسيكية من خلال نفس الطريقة المناعية تلطيخ تستخدم لTM4SF1 يمكن تمكين دراسات nanopodia في أنواع الخلايا التي لا تعبر عن TM4SF1. الخلايا السرطانية PC3 التي تعبر عن TM4SF1 تميل للغاية للتحرك باستمرار في اتجاه واحد، في حين أن خلايا PC3 التي تعبر عن TM4SF1 ضعيفة لا يوجد اتجاه واضح المعالم من حركة (الشكل 2A وبيانات غير منشورة). ومن المعروف TM4SF1 مستوى التعبير في الخلايا السرطانية لتكون مرتبطة مع النقيلي بهم المحتملين 13، والتحقيقات جارية حاليا قدرة الخلايا السرطانية ربط 'للتعبير عن TM4SF1 وإنتاج nanopodia إمكاناتهم النقيلي.

في ملخص، والتمكن من أساليب فعالة لتلطيخ nanopodia تمكن المحققين لتتبع مسار حركة الخلية من خلال إعادة nanopodiasidues، دراسة كيفية خلايا الشعور بيئتهم للحركة، وكيف يتم تعديل الحركة الخلية عن طريق تغيير مستويات التعبير عن الجينات (إما من overexpression أو ضربة قاضية للجينات من الفائدة). Nanopodia تمثل أداة جديدة للتحقيق في الاستقطاب الخلية وحركة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نعترف الدكتور هارولد دفوراك لإجراء مناقشات مفيدة بما في ذلك الاقتراح في محاولة التثبيت في 37 ° C PFA. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح P01 CA92644 وبموجب عقد من المؤسسة الوطنية لأبحاث السرطان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass disks Fisher Scientific 12-545-82 12 mm diameter
Glass jar Fisher Scientific 02-912-310 Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide Fisher Scientific 12-544-1 Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube BD Falcon 352070 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack Corning 430790 Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps Fisher Scientific 13-812-42 Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate BD Bioscience 353047 24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate BD Bioscience 353025 150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle BD Bioscience 309635 19 G 1 ½
Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2701 Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution BD Bioscience 354249 Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA Cellgro 25-053-CI 0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM Life Technologies 11965-092 DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS Affymetrix 75889 5 LT PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde) Affymetrix 19943 1 LT 4% in PBS
FBS Sigma-Aldrich F4135-500ML Fetal Bovine Serum
EGM2-MV Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Triton X-100
NaN3 Sigma-Aldrich S2002-25G Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody  Millipore MAB3127 Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody  BD Bioscience 555370 Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody Life Technologies A-21202 Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin Chemicon 90324 Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media  Life Technologies P-36931 ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol  17.5 ml of ethanol (200 proof)
7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml) 20 ml of 10x PBS
180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)  4 ml Triton X-100
16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml) 1 g of NaN3
25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) Stock solution of 50 μg/ml (50 ml)
830 μl of Collagen I (3 mg)
50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml) 49 ml PBS
2% FBS (add 1 ml)
0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) 50 ml of ICC Blocking Buffer
25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC  Lonza C2517A www.lonza.com
PC3 ATCC CRL-1435 www.atcc.org
Cell culture hood NuAIRE Nu-425-600 NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet 
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator  CellStar QWJ300DABA Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad  K&H Manufacturing 1020 K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge Sorvall T6000B Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629 Bright-Line Hemocytometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
  2. Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
  3. Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
  4. Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
  5. Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
  6. Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
  7. Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
  8. Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
  9. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
  10. Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
  11. Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
  12. Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
  13. Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).

Tags

علم الأحياء الخلوية، العدد 86، nanopodia، TM4SF1، الخلايا البطانية، الخلايا السرطانية، F-الأكتين، تلطيخ المناعي، tetraspanin
Nanopodia - رقيقة، غشاء التوقعات الهشة مع الأدوار في حركة التفاعلات بين الخلايا الخليوي و
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, C. I., Lau, C. Y., Li, D.,… More

Lin, C. I., Lau, C. Y., Li, D., Jaminet, S. C. Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions. J. Vis. Exp. (86), e51320, doi:10.3791/51320 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter