Summary
Nanopodia 셀의 전면을 선행 또는 후행 후면에서 100 μM까지 확장하고 세포 환경을 감지 얇고 깨지기 쉬운 막 채널입니다. 37 ° C에서, 부드러운 세정, 에탄올, 메탄올, 아세톤과 같은 유기 용매의 방지에 높은 트리톤 X-100 농도의 직접 고정 이러한 세포 구조를 관찰해야합니다.
Abstract
문화에 부착 세포 이동 및 세포 간 상호 작용을 지원하기 위해 편광 상태를 유지한다. Nanopodia는, 얇은 긴, TM4SF1 (횡단-4-L-여섯 가족 1) 면역 형광 염색을 통해 시각화 할 수있는 내피 세포와 암 세포에서 주로 F-액틴 음성 막 전망이다. 100 ~ 300 μm의 직경 TMED에서 TM4SF1 클러스터 많은 14 개별 TM4SF1 분자에 3을 포함 (TM 4SF1 전자가 마이크로 D omains을 nriched). TMED는 1 μ의 m 당 TMED 3 단단히 행렬에 nanopodia 앵커의 일정한 간격으로 nanopodia 따라 간헐적으로 배치되어있다. 이 편광 내피 또는 종양 세포의 전면을 선행 또는 후행 후면에서 100 개 이상의 μ m를 확장 할 nanopodia을 가능하게하고, MATR에 남아 수 막 잔류의 원인이IX 세포가 멀리 이동하면. TMED 및 nanopodia 때문에 자신의 극단적 인 취약성 및 온도에 대한 민감도 간과되었다. 일상적인 세척 및 고정이 구조를 방해. Nanopodia는 염색 전에 0.01 % 트리톤 X-100에 대한 간단한 노출 한 후, 37 ° C에서 파라 포름 알데히드 (PFA)에 직접 고정하여 유지됩니다. 세포 생물학의 새로운 풍경을 열어 Nanopodia : 그들은 감지하고 거리에서 다른 세포를 식별, 가까운 접촉에서 세포 간 상호 작용을 시작하고, 운동 확산에 관련된 신호 전달 메커니즘, 세포가 자신의 환경을 감지하는 방법에 대한 우리의 이해를 바꿀, 세포 약속 세포 통신. TM4SF1 파생 nanopodia을 연구 개발하는 방법은 고전적인 tetraspanins, 특히 재하 표현 CD9, CD81, 및 CD151의 기관을 통해 다른 세포 유형에 형성 nanopodia의 연구에 유용 할 수 있습니다.
Introduction
운동을위한 편광 동안, 동물 세포는 filopodia, lamellipodia는 후퇴 섬유, 프릴 1 포함한 표면에서 동적, 막 돌기의 다양한 확장합니다. 최근이 목록에 추가 nanopodia, 얇은의 새로 인식 형 (직경 100 ~ 300 μm의), 같은 filopodia 같은 F-액틴 구조의 확장을위한 막 채널을 제공 연장 (최대 50 ~ 100 μm의 길이) 막 투영했다 과 후퇴 섬유, 그리고 얼룩 긍정적 TM4SF1 (횡단-4-L-여섯 가족 1) 배양 된 내피 세포와 종양 세포 2,3에와.
TM4SF1 원래 분자가 내피 세포의 증식과 이주 2,3에서 필수적인 역할을 내피 세포 바이오 마커이다 발견하기 전에 종양 세포 항원 4 알려진 tetraspanin 같은 토폴로지 단백질이다. 면역 형광 염색 TM4SF1가 perinuc하는 지역화 된 것으로 나타났다리어 소포와 세포막에, 그리고는 TM 4SF1 전자 nriched 마이크로 D omains (TMED)에 충실. TMED 앵커 매트릭스 nanopodia 및 nanopodia 1-3 TMED / μm의 길이의 정기적 간격 줄무늬 패턴에 존재. Nanopodia는 일반적으로 세포의 주요 전방에서 연장 운동을위한 세포 편광 동안 뒤 후행. 때문에 TMED의 회사 부착 특성으로 nanopodia는 멀리 이동할 때 셀에 다시 철회 할 수 없습니다; 버려진 nanopodia 잔기 따라서 셀룰러 이동 경로를 추적. F-액틴 확장과 후퇴 막 채널을 제공하고, 세포 간 상호 작용 및 통신 2,3의 사이트는 Nanopodia. 이러한 특성은 세포의 양극화, 환경의 휴대 감지, 세포 운동의 경로와 방향을 결정하고, 세포 간 상호 작용을하는 동안 F-액틴 어셈블리를 기본 메커니즘을 연구 할 수있는 독특한 기회를 제공 nanopodia 의미차 통신.
때문에 TMED의 소수성이 강한 성격과 nanopodia의 얇고 깨지기 쉬운 막 자연에 특별한주의는 TMED 및 nanopodia을 유지하기 위해 수행해야합니다. nanopodia 및 일반 실험실 방법으로 TMED 제거의 파괴는 예순셋 출판물은 1986 년에 처음 발견 이후와에 100 ~ 300 μm의 마이크로 도메인에서 TM4SF1 농축 지식의 완전한 부족 TM4SF1에 출연 한 이유 가능한 이유 세포 표면 2009/05/02에있는 내피 세포에서 TM4SF1의 보고서까지.
기존의 면역 염색 방법은 일반적으로 세포를 고정하고 세포에게 5 투과 0.1 % 이상 트리톤 X-100의 농도를 사용하는 에탄올, 메탄올, 아세톤과 같은 유기 용매를 사용합니다. (내가) 37 ° C 4 % PFA를 사용하고 37 세포를 수정 : 여기에 설명 된 연구는 TMED 및 nanopodia가 공개하는 종래의 방법으로 세 가지 주요 변경 사항을 구현76, C 인큐베이터, (II) 부드러운 실내 온도 PBS 세척을 적용, 그리고 (iii) 트리톤 X-100은 트리톤 X-100 0.03 %보다 높은 추출하므로, 일차 항체를 첨가하기 전에 세포를 투과하기 위해 잠깐 동안 만 0.03 % 이하를 사용 TM4SF1.
모든 tetraspanins는 세포막 06 마이크로 도메인을 형성하고 일부는 내피 세포 및 종양 세포에서 2,3 TMED로 colocalize. CD9, CD81, CD151과 같은 tetraspanins이 재하 표현되는 바와 같이, 여기에 기재된 염색 프로토콜 nanopodia 기능 연구에 TM4SF1 부족 많은 다른 세포 유형으로 확장 될 수있다.
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Protocol
1. 콜라겐 코팅 유리 디스크에 세포 배양
- 유리 항아리 (4온스) 및 디스크를 살균하는 오토 클레이브에 넣고 유리 디스크 (직경 12mm).
- 50 ML 팔콘 튜브에 25 ㎖의 70 % 에탄올을 넣고 세포 배양 후드에 배치합니다. 용액의 레벨이 20 ㎖로 떨어질 때까지이 솔루션은 여러 번 재사용 될 수있다.
- 유리 디스크를 처리 할 수 있도록 사용하기 전에 5 분 동안 70 % 에탄올에 엑스트라 파인 지점과 날카로운 집게를 놓습니다.
- 조심스럽게 튜브의 집게를 제거하고 뚜껑을 부드럽게 2 분 동안 건조한 공기 튜브의 상단에 에탄올 처리 집게를 배치합니다. 집게의 끝이 후드에 아무것도 만지지 않도록하십시오.
- 유리 항아리 하나 멸균 유리 디스크를 잡아 24 웰 세포 배양 접시의 우물에 배치하는 멸균 집게를 사용합니다. 우물의 원하는 번호가 디스크로 채워 될 때까지 반복합니다.
- 소 콜라겐 용액 500 μl를 (넣어50 NG / ML) 유리 디스크를 포함하고 적어도 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에 배치 각 웰에. 더 이상 배양에 해가 없습니다.
- 수확 HUVEC (사람의 제대 정맥 내피 세포) 또는 PC3 이미 트립신 통해 150mm 세포 배양 접시에서 성장 및 그 완전 배지를 사용하여 트립신 활성을 차단 하였다 (전립선 종양 세포). 15 ML 팔콘 튜브에 세포를 수집합니다.
- 세포 수를 계산하고 생존 능력이 90 % 이상 있는지 확인합니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛 뜨는을 제거합니다.
- 10 105 세포 / ㎖로 희석하여 세포 배양 배지를 사용한다. 얼음에 세포를 놓습니다.
- 세포 배양 후드에 콜라겐을 대기음 부드럽게 유리 디스크가 콜라겐 예비 코팅 된 잘 각각의 세포 현탁액 500 μl를 놓습니다. 24 - 웰 플레이트에 5 × 104 세포 / 웰의 60 %에게 컨퍼런스을 줄 것이다HUVEC과 PC3 세포에 대한 30 %의 포화 상태에 대한 luency. 참고 : 높은 세포 밀도에 대한 더 많은 세포 현탁액을 추가합니다.
- 문화 37 ° C, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 또는 nanopodia 활동과 세포 통로를 추적하는 24 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 세포. 전형적으로, 세포는 처음 30 분에 유리 디스크에 부착하고, 그 후에 편광 및 제 시간에 마이그레이션 시작하고, 다음 시간에 세포 간 상호 작용 및 세포 분열을 수행한다.
2. 셀 고정
- 각 웰은 세포를 해결하기 위해 500 ㎕의 4 % PFA (파라 포름 알데히드)가 필요합니다. 상업적으로 제조 또는 갓 4 % PFA 사용할 수 있습니다 만든 하나. 제조 웰의 수에 기초하여 필요한 PFA의 양을 계산하고, 15 ㎖의 팔콘 튜브에 PFA를 배치. 주의 : 파라 포름 알데히드는 발암 물질로 의심입니다.
- 37 ° C의 배양기에서 장소에 이미 스티로폼 스탠드 팔콘 튜브를 넣어. 전쟁 30 분 동안 인큐베이터에서 튜브 남기기37 ° C.에 PFA를 해요
- 문화 후드에 전기 패드를 배치하고 전원을 켜십시오.
- 24 웰 세포 배양 플레이트와 인큐베이터 밖으로 데워진 PFA를 꺼내 가열 패드에 올려 놓습니다.
- 우물에서 매체를 대기음 한 손을 사용 후 즉시 부드럽게 잘 가장자리를 통해 우물에 500 ㎕의 PFA를 슬라이드에 다른 손을 사용합니다. 쉽게 흡입의 경우, 그 각도에서 안정되도록 스티로폼 스탠드에 기대어, 약 45 ℃에서 배양 접시를 기울이십시오. 이는 흡입 및 배양 세포를 방해하지 않고, 우물 PFA 용액을 첨가를 촉진 할 것이다. 이것은 세포 활동의 일본어 셀룰러 구조를 보존하기 위해 가장 중요한 단계이다.
- 유리 디스크를 모두 우물 PFA를받을 때까지이 과정을 반복합니다. 참고 : 우물에서 기존 솔루션을 변경하는 데 필요한 모든 단계를 같은 포부 절차를 적용합니다.
- 5 분 동안 37 ° C에서 접시를 놓습니다. 다시 문화 후드에 접시를 가지고 단계 2.5에 설명 된대로 스티로폼에 기울이십시오. 부드럽게 수집 관으로 우물에서 PFA를 전송 한 손을 사용하여; 이후에 즉시 잘 적어도 500 ㎕의 방 온도 PBS를 배치 할 다른 손을 사용합니다. 모든 우물 세척 한 후, 돌아가서 잘 때마다 한 번 더 PBS 세척을 반복합니다. 유해 폐기물 용기에 수집 된 PFA를 비 웁니다.
- PBS로 2 % 소 태아 혈청을 추가하여 ICC 차단 버퍼를 준비합니다. 0.04 % 소듐 아 지드 (20 % 원액으로부터 희석) 방부제로서 첨가된다. 주의 : 아 지드 화 나트륨은 독성 화합물이다. 버퍼는 세균 오염없이 장기간 동안 39 ° C에서 저장 될 수있다.
- 여전히 서로 잘 PBS를 제거하는 흡입하고 그 후 즉시 ICC 차단 버퍼 500 μl를 추가하는 순환 다시 한 번, 스탠드를 기울이면 배양 접시. 세포는 이제 면역 형광 염색을위한 준비가되어 있습니다. 필요한 경우,고정 된 세포는 TM4SF1 단백질의 상당한 손실없이 일주일 동안 4 ° C의 냉장고에 저장 될 수 있습니다.
3. Nanopodia의 TM4SF1 면역 형광 염색법
- 각 웰에서 트리톤 X-100, 0.01 %를 함유하는 새로운 블로킹 완충액 500 μL의 ICC 블로킹 버퍼를 교체하고 실온에서 1 시간 동안 앉아 보자. 이 세포막에서 TM4SF1가 제거됩니다로 0.03 % 트리톤 X-100보다 더 높은 사용하지 마십시오. 염색은 바로 시작할 준비 경우 PBS 단계 2.10에서 세포를 세정 직접 트리톤을 함유하는 블로킹 버퍼에 이동 될 수있다.
- ICC 차단 버퍼에 0.5 ㎍ / ㎖의 1 차 항 TM4SF1 (또는 항-CD9) 항체를 희석.
- 각 웰에 ICC/0.01 % 트리톤 버퍼를 제거하고 방지 TM4SF1 - 항체 용액 300 μL로 교체합니다. 실온에서 2 시간을 품어 또는 4 ℃에서 하룻밤 남겨
- 더 적은 500보다 μL PBS로 각 잘 씻으십시오. 3 회 반복; 마다 르에 제공배양 시간의 AST 5 분.
- 에있는 이차 항체와 phalloidin도 솔루션을 준비 ICC 알렉사 488 표지 당나귀 항 마우스 이차 항체 (2 ㎍ / ㎖의 최종 농도)의 1000 배 희석 및 phalloidin도 1000 X 희석 (50 NG / ML 최종 농도)를 사용하여 버퍼를 차단.
- PBS를 제거하고 각 웰에 차 항체 및 phalloidin도 용액 300 μl를 추가하고 2 시간 동안 배양 또는 4 ℃에서 하룻밤 남겨
- 세척 당 적어도 5 분의 배양과 PBS 세척 단계를 반복합니다. 마지막 세척에서 1 시간 동안 PBS에서 잘 각을 둡니다.
- 유리 슬라이드에 방지 페이드 설치 미디어의 한 방울 (~ 10 μl를) 삭제합니다.
- 벤드 하드 표면에 부드럽게 눌러 주사기 바늘 90 °에서 19 G 1 ½의 끝. 굽은 바늘을 잡고 조심스럽게 우물에서 유리 디스크를 들어 올린 날카로운 집게를 사용하여 디스크를 파악하기 위해 다른 손을 사용하여 한 손을 사용합니다.
- 유리 디스크 및 회전# 160; 유리 슬라이드에 세포 측 콘택트 설치 미디어를주는 얼굴을 아래로. 부드럽게 유리 디스크를 배치하고 상온에서 어두운 곳에서 하룻밤 건조 할 수 있습니다.
- 이미지에 대한 면역 형광 염색 nanopodia를 진행, 또는 -20 ℃에서 슬라이드 상자에 슬라이드를 저장 슬라이드는 -20 ° C에서 몇 달 동안 볼 수 유지됩니다
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Representative Results
1 단계의 경우 :
(예 : HUVEC과 본 연구에서 사용 된 PC3 등) 세포가 정상적으로 성장 할 수있는 경우, 세포가 씨를 뿌린 후 30 분 안에 콜라겐 코팅 된 디스크에 부착 편광 곧 이후에 이동되고, 앞으로의 경로 nanopodia을 확장 할 것입니다 운동.도 1a 및도 1b는 각각 편광 및 증식 HUVEC.도 2a는 이동 상태에서 편광 PC3 세포를 도시 나타낸다.
2 단계의 경우 :
37 ° C에 4 % PFA의 prewarming으로, 20 분, 실온 PBS와 부드러운 세척 37 ° C에서 세포를 고정, 휴대 상태가 잘 보존되어야한다. 일반적으로, 격리 된 개별 HUVEC (도 1A는, 1) 또는 PC3 (도 2A) 세포는 세포가 세포 분열의 상태에 있지 않으면, 편광 형태를 보여준다 (도 1B의 1). 것 세포 간 상호 작용세포 접합 형성 (그림 1C, 1)로 이어지는 것은 또한 일반적으로 관찰된다. Nanopodia는 세포 주변에 표시해야하며, F-액틴은 종종 셀에 nanopodia의 인접 부분에 존재한다. 차가운 온도는 다시 nanopodia 막 채널을 뒤에 남겨두고 세포에 철회하는 F-액틴의 원인이됩니다. 차선의 온도가 4 ° C PFA 고정 차가운 PBS 세척을 사용하는 예와 같이, (그림 1A, 2), 증식 세포 (그림 1B, 2), 인공적으로 세포 간 접합부에 틈을 만들어 방해 편광 세포에서 nanopodia 구조를 파괴 할 것이다 (그림 1C, 2).
3 단계의 경우 :
TM4SF1를 포함한 많은 막 결합 단백질은 트리톤 X-100에 매우 민감 0.03 %보다 높은 농도가 2.3을 사용하는 경우 세포 표면에서 제거됩니다. 세포 표면 TM4SF1, P의 대부분을 보존하기 위해서는FA 고정 된 세포는 0.01 % 트리톤 X-100 트리톤 X-100을 포함하지 않는 정규 블로킹 완충액에 희석 한 항 - TM4SF1 차 항체로 변경하기 전에 시간 동안 차단 완충액 함유로 처리되어야한다. nanopodia 얇고 긴 막 전망하고 TMED을 통해 매트릭스에 따를 때, TMED 강도는 것 (그림 nanopodia 잔류을 통해 세포의 움직임의 경로를 공개하고 추적하기 위해 포토샵과 같은 이미지 처리 소프트웨어에서 밝기 및 대비 기능을 강화해야합니다 1, 2 인 세트).
그림 1. 내피 세포 이동, 세포 분열 및 접합 형성시 Nanopodia의 전망은. HUVEC은 6 시간의 afte 갓 배양R 콜라겐 코팅 유리 디스크에 60 %의 합류에 도금. 세포는 세포를 PBS 예비 세탁을하지 않고 직접 PFA 37 ° C의 4 %를 고정하고 20 분 고정 시간, 또는 (2) 기존의 염색법 동안 37 ° C 배양기에 넣고 (1) 수정 된 방법을 사용하여 고정했다 세포를 실온에서 20 분 동안 4 % PFA 두번 실온 PBS로 세척하고, 고정 된 곳. Nanopodia, TMED의 간헐적 인, 줄무늬 패턴 (흰색 화살표)로 표시하고 자주 셀에 인접 부분에 phalloidin도 염색 F-액틴 (분홍색 화살표)로 묶어야하는 가늘고 긴 막 확장은, 면역 방지 TM4SF1를 사용하여 염색 AB. 세 대표 HUVEC 이미지는 (A) 편광, (B) 세포 분열, 및 (C) 세포 간 접합 형성 동안 nanopodia의 모양을 보여주기 위하여 포착 하였다. 삽입 된 상자는 nanopodia의 높은 배율을 보여줍니다. 동안 (A) 또는 retracte 편광구조는 크게 세척에 의해 제거하고 실내 온도 PBS와 PFA에 세포를 고정 된 반면, D 세포의 상태 (B, C)는, nanopodia 예측은 직접 37 ° C PFA에 세포를 고정하여 보존 하였다. (C) 37 ° C PFA 고정 연결 장치는 세포가 수축하는 원인이 추운 온도에 의해 방해되는 반면 대부분의 F-액틴 (분홍색 화살표)를 포함하는의 nanopodia에 의해 연결된 세포 사이에 틈새를 만들어, 세포 간 접합 (파란색 화살표)을 보존하고 일부 (흰색 화살표)를하지 않는 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. PC3 종양 세포의 이동 방향을 보여 Nanopodia. (A)PC3 종양 세포 갓 콜라겐 - 코팅 유리 디스크에 60 % 합류에 도금 후 6 시간 동안 배양 하였다. 세포는 37 ° C 4 % PFA에 직접 고정 nanopodia을 유지하기 위해 20 분 동안 37 ° C 배양기에 배치했다. Nanopodia (흰색 화살표) 및 F-액틴 (분홍색 화살표)는 각각, 안티 TM4SF1 AB와 phalloidin 개를 사용하여 염색 면역했다. 삽입 된 상자가 더 높은 배율로 nanopodia을 보여줍니다. 이 대표 이미지 PC3 세포에서 TM4SF1 발현 이질적인 것을 보여줍니다; 강한 TM4SF1 염색 (노란색 화살표) 한 PC3 세포는 긴 nanopodia를 생산하고 두 약하게 TM4SF1 염색 PC3 세포 (빨간색 화살표)로 둘러싸여 있습니다. 트레일 링 에지에서 Nanopodia 잔류 물 (IB) 6 시간 세포 배양 기간 동안 PC3 세포 운동의 방향을 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. tetraspanin CD9 통해 nanopodia의 시각화. (A) HUVEC은 콜라겐 코팅 유리 디스크에 60 %의 포화 상태에서 도금 후 6 시간 동안 갓 배양 하였다. 세포는 37 ° C에서 4 % PFA 및 nanopodia (흰색 화살표)을 방지 CD9 AB를 통해 공개 된 수정되었습니다. F-액틴 (분홍색 화살표)가 phalloidin 개를 사용하여 염색 하였다. 이 대표 이미지 CD9도 nanopodia에 편재되어 있음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Nanopodia 단단히 TMED을 통해 매트릭스에 부착 환경을 감지하고 세포 간 상호 작용 2,3을 중재 할 수있는 편광 모바일 휴대에서 100 개 이상의 μM을 확장 할 수 있습니다 얇은 세포막 채널입니다. 그래서 제대로 잔기가 멀리 이동함에 따라 셀 남아 있는지 매트릭 밀착 Nanopodia (도 1 및 2). Nanopodia 따라서 우리는 세포가 자신의 환경을 감지하는 방법을 연구하고 세포의 이동 경로를 확인 할 수 있도록하고, 어떻게 유전자 발현이나 약물 치료의 변화의 움직임. 그러나, 이러한 얇은 (100-300 μm의 폭) 막 구조의 취약성에주의들을 유지하기 위해 수행 될 필요가있다.
충실 nanopodia을 방해하지 않고 세포 활동을 기록하고, 실험 조건은 nanopodia 활동과 세포의 움직임의 경로에 미치는 영향을 연구하기 위해, 하나는 최초의 세포가 PURS이 완료되기 전에 중간에서 효과적으로 성장하는지 확인해야합니다실험을 uing. 같은 HUVEC 정상적인 건강한 기본 내피 세포는 신선한 EGM2-MV 완전 배지에서 일반적으로 그들의 문화의 여섯 구절에서 성장의 자신의 로그 단계마다 약 18 시간을 나눌 것입니다. 하나는 더 높은 통과 번호가 문화 7 노화 또는 이핵 세포의 증가 숫자로 이어질 것입니다 및 편광 및 nanopodia 2를 생산하는 세포의 기능에 영향을 미치기 때문에 통로 6보다 큰 HUVEC의 사용을 피해야한다. PC3 전립선 종양 세포 배양 (게시되지 않은 관찰)에 더 안정적입니다, 그러나 사람은 여전히 얼어 붙은 상태에서 자신의 제거의 세포 열 개 이상의 통로의 사용을 피해야한다.
그들은 시드 된 후에 건강한 부착 세포는 일반적으로 첫 30 분 안에 콜라겐 코팅 된 디스크에 연결합니다, 세포 분극에 의해 곧 이후 하였다. 따라서 한 배양 제 시간의 끝에서 편광 상태의 대부분의 내피 세포를 볼 것으로 예상한다. 만약내피 세포의 대부분은, (a), 콜라겐은 그 유효 기한을 경과했는지 여부를 확인 후, 유리 표면에 부착하지 않는 (b) 세포 수확하는 동안 트립신도 엄격한되었거나, (c) 세포가 비정상이다. PC3 세포 내피 세포보다 느리게 극화하지만, 파종 후 2 시간 내에 편광 형태를 설명한다. 오염이 문화에서 발생하는 경우, 유리 디스크 또는 집게가 제대로 살균되었는지 여부를 검사합니다. 또한, 하나의 챔버 슬라이드를 사용하는 것을 고려 할 수있다; 여기에 설명 된 프로토콜은 비용을 절감하고보다 쉽게 많은 샘플을 처리하기 위해 24 - 웰 배양 플레이트에 유리 디스크의 사용을 제안한다.
기존의 면역 염색 방법, nanopodia 같은 미세한 세포 구조를 방해 쉽게 실내 온도 정착을 추가하기 전에 세포를 세척하고 염색 과정에서 그들을 파괴합니다 PBS의 사용. 이 사실에 크게 때문입니다 세포 fixati 동안 온도 변화와 같은 물리적 스트레스염색 과정이나 엄격한 PBS 세척시 분할 또는 nanopodial 구조의 제거의 주요 원인입니다. 세 가지 간단한 방법 론적 변화 - (i)는, 고정하기 전에 PBS로 세척하여 세포의 편광 상태를 방해하지 않습니다 (II) PFA를 데워진 37 ° C에서 직접 세포를 수정하고 고정하는 동안 37 ° C에서 세포를 배양하고, (ⅱ) 부드럽게 씻어 실내 온도 PBS에 세포 - nanopodia는 크게 보존 PFA 및 PBS 온도가 배양 된 내피 세포에 nanopodia의 보존에 미치는 영향을 1은 그림, 그림 2A는 TM4SF1 발현 PC3 세포에서 이기종이고 강한 TM4SF1 염색과 세포가 긴 표시 것을 보여줍니다. nanopodia. 온도는 F-액틴 활동 및 tubulin의 무결성 8,9에 영향을 미칠 것으로 알려져 있습니다. 따라서 ((이것은 여기에 설명 된 프로토콜에서 37 ° C이다) 세포 성장 것과 같은 온도에서 더 잘 편광 세포 상태를 유지 가능성이 세포를 고정한다
PFA는 고정에 사용되는 유일한 시약 아니다; 메탄올, 에탄올, 아세톤과 같은 유기 용매가 자주 10를 면역 염색을 위해 세포 고정에 사용됩니다.최선의 정착은 종종 염색 (게시되지 않은 데이터)에 사용되는 특정 항체의 항원의 위치에 의해 결정됩니다. TM4SF1의 세포 외 도메인을 인식하는 마우스 항 - 인간 TM4SF1 항체를 들어 밀리 포어 (Millipore,이 연구에서 사용을), PFA는 다른 유기 용제가 항원을 파괴하는 것을 나타내는 면역 염색에서 TMED을 알 수있는 유일한 정착입니다. 대조적으로, 에피토프 N-말단 영역 근처 십팔 아미노산에 위치한 Acris (데이터 미도시)로부터의 토끼 항 - 인간 TM4SF1 폴리 클로 날 항체는 에탄올 고정 된 세포로도 작동한다. 그러나, Acris 항체는 N-말단 에피토프가 부분적으로 에피토프를 포함 세포질 분자 (들)과 TM4SF1의 상호 작용에 의해 선점되어 있기 때문에 아마 좋은 TM4SF1 염색을 생성하지 않습니다.
트리톤 X-100 비 이온 계 계면 활성제이고 종종 세포막 permeabilizing 및 11,12 수용액의 표면 장력을 감소시키는 목적으로 면역 염색에 사용된다. HoweveR,이 기능은 막 단백질을 용해의 위험을 가져온다. TM4SF1 완전히 0.05 % 2,3보다 트리톤 X-100의 농도로 세포 표면으로부터 제거된다. 이 때문에, 일차 항체를 첨가하기 전에 0.01 % 트리톤 X-100 최저 1 시간 처리는 여기에 기재된 방법에서 사용된다. 이 치료는 세포막에 가장 TM4SF1을 유지하면서 잘 항체에 의해 평가되어야 요정 핵 TM4SF1 수 있도록 충분히 막을 permeabilizes. 0.01 %는 트리톤이 작동하지 않을 경우 핵에있는 단백질과 TM4SF1의 이중 염색의 경우, 예비 배양 단계에서 0.03 % 트리톤 X-100을 사용합니다. 이것은 핵 막 트리톤 X-100의 천공을 용이하게합니다.
TM4SF1는 내피 세포와 종양 세포에 대한 매우 구체적인입니다; 대부분의 다른 세포 유형은 TM4SF1을 표현하거나 매우 낮은 수준 2,3으로 표현하지 않는 하나. 그러나 고전 tetraspanins - 서른 세 멤버 INCLUDIN을 포함 가족G CD9, CD81, 및 CD151은 - 재하 6을 표현하고 있으며, 또한 nanopodia 2,3 (그림 3A)에서 막 도메인에서 찾을 수 있습니다. 따라서, TM4SF1에 사용 된 것과 같은 면역 염색 방법을 통해 클래식 tetraspanins를 염색하는 것은 TM4SF1을 표현하지 않는 세포 유형에 nanopodia의 연구를 활성화 할 수 있습니다. TM4SF1을 표현 PC3 종양 세포는 매우 약하게 TM4SF1을 표현 PC3 세포가 운동의 명확하게 정의 방향 (그림 2A 및 게시되지 않은 데이터)이없는 반면, 하나의 방향으로 계속 이동하는 경향이있다. 종양 세포에서 TM4SF1 발현 수준은 전이성 그들의 전위 (13)와 상관되는 것으로 알려져, 및 조사는 현재 TM4SF1을 표현하고 그들의 전이 잠재력 nanopodia을 생산 진행 링킹 종양 세포의 능력이다된다.
요약하면, 염색 nanopodia을위한 효과적인 방법의 숙달 nanopodia 다시 통해 세포의 움직임의 경로를 추적하는 조사를 수sidues, 세포는 세포의 움직임이 유전자 (과발현 또는 그 유전자의 최저 하나)의 발현 수준의 변화에 의해 수정하는 방법 운동에 대한 자신의 환경을 감지하는 방법을 연구한다. 세포 편광 세포의 움직임의 조사를위한 새로운 도구를 나타냅니다 Nanopodia.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 37 ° C PFA에 고정을 시도하는 제안을 포함하여 도움이 토론 박사 해롤드 드보락을 인정합니다. 이 작품은 NIH 보조금 P01의 CA92644에 의해 암 연구를위한 국립 재단의 계약에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
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| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
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| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
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| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
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| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
