Summary
Nanopodia很瘦但很脆弱的膜通道，向上延伸至100微米的细胞的领先的前面或后面尾随和检测的细胞环境。直接固定在较高的Triton X-100浓度为37℃，轻柔洗涤，并避免如乙醇，甲醇，丙酮或有机溶剂，并须遵守这些细胞结构。
Abstract
贴壁培养细胞保持极化状态，支持移动和细胞间的相互作用。 Nanopodia是薄的，细长的，主要是丝状肌动蛋白阴性的内皮细胞和癌细胞膜突起，可以通过TM4SF1（跨膜-4-L-6家族-1）的免疫荧光染色进行可视化。 TM4SF1集群在100-300微米直径TMED（TM 4SF1Énriched微Ðomains）含有3到多达14个独立的TM4SF1分子。 TMED间歇地沿着nanopodia以1至3％μ米TMED并牢固地固定到nanopodia矩阵具有规则间距。这使得nanopodia从偏振内皮细胞或肿瘤细胞的前前或后后方延伸超过100μm，且使膜的残基上MATR被留下九时电池移开。 TMED和nanopodia被忽视了，因为他们的极端脆弱性和敏感性，以温度。常规洗涤和固定破坏的结构。 Nanopodia被直接固定在多聚甲醛（PFA）在37℃下保存，然后短暂暴露于0.01％的Triton X-100的染色之前。 Nanopodia在细胞生物学中打开新的局面：他们承诺将重塑我们的细胞如何感知他们的环境的认识，检测和识别其他细胞的距离，启动细胞间相互作用的密切联系，以及参与运动，增殖的信号传导机制，以及细胞细胞通讯。被用于研究TM4SF1衍生nanopodia开发的方法可以是用于通过经典四旋蛋白，特别是广泛表达CD9，CD81，和CD151的机构形成在其它类型的细胞nanopodia的研究是有用的。
Introduction
在极化运动，动物细胞延长了多种从它们的表面活力，细胞膜突起，其中包括丝状伪足，伪足，回缩纤维，和褶边1。最近加入到这个名单是nanopodia，一个新认识的类型的薄（100-300微米，直径），伸长（可达50〜100微米长）投影膜提供的膜通道的F-肌动蛋白的结构，如丝状伪足的延伸和回缩纤维，而且染色水平与TM4SF1（跨膜-4-L-6家族-1）中培养的内皮细胞和肿瘤细胞2,3。
TM4SF1是用四旋状的拓扑结构，最初被称为发现，即该分子是内皮细胞的生物标记物中起着内皮细胞增殖和迁移2,3必不可少的作用前的肿瘤细胞抗原4的蛋白质。免疫荧光染色发现TM4SF1被定位于perinuc利尔囊泡和到质膜，并富含TM 4SF1ënriched微ðomains（TMED）。 TMED锚nanopodia到矩阵和存在于nanopodia 1-3 TMED /微米长度的规则排列的条带状花纹。 Nanopodia通常是从一个细胞的前领先，并延长电池的极化为移动中尾随后面。由于TMED的牢固附着的性质，nanopodia无法缩回到细胞，因为它移动远离;弃nanopodia残基从而描绘出蜂窝移动路径。 Nanopodia提供的膜通道的F-肌动蛋白的扩展和回缩，且细胞间的相互作用和通信2,3的网站。这些特点意味着nanopodia提供研究细胞分化，对环境的感知细胞，测定细胞运动的路径和方向，和细胞间的相互作用过程中的F-肌动蛋白装配背后的机制一个独特的机会，一个ND通信。
由于TMED的高度疏水性质和nanopodia的薄和脆弱的膜性质，需要特别注意采取以保存TMED和nanopodia。 nanopodia和去除TMED由共同的实验室方法的破坏是一个可能的原因，只有63出版物自1986年1它的首次发现和完全缺乏TM4SF1富集在100-300微米微区上的知识出现在TM4SF1细胞表面，直到TM4SF1的内皮细胞在2009年2报告。
常规的免疫染色方法通常使用像乙醇，甲醇，丙酮或有机溶剂来修复细胞，并使用0.1％或更高的Triton X-100浓度通透细胞5。这里所描述的研究实现了三个重大变化，以常规方法揭示TMED和nanopodia：（i）使用37℃的4％PFA和修复细胞的3776，C培养箱，（ⅱ）申请温和室温下PBS中洗涤，并且（iii）使用低于0.03％的Triton X-100只简要地通透细胞除第一抗体之前，如曲通X-100 0.03％更高将提取TM4SF1。
所有四旋蛋白形成细胞膜上的6微区和在内皮细胞和肿瘤细胞中某些2,3共定位与TMED。如像CD9，CD81，和CD151四旋蛋白被广泛表达，在这里所描述的染色方案可以扩展到那些缺乏TM4SF1对nanopodia功能的研究很多不同的细胞类型。
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Protocol
1。胶原镀膜玻璃磁盘细胞培养
- 这里的玻璃盘（直径12毫米）在一个玻璃瓶（4盎司）和高压釜灭菌的光盘。
- 把25毫升70％乙醇在50毫升猎鹰管，并将其放置在细胞培养罩。此溶液可以重复使用多次，直至该溶液的液面下降至20ml。
- 用它来处理的玻璃盘前放置一个锋利的钳用极细点在70％乙醇5分钟。
- 小心取出钳出管，盖上，然后轻轻将乙醇处理钳在管顶空气干燥2分钟。不要让镊子尖在引擎盖碰任何东西。
- 用无菌镊子抢单无菌玻璃盘出来的玻璃瓶，并将其放置在24孔细胞培养板的孔中。重复，直到井所需数量已经填充了光盘。
- 把500微升的牛胶原蛋白溶液（50纳克/毫升）到每一个包含一个玻璃盘，并将其放置在37℃，5％CO 2的细胞培养箱中培养至少30分钟很好。有一个较长的潜伏期没有坏处。
- 收获HUVEC（人脐静脉内皮细胞）或PC3（前列腺肿瘤细胞）已经长大150 MM细胞培养板，通过胰蛋白酶消化并利用其完整的培养基阻止胰蛋白酶的活性。收集细胞入15ml Falcon管中。
- 计数细胞数量，并确保生存能力大于90％。
- 通过在200×g离心10分钟，离心在4℃下沉淀细胞除去上清液。
- 用培养基稀释细胞以10 5细胞/ ml。放置在冰上的细胞。
- 吸出胶原蛋白在细胞培养罩和轻轻地放在500μl的细胞悬浮液以每孔中，其中玻璃圆盘预先涂有胶原蛋白。 5×10 4个细胞/孔在24孔板会给60％置信luency的HUVEC和30％汇合为PC3细胞。注：添加更多的细胞悬液更高的细胞密度。
- 培养的细胞在37℃，5％CO 2培养箱中培养1小时，2小时，4小时，6小时，或24小时来跟踪nanopodia活动和细胞传代。通常情况下，细胞会附着在玻璃盘里的前30分钟，然后开始分化和迁移中的第一个小时，并在下列时间进行细胞间的相互作用和细胞分裂。
2。细胞固定
- 每个孔将需要500微升4％PFA（多聚甲醛）固定细胞。可商生产的或新鲜的4％PFA中都可以使用。计算需要的基础上制备的井的数量煤灰的量，然后将PFA中15毫升Falcon管中。注意：多聚甲醛是一种可疑的致癌物质。
- 把猎鹰管的聚苯乙烯泡沫塑料的立场，已经到位的37℃培养箱中培养。离开管在孵化器30分钟战m，最高的煤灰至37°C。
- 放置一个加热垫在培养罩并打开它。
- 取出24孔细胞培养板和所述预热的PFA出培养箱，并将其放置在所述加热垫的顶部。
- 用一只手来从井吸出培养基，紧接着用另一只手轻轻滑动，加入500μl的PFA入井通过井边缘。为了更方便地吸出，倾斜培养板在45°左右，倚靠在聚苯乙烯泡沫塑料的立场，使其稳定在那个角度。这将有利于愿望和添加PFA解决良好，没有文化干扰细胞。这是为了保持细胞活动的原来的细胞结构中最关键的步骤。
- 重复上述过程，直到所有的井用玻璃盘已经收到煤灰。注意：需要改变的还有预现有的解决方案中的所有步骤将适用同样的愿望手续。
- 将板在37℃下5分钟。 就拿板回文化引擎盖和倾斜对泡沫塑料按照步骤2.5中所述。用一只手从井里轻轻地转移到煤灰收集管;用另一只手来之后立即放置至少500μl的室温PBS中的井。之后所有的孔都被冲走，返回和在每一个重复的PBS洗涤一次好。清空收集的煤灰成为危险废物的容器。
- 通过加入2％胎牛血清的PBS来制备ICC封闭缓冲液。 0.04％的叠氮化钠（20％原液稀释）加入作为防腐剂。注意：叠氮化钠是一种有毒化合物。缓冲器可以存储在4℃的很长一段时间没有细菌污染。
- 随着文化板块仍偏向反对立场，再次循环通过每个孔抽吸去除PBS中，随即加入500微升的ICC封闭液。细胞现在已经准备好进行免疫荧光染色。如果需要的话，固定的细胞可以被存储在4℃的冰箱中一周不显著损失TM4SF1蛋白质。
3。 Nanopodia的TM4SF1免疫荧光染色
- 在各孔中，替换500μl的ICC封闭缓冲液与含有0.01％的Triton X-100的一种新的封闭缓冲液，并让它在室温下静置1小时。不要使用比0.03％的Triton X-100更高，因为它会从细胞膜中删除TM4SF1。 PBS洗涤细胞从步骤2.10，可直接移动到包含海卫一的封闭液，如果染色准备马上开始。
- 稀释初级抗TM4SF1（或抗CD9）抗体以0.5微克/毫升在ICC封闭缓冲液。
- 在每个孔中，取出ICC/0.01％的Triton缓冲液，并用300微升的反TM4SF1-抗体溶液替换。孵育2小时，在室温或离开过夜，在4°C。
- 每个不小于500微升PBS洗好。重复3次;每次给于乐AST 5分钟的孵育时间。
- 备中的第二抗体和鬼笔环肽溶液ICC封闭缓冲液中，用1000倍稀释的Alexa 488标记的驴抗小鼠二抗（2μg/ ml的终浓度）和1,000×稀释的鬼笔环肽（50纳克/毫升最终浓度）。
- 除去PBS中，并加入300微升的二级抗体和鬼笔环肽溶液的各孔中，孵育2小时或离开它过夜，在4°C。
- 重复PBS洗涤步骤与至少一个每次洗涤5分钟温育。在最后一次洗涤，每孔在PBS中1小时离开。
- 降防褪色安装媒体上的载玻片一滴（约10微升）。
- 弯曲的针头90°19 G 1½通过在坚硬的表面轻轻按压笔尖。用一只手握住弯曲的针，轻轻抬起玻璃盘从井里，并用另一只手用锋利的钳抓住光盘。
- 把玻璃盘＆＃160;面朝下让于载玻片上的细胞相接触的安装介质。轻轻地放在玻璃盘，让它在室温下暗处干通宵。
- 继续执行图像免疫荧光染色nanopodia，或存放在一个幻灯片框的幻灯片在-20°C。该幻灯片将在-20°C保持可见数个月
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Representative Results
对于第1步：
如果细胞（如内皮细胞，并在本研究中使用PC3）都能够正常生长，细胞会附着在30分钟内的胶原蛋白涂层的光盘后，他们是种子，分化，成为移动不久之后，排在他们的道路的延伸nanopodia运动。 图1A和1B分别显示了极化和脐静脉内皮细胞的增殖。 图2A显示极化PC3细胞在移动状态。
对第2步：
用4％PFA的prewarming至37℃，在37℃固定细胞20分钟，轻柔洗涤，用室温的PBS，细胞状态应该保存完好。一般情况下，孤立的个体HUVEC（ 图1A，1）或PC3（ 图2A）细胞将呈现两极化的形态，除非细胞是在细胞分裂的状态（ 图1B，1）。细胞间的相互作用导致细胞连接形成（ 图1C，1）也通常观察到的。 Nanopodia应该出现在小区外围，和F-肌动蛋白通常存在于nanopodia近端到细胞的部分。寒冷的气温导致F-肌动蛋白缩回到细胞中留下nanopodia膜通道。次优的温度，如使用4℃的PFA固定和冷PBS洗涤所示例子中，将干扰和在极性细胞破坏nanopodia结构（ 图1A，2），增殖细胞（ 图1B，2），并人为地产生间隙时间连接（ 图1C，2）。
第3步：
许多膜结合蛋白包括TM4SF1是对的Triton X-100非常敏感，并从细胞表面去除，如果浓度小于0.03％时用于2,3。为了维护大多数细胞表面TM4SF1，PFA固定的细胞只用0.01％的Triton X-100的含封闭缓冲液中一小时改变到已稀释在不包含的Triton X-100的常规封闭缓冲液抗TM4SF1初级抗体之前进行处理。由于nanopodia是细而长膜的预测，并连接到矩阵通过TMED，TMED强度将可能需要通过在Photoshop等图像处理软件的亮度和对比度的功能，以便通过nanopodia残留揭示和跟踪细胞运动的路径（ 图增强1，2 插图）。
图1。在内皮细胞运动，细胞分裂，并形成结Nanopodia预测。血管内皮细胞是新鲜培养6小时AFTEŘ电镀在60％汇合的胶原包被的玻璃圆盘。细胞用（1）式中的细胞PFA直接固定在37℃，4％，没有预洗的PBS中，并在20分钟的固定时间，或（2）常规染色方法置于37℃培养箱中修改后的方法固定当细胞用室温PBS洗两次，并固定在4％PFA中20分钟，在室温下进行。 Nanopodia，是由TMED的间歇，带状图案（白色箭头）标记，并且常常括鬼笔环肽染色的F-肌动蛋白（红色箭头），在近端部分向细胞细而长的膜扩展，使用抗TM4SF1进行免疫荧光染色抗体。三个有代表性的HUVEC图像被抓获显示nanopodia期间（A）极化，（B）细胞分裂，以及（C）间连接形成的外观。插图框显示nanopodia的更高的放大倍率。在极化（A）或retracte维元胞状态（B，C）中，nanopodia预测是在37℃的PFA直接固定细胞保存下来，而结构经洗涤除去大部分和固定细胞室温PBS和PFA。 （C）37℃PFA固定保留间连接（蓝色箭头），而结是由寒冷的气温导致细胞缩回不安，产生细胞nanopodia其中大多含有F-肌动蛋白（粉红色箭头）桥之间的差距和一些不（白色箭头） 点击此处查看大图。
图2。 Nanopodia展示PC3肿瘤细胞运动的方向（A）PC3肿瘤细胞在60％汇合的胶原包被的玻璃圆盘电镀后的新鲜培养6小时。细胞直接在37℃下4％PFA中固定，并置于37℃培养箱中培养20分钟，以保持nanopodia。 Nanopodia（白色箭头）和F-肌动蛋白（粉红色箭头）是利用免疫抗TM4SF1抗体和鬼笔环肽染色，分别。插图框显示在更高的放大倍率nanopodia。这代表图像显示，在PC3细胞TM4SF1表达是异类;具有较强的TM4SF1染色（黄色箭头）1 PC3细胞产生的长nanopodia，是由两个弱TM4SF1染PC3细胞（红色箭头）所包围。 Nanopodia残留在后缘（IB）表示PC3细胞运动过程中的6小时细胞培养周期的方向。 点击这里查看大图。
图3。可视化通过四旋CD9 nanopodia的（A）的HUVEC为新鲜培养6小时，在60％汇合的胶原包被的玻璃盘上电镀后。细胞固定在37℃，4％PFA和nanopodia（白色箭头）通过抗CD9抗体被揭露。用鬼笔环肽的F-肌动蛋白（粉红色箭头）染色。这代表图像显示，CD9也定位于nanopodia。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
Nanopodia薄细胞膜通道，牢牢附着基质通过TMED，可以从一个极化移动细胞感知环境并介导细胞间的相互作用2,3延伸超过100微米。 Nanopodia坚持以矩阵如此坚定地认为残留物留下的细胞移开（ 图1和图2）。 Nanopodia从而使我们能够研究细胞如何感知他们的环境，并确定细胞运动的路径，基因表达或药物治疗是如何变化的运动。然而，由于这些薄（100-300微米宽度）膜结构的脆弱性，需要谨慎采取以保护它们。
为了忠实地记录细胞的活动，而不会干扰nanopodia，并研究实验条件如何影响nanopodia活动和细胞运动的路径，应该先确认有效的细胞在完全培养基中PURS之前成长uing实验。正常健康的初级内皮细胞，如内皮细胞，在新鲜的EGM2-MV完全培养基通常会在生长的对数期在其培养的6通道划分，大约每18小时。每个人都应该避免使用的HUVEC中大于通道-6为高通道数会导致衰老或双核细胞培养7数量的增加，将影响细胞的极化，并产生nanopodia 2的能力。 PC3前列腺肿瘤细胞更稳定的文化（未发表的观察），但人们仍然应该避免使用细胞十余个通道从冷冻状态被解除职务。
健康的贴壁细胞通常会附加到第一个30分钟内胶原涂层的光盘后，他们是种子，随后不久之后通过细胞极化。因此，人们应该期望看到最内皮细胞的极化状态，在孵化的第一个小时结束。如果多数血管内皮细胞不附着在玻璃表面，然后检查（一）胶原蛋白是否已过了有效期，（二）细胞采集过程中的胰蛋白酶消化过于严格，或（c）细胞是不健康的。 PC3细胞分化比内皮细胞慢，但应在播种后2小时展示出一种极化形态。如果发生在文化污染，然后检查是否玻璃盘或镊子进行适当消毒。另外，可以考虑用玻片;这里所描述的协议表明，为了节省成本，并更容易地处理大量的样品在24孔培养板中使用玻璃盘。
常规的免疫染色的方法，使用的PBS加入室温固定液前清洗细胞，容易扰乱像nanopodia精细胞结构，并在染色过程中消灭他们。这主要是由于这一事实，即物理应力像温度波动在小区fixati上或严格的PBS洗涤过程中的染色工序是破碎或拆除nanopodial结构的主要根源。有三个简单方法变化 - （I）请勿打扰细胞极化状态被固定前用PBS洗涤，（二）直接在37℃修复细胞预热PFA和固定在细胞培养在37℃，及（ii）轻轻地洗细胞在室温下PBS - nanopodia在很大程度上保留图1所示的PFA及PBS的温度如何影响在培养的内皮细胞保存nanopodia的， 图2A示出了TM4SF1表达是异质PC3细胞和细胞具有最强TM4SF1染色显示最长。 nanopodia。温度是众所周知的影响的F-肌动蛋白的活性和微管蛋白的完整性8,9。在其中细胞生长相同的温度（这是37℃，在此描述的协议），从而固定细胞很可能能够更好地保持偏振态细胞（
PFA是不是在固定中使用的唯一的试剂;像甲醇，乙醇和丙酮的有机溶剂也经常使用在细胞固定为10免疫染色。最好的固定剂通常是通过在染色（未发表数据）中使用的特定抗体的表位的位置决定的。对小鼠抗人TM4SF1抗体，该抗体识别的TM4SF1（Millipore公司，在本研究中使用）的胞外结构域，PFA是揭示TMED在免疫染色的唯一的固定剂，这表明其它有机溶剂破坏的表位。与此相反，从ACRIS（数据未显示），其表位位于N末端区附近的18个氨基酸，兔抗人TM4SF1多克隆抗体工程也用乙醇固定细胞。然而，ACRIS抗体不产生良好的TM4SF1染色，可能是因为N-末端表位是通过与细胞内分子（次）TM4SF1相互作用而部分地覆盖的表位全神贯注。
的Triton X-100是一种非离子表面活性剂和通常用于免疫染色用透化细胞膜并降低水溶液11,12的表面张力的目的。 HoweveR，这种能力还使增溶的膜蛋白的风险。 TM4SF1完全从细胞表面的Triton X-100浓度大于0.05％的2,3除去。出于这个原因，用0.01％的Triton X-100加入第一抗体之前仅1小时的治疗是用在这里所描述的方法。这种治疗permeabilizes的足以使外周核TM4SF1得到很好的抗体进行评估，同时保留大部分TM4SF1细胞膜上的膜。对于TM4SF1的双重染色定位于细胞核内的蛋白质，用0.03％的Triton X-100在预孵育阶段，如果0.01％的Triton不起作用。这将有利于核膜的Triton X-100打孔。
TM4SF1是高度特异于内皮细胞和肿瘤细胞;大多数其他类型的细胞要么不表达TM4SF1或在一个非常低的水平2,3表达出来。然而，经典的四旋 - 一个家庭，涵盖33成员INCLUDIN克CD9，CD81，和CD151 -被广泛表达6，也可在膜结构域存在于nanopodia 2,3（ 图3A）。因此，通过用于TM4SF1相同的免疫染色法染色经典四旋蛋白可以使nanopodia的研究，在不表达TM4SF1的细胞类型。 PC3肿瘤细胞表达TM4SF1高度倾向于连续在单一方向上移动，而PC3细胞中弱表达TM4SF1没有一个明确界定的运动方向（ 图2A和未公布的数据）。在肿瘤细胞中TM4SF1表达水平已知与他们的转移潜力13相关联，并调查目前正在进行联肿瘤细胞的表达TM4SF1和产生nanopodia其转移潜能的能力。
总之，有效的方法进行染色nanopodia掌握使研究者通过nanopodia再追踪细胞的运动路径sidues，研究细胞如何感知他们的环境的运动，细胞如何运动是通过改变基因（或过度表达或感兴趣的基因的敲除）的表达水平的改变。 Nanopodia代表了细胞极化和细胞运动的研究一个新的工具。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们承认哈罗德·德沃夏克博士的有益讨论包括建议尽量固定在37℃煤灰。这项工作是由美国国立卫生研究院授予P01 CA92644和由国家癌症研究基金会的合同支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
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